Giáo trình chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên, chương 2 các phương pháp cô lập

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC HÓA THỰC VẬT Sau khi chiết xuất mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi bằng cô quay chân không ở nhiệt độ dưới 50 o C sẽ thu được cao trích. Với cao trích toàn phần này, người ta thường tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để có kết quả định tính trước khi dùng các kỹ thuật sắc ký để cô lập những hợp chất tinh khiết. I. KHẢO SÁT HOÁ THỰC VẬT Trong cây thường chứa những hợp chất tự nhiên như: steroid, alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, glycoside…Phương pháp phân tích sàng lọc cổ điển là phương pháp Stas- Otto. Nguyên tắc của phương pháp này là phân chia các hợp chất dựa vào độ hòa tan của chúng trong các dung môi có độ phân cực khác nhau: đối với các cây thuốc, nước ta thường sử dụng phương pháp phân tích của trường Đại học Dược khoa Rumani vì tính đơn giản, rẻ tiền và nhanh chóng. Tuy nhiên từ các kết quả phân tích sơ bộ này, người ta phải phối kiểm lại bằng các phương pháp phân tích khác để có kết luận chính xác hơn . Đôi khi người ta cũng tìm hiểu một số đặc điểm cao trích trước cũng như độ hòa tan trong dung môi, sự phân chia trong hai hệ dung môi không hòa tan vào nhau, đặc tính acid-baz, điện tích…. Tiến trình phân tích sơ bộ hoá thực vật được trình bày tổng quát ở sơ đồ dưới đây. FLAVONOID ACID BÉO ANTHRAGLYCOSID TINH DẦU PHYTOSTEROL CAROTENOID ALCALOID SAPONIN ANTHOCYANIN ĐƯỜNG ALCALOID ACID HỮU CƠ TANIN FLAVONOID ANTHRAGLYCOSID STEROID H/C URONIC TANIN ĐƯỜNG ALCALOID SAPONIN NGUYÊN LI ỆU Bã nguyên liệu Lớp kiềm Chiết bằng ether Chiết bằng cồn Bã nguyên liệu Dịch chiết cồn Bã nguyên liệu Dịch acid Mg/HCl đđ Vết trên giấy lọc +KOH 10% Cặn có mùi thơm Liebermann + H 2 SO 4 đđ TT Mayer, Bouchardat Dragendorff , Liebermann KOH, HCl TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na 2 CO 3 Na Acetat + FeCl 3 3% Mg/HCl đđ KOH 10% Liebermann Cồn cao độ FeCl 3 TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Tạo bọt Dịch cồn Lớp ether Dịch ether Dịch acid KOH 10% H 2 SO 4 10% H 2 SO 4 10% Dịch ether I.1. Xác định các chất tan trong dịch ether ethylic Cân 5g bột nguyên liệu cho vào bình nón nút mài 250ml, lắc với 30 ml ether ethylic trong 5 phút. Làm như vậy 3 lần cho tới khi dịch ether không còn màu. Tập trung dịch lọc trong một bình lắng gạn, lắc với 60ml KOH (20ml x 3 lần) sẽ tách ra 2 lớp: lớp kiềm và lớp ether. a. Phân tích dung dịch kiềm Dung dịch kiềm được cho vào becher và được trung hòa bằng HCl 25% để trung tính, lọc. Tủa trên phểu lọc hòa với 5ml cồn 90 o , chia làm 3 ống nghiệm. - Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10% nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có hợp chất ANTHRAGLYCOSID. - Ống 2: acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg kim loại, nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có FLAVONOID - Ống 3: nhỏ một giọt lên giấy lọc khô, hơ khô, nếu trên giấy lọc có vết mờ thì sơ bộ nhận định có ACID BÉO. b. Phân tích dung dịch ether Lớp dung dịch ether được rửa 3 lần với nước cất (20ml x 3 lần), sau đó lắc 3 lần với dung dịch H 2 SO 4 2% (5ml x 3 lần) Các dịch acid được góp lại để làm phản ứng định tính alcaloid với: - Thuốc thử Mayer: Tủa vàng nhạt. - Thuốc thử Dragendorff: Tủa Cam - Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu Dịch ether chia làm 3 phần cho vào 3 chén sứ, bốc hơi đến cạn - Chén 1: nếu có mùi