Giáo trình chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên, chương 4 sắc ký cột

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.. Hoặc cột cũng có thể tự

CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh

Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong 1 ống hình trụ được gọi là “cột” Tùy theo tính chất của chất được được sử dụng làm cột mà quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân

bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion) Ở đây chỉ trình bày sắc ký cột hấp phụ

I NGUYÊN TẮC

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO3 , than hoạt tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa

- Oxid nhôm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh)

o Độ hoạt hóa số I 0,5 % H2O

III 4,3% H2O

IV 6,6% H2O

V 15% H2O

- Oxid nhôm baz (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh)

o Độ hoạt hóa số I 1,2 % H2O

III 5,8% H2O

IV 8,1% H2O

V 10% H2O

- Silicagel 60 cỡ hạt 0,063-0,200 mm

- Polyamid M-K cỡ hạt < 0,07 mm

Silicagel là pha tĩnh được dùng rộng rãi nhất để tách các hợp chất thiên nhiên

Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp

Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần

Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kích

cỡ lớn nhỏ Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ nối với một ống cao su, dùng khóa kim loại để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi

Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt Một vài cột bán sẵn trên thị trường có kích thước tương ứng với chiều dài và kích thước cột:

Đường kính (cm) Chiều dài (cm)

II KỸ THUẬT NHỒI CỘT VÀ TRIỂN KHAI SẮC KÝ

II.1 Chuẩn bị cột

- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch)

- Kẹp cột thẳng đứng trên giá

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất

Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột

Trọng lượng chất phân tích

Tỷ lệ =

Trọng lượng chất hấp phụ

Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,…

Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô

Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel,

Sephadex … thì phải ngâm trong dung môi trước một thời gian trước khi cho vào cột để tránh làm nứt cột Lắc, trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng, và không được để khô dung môi trong cột Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn tòan ổn định Mặt thoáng trên cột phải phẳng, người ta có thể cho thêm một lớp cát hoặc bông để tránh làm xáo trộn lớp Silicagel khi rót dung môi

Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3 Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phểu có cuống dài Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều xung quanh cột theo chiều từ dưới lên

để bột xuống được đều Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định và không được để khô dung môi trong cột

II.2 Đưa chất phân tích vào cột

Yêu cầu khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:

Phương pháp dùng đĩa giấy: Dùng giấy lọc cắt 1 hình tròn có đường kính nhỏ hơn

đường kính cột 0,5mm Dùng kim châm những lỗ thủng cách đều nhau Chất cần phân tích được hòa tan trong một lượng dung môi vừa đủ, cho giấy thấm đều dung dịch đậm đặc này Lấy giấy ra, cho bốc hơi dung môi bằng cách sấy rồi tiếp tục tẩm dung dịch thử Nếu cột lớn, lượng mẫu nhiều thì có thể dùng nhiều đĩa giấy

Sau khi cột đã ổn định với dung môi, tháo dung môi cho đến khi bề mặt dung môi ngang với mặt lớp chất hấp phụ trong cột thì khóa van lại Đặt cẩn thận các đĩa giấy vào cột, dùng ống hút cho dung môi cho tẩm ướt đĩa giấy Cho một lớp cát mịn lên trên đĩa giấy và bắt đầu cho dung môi chảy

Cho thẳng dung dịch thử lên cột: Hòa tan chất cần phân tích vào một lượng vừa đủ

dung môi (càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo hòa tan hoàn toàn Dung dịch thử có nồng

độ đậm đặc mới nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột Cột đã ổn định được tháo dung môi cho đến khi mặt thoáng gần sát bề mặt chất hấp phụ thì khóa vòi lại Dùng ống hút hút dung dịch đậm đặc chất cần phân tích chảy dọc thành cột Mở khóa bên dưới cho dịch thử ngấm vào cột (không được để chất hấp phụ ở đầu cột bị khô) Khi toàn bộ lớp dung

dịch thử đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ít dung môi rửa thành cột, cho dung môi ngấm hết vào cột Tiếp đến là cho dung môi để bắt đầu tiến hành quá trình giải ly

Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ:

Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột

Trong 3 cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau:

- Chất thử hoà tan hòan tòan

- Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều

- Khi toàn bộ chất thử đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi mới

- Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột Nếu chất thử ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau là chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo

III RỬA CỘT

Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén

- Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực Cột áp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn

- Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột Tốc độ dồng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều chỉnh Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng, và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột

Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột

Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly

Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột Tạp chất có trong dung môi thường làm thay đổi độ phân cực, do vậy người ta thường cất dung môi trước khi sử dụng

Hiện nay trên thị trường có bán loại silicagel đảo pha Khi sử dụng silicagel này làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp thu tỉ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký Cho nên pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước Như vậy các thành phần phân cực trong hỗn hợp chất cần sắc ký sẽ được giải ly ra trước, thành phần không phân cực sẽ ra sau Phương pháp này được ứng dụng rất hiệu quả đối với các hợp chất có độ phân cực mạnh cao trong thực vật như: saponin hay triterpen

Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần

Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột thì sẽ làm gãy cột Nguyên nhân do các chất hấp phụ như Al2O3 hoặc silicagel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi cục bộ, hơi sinh ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách sẽ không tốt

Vận tốc chảy của dung môi rửa cột cũng phải điều chỉnh cho phù hợp; không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) cũng không được quá chậm hoặc cho

dừng lại một thời gian vì sẽ làm cho chất tan bị khuye61ch tán, ảnh hưởng đến hiệu quả tách

Tốc độ di chuyển của một chất trên mặt hấp phụ phụ thuộc vào dung môi

Bảng sắp xếp dưới đây của Trappe theo thứ tự tăng dần lực phản hấp phụ của một số dung môi:

Ether dầu hỏa cyclohexan carbon tetraclorur tricloroetylene toluen benzen

methylclorur chloroform ether ethylic ethylacetat pyridin aceton npropanol

-ethanol - m-ethanol - nước

Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi

Bảng 7: Một số hỗn hợp dung môi thường dùng cho các hợp chất phân cực (dùng cho sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng)

CHẤT HẤP PHỤ CỔ ĐIỂN

F CHCl3/MeOH/EtOAc/ H2O 2:2:4:1

I EtOAc/Acetone/MeOH/H2O 10:10:1:1

L EtOAc/ Acetone/MeOH/H2O 10:10:1:1

N EtOAc/AcOH/H2O 100:16:13

CHẤT HẤP PHỤ ĐẢO

Theo dõi quá trình giải ly cột:

Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Thường trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi tách tốt nhất Khi chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành

IV SẮC KÝ CỘT NHANH (Flash chromatography)

Xuất phát từ yêu cầu thực tế là cần phải có một phương pháp tách và tinh chế các hợp chất thiên nhiên với một lượng mẫu nhỏ, thời gian tiến hành nhanh chóng và làm giảm bớt khả năng phân hủy của các chất có thể gặp trong trường hợp sắc ký cổ điển

Phương pháp sắc ký nhanh đã được nghiên cứu và công bố đầu tiên bởi W CLARK STILL , MICHEAL KAHN, ABHIJIT MITRA vào năm 1978 và được đăng ký bằng phát minh vào năm 1981 (US Patent 4293422)

Sắc ký nhanh là kỹ thuật sắc ký lỏng có sự tác dụng của áp suất không khí, thực hiện trên một cột thủy tinh ngắn nhằm gia tăng tốc độ chảy của dung dịch rửa cột

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký nhanh (FC) rất đơn giản, dụng cụ rẻ tiền, sự tách được thực hiện nhanh chóng và có hiệu quả cao

Cột thủy tinh:

Trong phương pháp sắc ký cột nhanh, người ta sử dụng cột thủy tinh ngắn với các đường kính thích hợp từ 10-50mm tùy thuộc vào lượng mẫu phân tích Dưới đáy cột có gắn một vòi có khóa để dẫn dung dịch ra ngoài

Bộ phận điều chỉnh áp suất và tốc độ dòng chảy gồm bộ phận dẫn khí nén có lắp một van điều chỉnh tốc độ chảy Sau này người ta thêm bộ phận chứa dung môi bằng thủy tinh trên đầu cột

Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung môi rửa cột và các phân đoạn được ghi trong bảng 8

Bảng 8: Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung môi

Đường kính

cột (mm)

Thể tích dung môi rửa (ml)

Lượng mẫu cho vào (mg) Phân đoạn

(ml) 4Rf ≥0,2 4Rf ≥0,1

Chất nhồi cột:

Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu là silicagel với các cỡ hạt nhỏ 40-60m (230-400 mesh)

Bảng 9: Các loại silicagel dùng trong FC

(m) Diện tích bề mặt (cm 2 /g)

Amicon (Danvers, MA) Si 60

Si 100

20-30 50-105

500 (60 Ǻ)

300 (100 Ǻ)

J.T.Baker (Phillipsburg, NJ) Si 60 40-63

63-200 100-425

480

EM.Science / Merck

Gibbstonin, NJ

Si 40

Si 60

Si 100

25-40 63-200 40-63 63-100 15-40

675 (40 Ǻ)

550 (60 Ǻ)

420 (100 Ǻ))

ICN (Woelm)

(Cleveland, OH)

10-35 18-32 32-63 32-100 63-100 63-200

500-600

Universal absorbents

(Atlanta , GA)

32-63 63-100 53-200 100-200

500-600

Whatman (Clifton NJ) Si 40 13-24

37-53 75-40

Dung môi rửa cột:

Dung môi được chọn trong FC nên có độ nhớt thấp như: CHCl3 , EtOAc, MeOH Dùng SKLM để tiến hành thử hợp chất cần sắc ký để tìm hệ dung môi thích hợp sao

cho các thành phần trong hỗn hợp có giá trị Rf ≥ 0,35 Như vậy nếu trong hỗn hợp gồm nhiều chất thì chất phân cực nhất phải có giá trị Rf tối thiểu là 0,35

