Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang virus gây bệnh đốm trắng ở tôm nuôi nước lợ tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Trang 1 TRƯƠNG THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘNG VẬT THỦY SINH CHỦ YẾU MANG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC N

KT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM àn h TRƯƠNG THỊ MỸ HẠNH ng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘNG VẬT THỦY SINH sĩ CHỦ YẾU MANG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở Lu ận án tiế n TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP-2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KT TRƯƠNG THỊ MỸ HẠNH h NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘNG VẬT THỦY SINH àn CHỦ YẾU MANG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở Lu ận Mã số : Dịch tễ học thú y án Chuyên ngành tiế n sĩ ng TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC : 64 01 08 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phan Thị Vân PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2017 Lu ận án tiế n sĩ ng àn h KT Tác giả luận án i Trương Thị Mỹ Hạnh LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo tạo điều kiện hướng dẫn vấn đề có liên quan đến học tập, nghiên cứu từ ngày đầu nhập học, trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận án Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể cán Lãnh đạo Trung tâm Quan trắc Môi trường Bệnh thủy sản miền Bắc, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I thầy cô giáo thuộc môn Vi sinh vật truyền KT nhiễm, khoa Thú Y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam h Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai giáo viên hướng dẫn, người àn ln động viên, khích lệ lúc có góp ý phản biện khoa học sâu sắc ng giúp tơi hồn thành luận án sĩ Cuối cùng, tơi xin giành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình ln bên tiế tập hồn thành luận án n cạnh, động viên lo lắng công việc gia đình để tơi n tâm nghiên cứu học án Một lần xin cảm ơn tất ủng hộ cho luận án này! Lu ận Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2017 Tác giả luận án Trương Thị Mỹ Hạnh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Phần Mở đầu Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài ng àn h KT 1.1 sĩ Phần Tổng quan tài liệu Nghề nuôi tôm nước lợ việt nam 2.1.1 Một số đặc điểm chung nghề nuôi tôm nước 2.1.2 Hiện trạng nuôi tôm Quảng Ninh, Nam Định Nghệ An 2.2 Bệnh đốm trắng tôm nuôi nước lợ 11 2.2.1 Tác nhân gây bệnh 12 2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 16 2.2.3 Phương thức lan truyền bệnh đốm trắng 18 2.2.4 Yếu tố nguy dẫn đến tôm nhiễm bệnh virus đốm trắng 19 2.3 Sinh vật mang virus đốm trắng gây bệnh cho tôm nuôi 20 2.3.1 Nghiên cứu sinh vật mang WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm giới 21 2.3.2 Nghiên cứu sinh vật mang WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm Việt Nam 32 Lu ận án tiế n 2.1 Phần Phương pháp nghiên cứu 35 3.1 Địa điểm nghiên cứu 35 3.2 Thời gian nghiên cứu 35 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 35 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 35 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 35 iii Nội dung nghiên cứu 38 3.4 Phương pháp nghiên cứu 38 3.4.1 Phương pháp điều tra 40 3.4.2 Phương pháp thu, bảo quản định danh loài động vật thủy sinh 40 3.4.3 Phương pháp phân tích mẫu động vật thủy sinh sinh học phân tử 41 3.4.4 Phương pháp tách chiết ADN 41 3.4.5 Phương pháp tách chiết ARN 43 3.4.6 Tổng hợp cDNA 44 3.4.7 Khuyếch đại ADN 45 3.4.8 Chu trình nhiệt PCR 45 3.4.9 Tinh ADN 45 3.4.10 Định lượng nồng độ WSSV kỹ thuật Real time PCR 46 3.5 Gây nhiễm xác định khả mang WSSV động vật thủy sinh 46 3.5.1 Gây nhiễm WSSV lên động vật thủy sinh hình thức tiêm 47 3.5.2 Gây nhiễm WSSV lên động vật thủy sinh hình thức ngâm 48 3.6 Gây nhiễm xác định khả lan truyền wssv từ động vật thủy sinh sang sĩ ng àn h KT 3.3 Phân tích xử lý số liệu 50 tiế 3.7 n tct môi trường nuôi 48 4.1 án Phần Kết thảo luận 52 Điều tra trạng vùng nuôi, đánh giá mối nguy liên quan đến tôm 4.1.1 Lu ận nuôi bị bệnh đốm trắng Quảng Ninh, Nam Định Nghệ An 52 Thông tin chung trạng quản lý bệnh đốm trắng tôm nuôi vùng nghiên cứu 53 4.1.2 Xác định yếu tố nguy liên quan đến bệnh đốm trắng tôm chân trắng nuôi vùng nghiên cứu 66 4.2 Nghiên cứu xác định động vật thủy sinh chủ yếu mang WSSV Nghệ An, Nam Định Quảng Ninh 76 4.2.1 Động vật thuỷ sinh nhiễm WSSV thu điều kiện tự nhiên 76 4.2.2 Động vật thủy sinh chủ yếu mang WSSV điều kiện thí nghiệm 82 4.3 Khả lan