thơm thì có TINH DẦU - Chén 2: nhỏ vài giọt H 2 SO 4 đđ, nếu có màu xanh thì có CAROTENOID - Chén 3: Hóa cắn với 10 giọt anhydrid acetic cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài giọt H 2 SO 4 đđ theo thành ống nghiệm. Nếu chổ giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ thì sơ bộ nhận định có hợp chất PHYTOSTEROL. I.2. Xác định các chất tan trong dịch cồn Bã nguyên liệu sau khi chiết bằng ether đem chiết nóng với cồn 90 o (30ml x 3 lần) trên bếp cách thủy, lọc. Tập trung dịch lọc vào bình nón, chia làm 6 phần.  Phần 1: Pha loãng dung dịch cồn với 4 thể tích nước cất, kiềm hóa bằng dung dịch NH 4 OH đđ, lọc: a. Tủa trên phểu hòa với 1 ml CHCl 3 , hứng vào ống nghiệm. Sau đó cho vào 1ml anhydrid acetic và nhỏ từ từ vài giọt H 2 SO 4 đđ. Nếu dung dịch có màu xanh thì có nhân STEROID. b. Dịch lọc được acid hóa bằng HCl, lọc. Tủa trên phểu hòa với 3-4 ml cồn 90 o chia làm 2 ống nghiệm - Ống 1: Cho vài giọt KOH, nếu có màu đỏ thì có hợp chất ANTHRAGLYCODID - Ống 2: cho vào ít bột Mg kim loại và vài giọt HCL nếu có màu đỏ thì có hợp chất FLAVONOID .  Phần thứ 2: Pha loãng dịch cồn với một thể tích nước cất rồi chia làm 2 phần: - Ống 1: Trung hòa với natri acetat, thêm vài giọt FeCl 3 2%, nếu có màu xanh đen thì có TANIN. - Ống 2: cho vào vài tinh thể Na 2 CO 3 , nếu có sủi bọt thì có acid hữu cơ.  Phần thứ 3: Dịch cồn được bóc hơi cách thủy trong chen sứ đến cạn, hòa cắn với 4-5 ml H 2 SO 4 2%, lọc. Chia dịch lọc ra làm 3 phần để làm phản ứng định tính alcaloid. - Ống 1: + thuốc thử Mayer. - Ống 2: + thuốc thử Dragendorff. - Ống 3: + thuốc thử Bouchardat.  Phần thứ 4: Bốc hơi dịch cồn trong chén sứ cho đến cạn, hòa cắn với 3ml nước cất đun nóng. Lọc, cho thêm vào nước lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ.  Phần thứ 5: Dịch cồn được pha loãng với một thể tích nước cất, chia làm 2 ống nghiệm: - Ống 1: acid hóa (màu đỏ) - Ống 2: Kiềm hóa (màu lục) Thì có ANTHOCYNANOSID  Phần thứ 6: Chia dịch cồn làm 2 phần, bóc hơi cách thủy trong chén sứ - Chén 1: hòa với 5 ml nước cất, lắc mạnh nếu có bọt thì có SAPONIN. - Chén 2: hòa vào chén 0,5 ml CHCl 3 và 0,5 ml anhydric acetic, cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ H 2 SO 4 đđ. + Có vòng tím thì có SAPONIN TRITERPEN. + Có vòng xanh lục thì có SAPONIN STEROID I.3. Xác dịnh các chất tan trong dịch acid Bã nguyên liệu sau khi chiết với cồn 90 o được chiết với H 2 SO 4 2% (20ml x 3 lần). Lọc, chia nước lọc ra làm 5 phần: - Phần 1: Lắc trong ống nghiệm, nếu có bọt bền thì có SAPONIN. - Phần 2: Kiềm hóa với NH 4 OH 10% , lắc với ether (5ml x 3 lần). Loại bỏ lớp nước, lớp ether lắc với H 2 SO 4 2%. Dịch acid được chia làm 3 phần để làm phản ứng tìm alcaloid (thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff). - Phần thứ 3: Cho tác dụng với thuốc thử Fehling, nếu có tủa đỏ gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ. - Phần 4: trung tính hóa với natri acetat, sau đó thêm vài giọt FeCl 3 10% , nếu có tủa xanh nâu thì có TANIN. - Phần 5: Pha dịch với 2 thể tích cồn 90 o , nếu có tủa nhiều thì có hợp chất URONIC. Bảng 2: Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao trích (trường hợp thí dụ) Cao trích bởi các dung môi Thuốc thử Phản ứng màu Hợp chất thiên nhiên Ether ethyl Ethanol 90% Acid 1% + + - KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycoside + - - Nhỏ lên giấy lọc Có vết ố màu Acid béo - + - Mg/HCl dung dịch Có vòng màu đỏ Flavonoid + - - Liebermann Có màu lục đỏ Phytosterol + - - H 