Việc tách đạt hiệu quả tốt nếu sự khác biệt về hằng số Rf của các chất trong hỗn hợp đạt điều kiện Rf >0,15 Tuy nhiê,n trong một số trường hợp nếu Rf không đạt yêu cầu trên thì có thể dùng giải pháp tăng chiều dài cột và giảm lượng mẫu phân tích

và điều chỉnh hệ dung môi Bằng những biện pháp trên, Still và cộng sự đã tách ra được những chất có Rf >0,1 và Rf >0,05

Hệ dung môi dùng cho pha thường là các dung môi có độ phân cực thấp như ether dầu hỏa, hexan, ethyl acetat

Hệ dung môi dùng cho pha đảo thường là các dung môi có độ phân cực cao như MeOH, H2O, MeOH-H2O

Bảng 10: Áp dụng FC để tách các hợp chất tự nhiên

Neolignans Piperfuto Kasura

Piperaceae

Sesquiterpen Canelle Winterane

Canellaceae

SiO2 Ether ethyl

-Hexan

RP-18 40 m

MeOH MeOH-H2O Alcaloid

quinolizidin Lipinus argentensFabaceae Al

2O3 baz (Merck)

Ether Ethyl Ether ethyl-MeOH

Nhồi cột:

Đầu tiên cho một lớp bông thủy tinh lót dưới đáy cột, sau đó cho một lớp cát biển Cho từ từ silicagel khô 40-63 m vào cột, sau đó cho một lớp cát biển lên trên bề mặt lớp silicagel

Đổ dung môi giải ly lên trên bề mặt của lớp các biển đến đầy cột, gắn bộ phận điều chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột Van kim luôn được mở, mở nhẹ nhàng cho dòng khí chảy qua, tay bịt air gió Áp suất trong cột sẽ gia tăng, nén lớp dung môi chảy qua cột

nhanh Áp suất được duy trì như vậy đến khi tất cả không khí trong cột bị đuổi ra ngòai Chú ý không được để lớp Silicagel trên đỉnh cột bị khô

Cho chất phân tích vào cột cũng giống như sắc ký cột thường nghĩa là chất cần sắc

ký cũng hòa tan vào dung môi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén tất cả dung dịch mẫu vào lớp silicagel, sau đó dùng vài ml dung môi tinh chế để rửa quanh thành cột Rót dung môi đầy cột, mở van điều chỉnh áp và bắt đầu hứng các phân đoạn Lượng dung môi rửa cột và thể tích các phân đoạn hứng tùy thuộc vào lượng mẫu tương ứng

V SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography)

Sắc ký cột nhanh khô là một cải biên của sắc ký cột nhanh, dùng áp suất kém để gia tăng tốc độ giải ly của pha động Kỹ thuật này khác với FC là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được

Dụng cụ gồm phễu lọc xốp bằng thủy tinh Phễu này có bán sẵn trên thị trường với đủ loại kích thước thích hợp Một hệ thống tạo áp thường dùng vòi nước hơn là máy bơm vì chỉ cần áp suất vừa phải

Chất hấp phụ thường dùng là silicagel dùng cho SKLM tức loại có độ mịn hạt 40-15

m) hoặc Al2O3 dùng cho SKLM

Nạp chất hấp phụ vào phễu lọc ở trạng thái khô, gắn phễu vào hệ thống tạo áp suất kém, vừa gõ nhẹ vào thành phễu để chất hấp phụ được nén đều, tạo thành một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phẳng…

Chiều cao của chất hấp phụ không được quá cao, nếu muốn tách một lượng chất nhiều thì dùng phễu có đường kính to

Chất cần sắc ký được hòa tan vào một dung môi kém phân cực, nạp vào cột, gắn áp suất kém, dung dịch mẫu sẽ được hút vào phần silicagel ở đầu cột thành một lớp mỏng đều

Cũng có thể nạp mẫu ở dạng khô, dung dịch cao mềm của mẫu thử được trộn với một lượng vừa đủ chất hấp phụ, tạo thành bột rắn khô (có thể đuổi dung môi bằng cô quay chân không), sau đó cho lớp bột này lên đầu cột để có một lớp mỏng và đều Nối với hệ thống tạo áp suất kém Đổ một lượng dung môi nhất định lên bề mặt phễu, dung môi được rút xuống bình cầu hứng phía dưới Sau khi dung môi được rút hết, ngưng áp suất, rót phần dung môi vừa giải ly từ cột qua một bình khác Lần lượt triển khai từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực Theo dõi quá trình giải ly và thay đổi hệ dung môi thích hợp bằng sắc ký lớp mỏng như sắc ký cột cổ điển

Với những cao trích từ cây cỏ, thường chứa rất nhiều thành phần khác nhau nên thường không có phương pháp sắc ký cột nào hiệu quả để thu được cấu tử sạch mong muốn bằng một lần thực hiện sắc ký cột mà phải thực hiện nhiều lần