bài giảng các phương pháp cô lập hợp chất thiên nhiên

Xác định các chất tan trong dịch ether ethylicPhân tích dung dịch kiềm Dung dịch kiềm được cho vào becher và được trung hòa bằng HCl 25% để trung tính, lọc.. Lớp dung dịch ether được rử

NỘI DUNG

• PHÂN TÍCH SƠ BỘ HÓA THỰC VẬT

• CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

CHẤT TỰ NHIÊN

PHÂN TÍCH SƠ BỘ HOÁ THỰC VẬT CỦA CAO TRÍCH

Mg/HCl đđ

FLAVONOID ACID BÉO ANTHRAGLYCOSID TINH DẦU

PHYTOSTEROL CAROTENOID ALCALOID SAPONIN ANTHOCYANIN ĐƯỜNG

ALCALOID ACID HỮU CƠ TANIN

FLAVONOID ANTHRAGLYCOSID STEROID

H/C URONIC TANIN ĐƯỜNG

Cặn có mùi thơm Liebermann + H2SO4 đđ

TT Mayer, Bouchardat Dragendorff , Liebermann

Liebermann Cồn cao độ FeCl3

TT Fehling A, B

KOH 10%

H2SO410%

H2SO410%

ml ether ethylic trong 5 phút Làm như vậy 3 lần cho tới khi dịch ether không còn màu

Tập trung dịch lọc trong một bình lắng gạn, lắc với 60ml KOH (20ml x 3 lần) sẽ tách ra 2 lớp: lớp kiềm và lớp ether

Xác định các chất tan trong dịch ether ethylic

Phân tích dung dịch kiềm

Dung dịch kiềm được cho vào becher và được trung hòa bằng HCl 25% để trung tính, lọc Tủa trên phểu lọc hòa với 5ml cồn 90o, chia làm 3 ống nghiệm

Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10% nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có hợp chất ANTHRAGLYCOSID

Ống 2: acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg kim loại, nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có FLAVONOID

Ống 3: nhỏ một giọt lên giấy lọc khô, hơ khô, nếu trên giấy lọc có vết mờ thì sơ bộ nhận định có ACID BÉO

Lớp dung dịch ether được rửa 3 lần với nước cất (20ml x 3 lần), sau đó lắc 3 lần với dung dịch H2SO4 2% (5ml x 3 lần)

Các dịch acid được góp lại để làm phản ứng định tính alcaloid với:

Thuốc thử Mayer: Tủa vàng nhạt

Thuốc thử Dragendorff: Tủa Cam

Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu

Phân tích dung dịch ether

Dịch ether chia làm 3 phần cho vào 3 chén sứ, bốc hơi đến cạn

Chén 1: nếu có mùi thơm thì có TINH DẦU

Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đđ, nếu có màu xanh thì có CAROTENOID

Chén 3: Hóa cắn với 10 giọt anhydrid acetic cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ theo thành ống nghiệm Nếu chổ giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ thì sơ bộ nhận định có hợp chất PHYTOSTEROL

Bã nguyên liệu sau khi chiết bằng ether đem chiết nóng với cồn 90(30ml x 3 lần) trên bếp cách thủy, lọc Tập trung dịch lọc vào bình nón, chia làm 6 phần.

bằng dung dịch NH4OH đđ, lọc:

Tủa trên phễu hòa với 1 ml CHCl3, hứng vào ống nghiệm Sau đó cho vào 1ml anhydrid acetic và nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ Nếu dung dịch có màu xanh thì có nhân STEROID

Dịch lọc được acid hóa bằng HCl, lọc Tủa trên phểu hòa với 3-4

Phần thứ 2: Pha loãng dịch cồn với một thể tích nước cất rồi chia làm 2 phần:

Ống 1: Trung hòa với natri acetat, thêm vài giọt FeCl3 2%, nếu

có màu xanh đen thì có TANIN

Ống 2: cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt thì có acid hữu cơ

Phần thứ 3: Dịch cồn được bóc hơi cách thủy trong chen sứ đến cạn, hòa cắn với 4-5 ml H2SO4 2%, lọc Chia dịch lọc ra làm 3 phần để làm phản ứng định tính alcaloid.