2 SO 4 đđ Không màu Carotenoid - + + Mayer, Bouchardat, Hager, Dragendorff Có tủa màu Alcaloid - - Lắc mạnh dung dịch Không có bọt Saponin ++ + FeCl 5% Màu lục đen Tanin - +++ - Fehling Tủa màu đỏ gạch Đường khử II. TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC KỸ THUẬT KẾT TINH Kết quả cuối cùng của quá trình chiết tách, phân lập và tinh chế là phải thu được hợp chất sạch, thông thường dưới dạng tinh thể ngoài trừ những chất lỏng và chất vô định hình không thể kết tinh được . Quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hoà tan nóng và lọc, gạn tinh thể ra khỏi dung dịch mẹ và làm khô tinh thể. Trong các bước trên việc chọn dung môi thích hợp có tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh. I.1 Chọn dung môi Đối với các hợp chất đã biết, thường trong các tài liệu tham khảo đều có cho biết dung môi kết tinh và điểm chảy của nó. Đối với các chất chưa biết, phải chọn dung môi để kết tinh theo các qui tắc sau: - Một dung môi tốt để kết tinh một hợp chất khi nó hòa tan được nhiều hợp chất đó ở nhiệt độ sôi, và rất ít tan ở nhiệt độ thường. Một dung môi để kết tinh tốt thì độ hòa tan ở nhiệt độ sôi thường phải cao gấp 5 lần ở nhiệt độ thường. - Nếu không tìm được dung môi thích hợp thì phải phối hợp 2 dung môi. Trong 2 dung môi đó, phải có một dung môi có khả năng hòa tan nhiều hợp chất kết tinh ở nhiệt độ sôi và dung môi kia thì không hoặc ít hòa tan. Hai dung môi này phải hỗn hợp với nhau thành một dung dịch trong suốt và đồng nhất. - Thông thường một chất rắn dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hình học tương tự nó. Thí dụ ester dể hòa tan trong cồn hoặc ethyl acetat. Các hydrocarbon dễ hòa tan trong eter dầu hỏa, benzen, hexan. - Các chất có nhiều nhóm OH, các glycoside dễ tan trong các dung môi ưa nước như MeOH, EtOH và các hỗn hợp dung môi có nước. - Thường các hợp chất dễ tan trong nước sẽ khó tan trong các dung môi hữu cơ và ngược lại. - Dung môi dùng kết tinh không được tạo thành hợp chất mới với chất kết tinh. - Dung môi kết tinh tốt phải có nhiệt độ sôi tương đối cao. Nhiệt độ sôi của nó càng cao thì sẽ có nhiều thời gian để hình thành tinh thể, tuy nhiên cũng không nên quá cao vì sẽ khó bay hơi trong khi kết tinh, đồng thời nhiệt độ cao có thể làm phân hủy chất kết tinh. - Trên thực tế để kết tinh các hợp chất tự nhiên, ta hay dùng MeOH hoặc hỗn hợp của MeOH với một dung môi khác. Việc chọn dung môi kết hợp với MeOH tùy thuộc vào tính hoà tan của chất cần kết tinh . I.2. Cách xác định độ hoà tan của một chất đối với dung môi Cân một lượng chính xác chất tan trong ống nghiệm, dùng ống hút có chia vạch 0,1 ml nhỏ dung môi muốn hòa tan chất kết tinh, nhỏ từ từ vào cho đến khi hợp chất tan hoàn toàn. Sau mỗi lần cho dung môi vào, cần lắc mạnh ống nghiệm để hoà tan chất. Tỷ lệ giữa lượng chất rắn với thể tích dung môi đủ để hòa tan hoàn toàn là độ hòa tan của dung môi ấy với chất rắn ở nhiệt độ thường. Cách xác định độ hòa tan ở nhiệt độ sôi cũng tiến hành tương tự, và được thực hiện trong nồi đun cách thủy. Căn cứ vào độ hòa tan đã được xác định để tính lượng dung môi cần thiết cho sự kết tinh. Thí dụ: hợp chất có độ hoà tan: 5mg trong 1ml dung môi B ở nhiệt độ thường 45 mg trong 1 ml ở nhiệt độ sôi Dung môi này hoà tan chất ở nhiệt độ sôi gấp 9 lần ở nhiệt độ thường nên có thể dùng làm dung môi kết tinh. Nếu có 500 mg chất thì lượng dung môi cần dùng là : 1mlx 500/45 ≈ 11 ml Như vậy có thể dùng khoảng 12 ml dung môi để kết tinh 500 mg hợp chất trên. Căn cứ vào độ tan ở nhiệt độ thường (5mg/ml), người ta có thể ước tính lượng hợp chất còn lại trong dung dịch sau khi kết tinh. I.3. Cách hòa tan nóng Để kết tinh một lượng nhỏ chất rắn (10-20mg), nên sử dụng bình cầu nhỏ hoặc ống nghiệm nhỏ. - Trường hợp dùng một dung môi: Cho chất rắn vào bình, đổ một lượng dung môi đã tính trước vào bình, đun cách thủy đến sôi đồng thời lắc đều. Khi dung dịch trở nên trong suốt, lấy bình ra để nguội và cho vào tủ lạnh để yên kết tinh. - Trường hợp dùng hỗn hợp 2 dung môi : thí dụ A là dung môi tan, B là dung môi không tan hoặc ít tan. Trong bình cầu có chứa bột chất kết tinh, cho một lượng nhỏ dung môi A đun sôi các thủy. Tiếp tục cho từng ít dung môi A cho đến khi chất rắn vừa tan hết. sau đó dùng ống hút lấy dung môi B cho từng ít một vào bình cho đến khi dung dịch bắt đầu đục. Bình vẫn đun sôi, lấy dung môi A cho vào bình cho đến khi dung dịch bắt đầu trong suốt trở lại. Lấy bình ra, để nguội ở nhiệt độ thường, sau đó cho vào tủ lạnh để yên kết tinh. I.4. Gạn lấy tinh thể và làm khô Nếu lượng tinh thể ít thì không nên lọc vì sẽ hao hụt nhiều. Nghiêng bình hút dung dịch mẹ ra một bình khác, dùng ống hút lấy dung môi rữa nhẹ nhàng tinh thể. Sau đó để khô tự nhiên 1-2 giờ, cho vào bình hút ẩm vài ngày trước khi đo điểm nóng chảy hoặc phân tích quang phổ. Bảng 25:Một số dung môi kết tinh thường dùng MeOH-H 2 O EtOH-Aceton EtOH-H 2 O EtOAc MeOH Ether-EtOAc EtOH Hexan-EtOAc MeOH-EtOAc Ethet-Aceton MeOH-Aceton Hexan III. TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng nhiều từ lâu. Phương pháp được phát triển nhanh chóng từ những năm 1930-1940. Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa những pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Trong những năm 1930, một loạt các nhà hóa học được nhận giải thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ ứng dụng thành công phương pháp cô lập bằng sắc ký cột hấp phụ. - 1937, P. KARRER (Thụy sĩ) về hóa học Carotenoid, đặc biệt là vitamin A và vitamin B. - 1938, R. KURN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin - 1939, L.RIZICKA (Thụy sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid - 1940, MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp silicagel và về sau phát triển sang sắc ký giấy. Hai ông được giải thưởng Nobel năm 1952 về sắc ký phân bố. - 1948, TISLIUS (Thụy điển) được giải thưởng Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký hấp phụ. Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên. Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho phép ta ứng dụng nó ở bất cứ mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện… Trong hoàn cảnh chưa được trang bị những máy chuyên dùng hiện đại như máy sắc ký khí, máy sắc ký lỏng cao áp… chúng ta vẫn có thể thực hiện việc phân tích sắc ký bằng áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký cột hấp phụ cổ điển với những dụng cụ phương tiện đơn giản mà bất cứ ở một cơ sở nghiên cứu nào cũng có thể sắm được. Ngay cả ở những nước tiên tiến, bên cạnh những máy hiện đại, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột vẫn là công cụ đắc lực trong công tác nghiên cứu hằng ngày. Có nhiều phương pháp để phân loại sắc ký: - Nếu dựa theo trạng thái liên hợp của pha động thì có sắc ký lỏng và sắc ký khí. - Nếu dựa theo cơ chế của quá trình tách: + Sắc ký hấp phụ + Sắc ký phân bố + Sắc ký gel + Sắc ký trao đổi ion III.1. Sắc ký hấp phụ Hấp phụ là sự tích tụ một hợp chất ở trạng thái khí hoặc lỏng lên bề mặt một