Ống 1: + thuốc thử Mayer

Ống 2: + thuốc thử Dragendorff

Ống 3: + thuốc thử Bouchardat

với 3ml nước cất đun nóng Lọc, cho thêm vào nước lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ

Xác định các chất tan trong dịch cồn

Phần thứ 5: Dịch cồn được pha loãng với một thể tích nước cất, chia làm 2 ống nghiệm:

Ống 1: acid hóa (màu đỏ)

Ống 2: Kiềm hóa (màu lục)

Thì có ANTHOCYNANOSID

Phần thứ 6: Chia dịch cồn làm 2 phần, bóc hơi cách thủy trong chén sứ

Chén 1: hòa với 5 ml nước cất, lắc mạnh nếu có bọt thì có SAPONIN

Chén 2: hòa vào chén 0,5 ml CHCl3và 0,5 ml anhydric acetic, cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ H2SO4 đđ

+ Có vòng tím thì có SAPONIN TRITERPEN

+ Có vòng xanh lục thì có SAPONIN STEROID

Xác định các chất tan trong dịch cồn

Bã nguyên liệu sau khi chiết với cồn 90o được chiết với H2SO42% (20ml x 3 lần) Lọc, chia nước lọc ra làm 5 phần:

Phần 1: Lắc trong ống nghiệm, nếu có bọt bền thì có SAPONIN.Phần 2: Kiềm hóa với NH4OH 10% , lắc với ether (5ml x 3 lần) Loại bỏ lớp nước, lớp ether lắc với H2SO4 2% Dịch acid được chia làm 3 phần để làm phản ứng tìm alcaloid (thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff)

Xác dịnh các chất tan trong dịch acid

Phần thứ 3: Cho tác dụng với thuốc thử Fehling, nếu có tủa đỏ gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ

Phần 4: trung tính hóa với natri acetat, sau đó thêm vài giọt FeCl310% , nếu có tủa xanh nâu thì có TANIN

Phần 5: Pha dịch với 2 thể tích cồn 90o, nếu có tủa nhiều thì có hợp chất URONIC

Cao trích bởi các dung môi

Thuốc thử Phản ứng màu thiên nhiên Hợp chất

Ether

ethyl Ethanol 90% Acid 1%

+ + - KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycoside + - - Nhỏ lên giấy lọc Có vết ố màu Acid béo

- + - Mg/HCl dung dịch Có vòng màu đỏ Flavonoid

+ - - Liebermann Có màu lục đỏ Phytosterol + - - H2SO4 đđ Không màu Carotenoid

- + + Mayer, Bouchardat,

Hager, Dragendorff Có tủa màu Alcaloid

- - Lắc mạnh dung dịch Không có bọt Saponin

CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng nhiều từ lâu Phương pháp được phát triển nhanh chóng từ những năm 1930-1940

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do

sự phân bố không đồng đều của chúng giữa những pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh.

Trong những năm 1930, một loạt các nhà hóa học được nhận giải thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ ứng dụng thành công phương pháp cô lập bằng sắc ký cột hấp phụ

1938, R KURN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin

1939, L.RIZICKA (Thụy sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid

1940, MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp silicagel và về sau phát triển sang sắc ký giấy Hai ông được giải thưởng Nobel năm 1952 về sắc ký phân bố

1948, TISLIUS (Thụy điển) được giải thưởng Nobel về kỹ thuật

Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên.

Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho phép ta ứng dụng nó ở bất cứ mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện… Trong hoàn cảnh chưa được trang bị những máy chuyên dùng hiện đại như máy sắc ký khí, máy sắc ký lỏng cao áp… chúng ta vẫn có thể thực hiện việc phân tích sắc ký bằng áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký cột hấp phụ cổ điển với những dụng cụ phương tiện đơn giản mà bất cứ ở một cơ

sở nghiên cứu nào cũng có thể sắm được.

Ngay cả ở những nước tiên tiến, bên cạnh những máy hiện đại, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột vẫn là công cụ đắc lực trong công tác nghiên cứu

sắc ký khí.

Nếu dựa theo cơ chế của quá trình tách:

+ Sắc ký hấp phụ

+ Sắc ký phân bố

Sắc ký hấp phụ

- Hấp phụ là sự tích tụ một hợp chất ở trạng thái khí hoặc lỏng lên bề mặt một chất rắn Hay nói cách khác là sự tích tụ ở ranh giới giữa 2 pha: khí-rắn, lỏng-rắn

-Trong sắc ký hấp phụ lỏng, pha tĩnh là chất rắn mịn và xốp, pha động là chất lỏng

- Dựa trên tính hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách đối với chất hấp phụ (pha tĩnh), dùng dung môi thích hợp (pha động) qua pha tĩnh để giải hấp, sẽ tách riêng được từng phần các cấu

tử trong hỗn hợp

Yếu tố quan trọng trong sắc ký hấp phụ là lựa chọn chất hấp phụ và dung môi.

Chất hấp phụ cần phải thỏa mãn các tính chất sau:

- Không tương tác với cấu tử cần phân tách: không tạo phản ứng phụ

- Phải có tính chọn lọc

- Độ mịn của hạt phải thích hợp

- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hóa để kết quả trùng lập

Than hoạt tính Silicagel

Đất tẩy trắng Magie silicat Nhôm oxyd (axit) Nhôm oxyd (baz) Crom (III) oxyd Kẽm sulfur

Nhôm oxyd (trung tính) Nhôm hydroxyd

Calci hydroxyd Calci carbonat Calci sulfat Tal C

Đường, tinh bột Inulin

Bột Celluloz

Dựa trên kinh nghiệm, chất hấp phụ được sắp xếp theo thứ tự hoạt tính giảm dần như sau:

+ Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích.

+ Bị hấp phụ ít nhất đối với pha tĩnh

+ Không phản ứng hóa học đối với các chất cần phân tích cũng như chất hấp phụ

+ Phải tinh khiết

+ Đối với chất phân tích (chất bị hấp phụ), cấu trúc hóa học có ảnh hưởng trực tiếp lên độ hấp phụ của chúng

+ Các hợp chất hydrocarbon bão hòa có độ hấp phụ rất kém, nếu

Đối với dung môi phải thỏa mãn các điều kiện sau:

Trong thực nghiệm, người ta đã xây dựng được một dãy các nhóm chức có độ hấp phụ giảm dần như sau:

- Đối với hydrocarbon nhân thơm:

-COOH > -CONH2 > -OH > -NHCOCH3 > -NH3 > -OCOCH3 > -(CH3)2 > -OCH3 > -H > -Cl

- Đối với hydrocarbon mạch thẳng:

-COOH > -OH > -NH2 > C=O > -OR > -CH3

Sắc ký phân bố dựa trên sự phân chia một chất giữa 2 chất lỏng không trộn lẫn vào nhau (hoặc giữa chất lỏng và chất khí) khi cho chất lỏng thứ 2 (pha động) di chuyển qua chất lỏng thứ nhất (pha tĩnh).

Thông thường pha tĩnh được hấp thụ trên bề mặt của một chất rắn gọi là chất mang hoặc liên kết hóa học với chất mang

Các phương pháp sắc ký dựa trên nguyên tắc phân bố:

- Sắc ký cột

Loại pha tĩnh Loại

pha động

Sắc ký khí Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy

Sắc ký phân bố (sự cạnh tranh

Sắc ký trao đổi ion (sự cạnh

tranh giữa pha tĩnh là resin trao

Sắc ký rây phân tử (sự cạnh

Phân loại các kỹ thuật sắc ký