chất rắn. Hay nói cách khác là sự tích tụ ở ranh giới giữa 2 pha: khí-rắn, lỏng-rắn. Trong sắc ký hấp phụ lỏng, pha tĩnh là chất rắn mịn và xốp, pha động là chất lỏng. Dựa trên tính hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách đối với chất hấp phụ (pha tĩnh), người ta dùng dung môi thích hợp (pha động) qua pha tĩnh để giải hấp, ta sẽ tách riêng được từng phần các cấu tử trong hỗn hợp. Các yếu tố quan trọng trong sắc ký hấp phụ là lựa chọn chất hấp phụ và dung môi. Chất hấp phụ cần phải thỏa mãn các tính chất sau: [...]... -NH2 > C=O > -OR > -CH3 III .2 Sắc ký phân bố Sắc ký phân bố dựa trên sự phân chia một chất giữa 2 chất lỏng không trộn lẫn vào nhau (hoặc giữa chất lỏng và chất khí) khi cho chất lỏng thứ 2 (pha động) di chuyển qua chất lỏng thứ nhất (pha tĩnh) Thông thường pha tĩnh được hấp thụ trên bề mặt của một chất rắn gọi là chất mang hoặc liên kết hóa học với chất mang Các phương pháp sắc ký dựa trên nguyên... người ta hay dùng rộng rãi oxyd nhôm và silicagel để tách hỗn hợp phân cực hoặc không phân cực Đối với dung môi phải thỏa mãn các điều kiện sau: - Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích - Bị hấp phụ ít nhất đối với pha tĩnh - Không phản ứng hóa học đối với các chất cần phân tích cũng như chất hấp phụ - Phải tinh khiết Đối với chất phân tích (chất bị hấp phụ), cấu trúc hóa học... tức là ái lực hấp phụ đối với các cấu tử cần tách trong hỗn hợp phải khác nhau - Độ mịn của hạt phải thích hợp: hạt càng bé, cân bằng hấp phụ được thiết lập càng nhanh, nhưng nếu quá nhỏ quá sẽ ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy của pha động - Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hóa để kết quả trùng lập Dựa trên kinh nghiệm, chất hấp phụ hay dùng được sắp xếp theo thứ tự hoạt tính giảm dần như sau:... chúng Các hợp chất hydrocarbon bão hòa có độ hấp phụ rất kém, nếu thêm một nối đôi hay một nhóm chức thì ái lực hấp phụ của chúng sẽ tăng lên Trong thực nghiệm, người ta đã xây dựng được một dãy các nhóm chức có độ hấp phụ giảm dần như sau: - Đối với hydrocarbon nhân thơm: -COOH > -CONH2 > -OH > -NHCOCH3 > -NH3 > -OCOCH3 > -(CH3 )2 > -OCH3 > -H > -Cl - Đối với hydrocarbon mạch thẳng: -COOH > -OH > -NH2... phân bố: - Sắc ký cột - Sắc ký giấy - Sắc ký khí Bảng 3: Phân loại các kỹ thuật sắc ký Loại pha tĩnh Loại pha động Dụng cụ pha tĩnh Sắc ký hấp phụ (sự cạnh tranh giữa chất hấp phụ rắn và pha động ) Khí Cột Sắc ký khí Lỏng Cột Sắc ký cột Loại sắc ký Lớp phẳng Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy Sắc ký phân bố (sự cạnh tranh giữa pha tĩnh lỏng và pha động) Khí Cột Sắc ký lỏng-khí Lỏng Cột Sắc ký lỏng-lỏng Sắc... pha tĩnh lỏng và pha động) Khí Cột Sắc ký lỏng-khí Lỏng Cột Sắc ký lỏng-lỏng Sắc ký trao đổi ion (sự cạnh tranh giữa pha tĩnh là resin trao đổi ion và pha động lỏng) Lỏng Cột Sắc ký trao đổi ion Sắc ký rây phân tử (sự cạnh tranh giữa một khung polymer và pha động lỏng) Lỏng Cột Sắc ký lọc gel . 3-4 ml cồn 90 o chia làm 2 ống nghiệm - Ống 1: Cho vài giọt KOH, nếu có màu đỏ thì có hợp chất ANTHRAGLYCODID - Ống 2: cho vào ít bột Mg kim loại và vài giọt HCL nếu có màu đỏ thì có hợp chất. hexan. - Các chất có nhiều nhóm OH, các glycoside dễ tan trong các dung môi ưa nước như MeOH, EtOH và các hỗn hợp dung môi có nước. - Thường các hợp chất dễ tan trong nước sẽ khó tan trong các. dãy các nhóm chức có độ hấp phụ giảm dần như sau: - Đối với hydrocarbon nhân thơm: -COOH > -CONH 2 > -OH > -NHCOCH 3 > -NH 3 > -OCOCH 3 > -( CH 3 ) 2 > -OCH 3 > -H