truyền WSSV từ động vật thủy sinh sang tôm thẻ chân trắng môi trường nuôi 93 4.3.1 Khả lây truyền WSSV từ cáy đỏ sang tôm chân trắng 93 iv 4.3.2 Khả lan truyền WSSV từ tôm sang tôm chân trắng 97 4.3.3 Khả lan truyền WSSV từ tôm gai sang tôm chân trắng .103 Phần Kết luận kiến nghị 108 5.1 Kết luận 108 5.2 Đề xuất .109 Những cơng trình tác giả cơng bố có liên quan đến luận án 110 Tài liệu tham khảo .111 Lu ận án tiế n sĩ ng àn h KT PHỤ LỤC 128 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết đầy đủ AHPND Acute hepatopancreatic necrosis disease ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay GXCC Giáp xác chân chèo HHMBV Hypodermal and haematopoietic necrosis baculovirus IHHVN Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ISH In situ hybridization NNE Nòng nọc ếch PCR Polymerase Chain Reaction PmNOB II Penaeus monodon non-occluded baculovirus II SEMBV Systemic ectodermal and mesodermal baculoviral TEM Transmission electron microscopy WPD WSBV h àn ng sĩ n tiế án Tôm chân trắng Lu ận TCT KT Từ viết tắt White patch disease White spot baculovirus WSD White spot disease WSSV White spot syndrome virus WSVI White spot viral infection XK Xuất YHV Yellow head virus vi DANH MỤC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang Kim ngạch xuất mặt hàng thủy sản qua năm 2014-2016 2.2 Dịch bệnh đốm trắng tôm nuôi nước lợ qua năm 2014-2016 2.3 Tên gọi bệnh đốm trắng tôm virus gây theo thời gian 13 2.4 Danh sách lồi tơm mang virus đốm trắng 22 2.5 Danh sách loài cua mang virus đốm trắng 25 2.6 Danh sách loài thực vật nhiễm virus đốm trắng 28 2.7 Danh sách loài động vật phù du mang virus đốm trắng 29 2.8 Danh sách lồi trùng mang WSSV tự nhiên 31 3.1 Các loài sinh vật thu vùng nghiên cứu 36 3.2 Cặp mồi sử dụng nghiên cứu 37 3.3 Thành phần phản ứng để khuyếch đại ADN 37 3.4 Danh mục kít sử dụng nghiên cứu 38 3.5 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 44 3.6 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 44 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 44 3.8 Chu trình nhiệt giai đoạn trình PCR 45 3.9 Thành phần phản ứng Real time PCR 46 3.10 Yếu tố phân tích mơ tả xác định nguy tiềm 51 4.1 Diện tích ni tơm hộ ni Nghệ An, Nam Định Quảng Ninh 54 4.2 Mực nước trì ao ni tơm 57 4.3 Số lần cấp nước vào ao ni q trình ni 58 4.4 Thời điểm thả giống tôm năm 58 4.5 Nguồn tôm giống thả nuôi hộ vùng nghiên cứu 63 4.6 Mật độ thả tôm giống hộ nuôi 64 4.7 Cỡ tôm giống thả 65 4.8 Hoạt động giảm sốc cho tôm giống thả 66 4.9 Mối quan hệ hoạt động lấy nước vào ao nuôi tôm với bệnh đốm trắng Lu ận án tiế n sĩ ng àn h KT 2.1 xuất ao nuôi 67 vii 4.10 Quan hệ diện tích ni tơm mực nước ao nuôi với bệnh đốm trắng tôm xuất ao nuôi 69 4.11 Quan hệ vùng nuôi xuất bệnh WSSV hoạt động kiểm tra môi trường thường xuyên với bệnh đốm trắng tôm 70 4.12 Mối quan hệ cỡ tôm giống, hoạt động thả tôm xuất sinh vật khác ao nuôi tôm với tôm bị bệnh đốm trắng 71 Thành phần lồi sinh vật xuất vùng ni tơm 73 4.14 Kết phân tích virus động vật thủy sinh 76 4.15 Tên lồi động vật thuộc nhóm giáp xác thu Nam Định 78 4.16 Nồng độ WSSV sử dụng thí nghiệm gây nhiễm 84 4.17 Kết phân tích virus sau gây nhiễm nhân tạo WSSV lên cáy đỏ 87 4.18 Kết xác định thời gian virus nhân lên tế bào động vật thủy KT 4.13 Kết phân tích WSSV cáy đỏ tơm thẻ thí nghiệm xác định ng 4.19 àn h sinh thí nghiệm gây nhiễm 90 khả lan truyền WSSV 94 Kết phân tích WSSV tơm tơm thẻ thí nghiệm xác sĩ 4.20 tiế Kết phân tích WSSV tơm gai tơm thẻ thí nghiệm xác án định khả lan truyền WSSV 103 Lu ận 4.21 n định khả lan truyền WSSV 98 viii PHỤ LỤC 1.1 Phiếu điều tra THÔNG TIN CHUNG Họ tên chủ hộ: Số điện thoại ………………………………………………………………………… Địa chỉ: Thôn: Xã KT Huyện: THÔNG TIN VỀ AO NI àn h Số ao ni: (ao) Tổng diện tích ni: (m2) Bán thâm canh ng Hình thức ni: Thâm canh Khác sĩ Mực nước ao nuôi (m) tiế n Nguồn nước cấp án Trực tiếp từ kênh cấp Có Khơng Lu ận Xử lý nước trước ni: Qua ao xử lý Hóa chất cách xử lý Thời gian thả nuôi: Vụ 1: từ tháng .đến tháng Vụ 2: từ tháng .đến tháng Nếu nuôi vụ lý sao? Mật độ thả: (con/m2) 128 Cỡ giống thả: Lồi tơm thả ni: 10 Con giống: Nguồn giống: Trước thả ni có kiểm dịch khơng? Có Khơng (Nếu có ghi rõ kiểm tra đâu, loại bệnh gì?) KT 11 Trước thả giống có xử lý khơng? àn h Nếu có: Phương thức xử lý nào? ng 12 Các loại thuốc, hóa chất sử dụng q trình ni?, mục đích sử dụng thuốc sĩ tiế n án 13 Loại thức ăn cho tôm ăn Lu ận 11 Trong q trình ni có thay nước khơng? 12 Số lần thay vụ 13 Lượng nước thay lần Có sử dụng lưới lọc khơng? 14 Trong q trình ni thường bắt gặp lồi sinh vật ngồi tơm ni chính? Kể tên: 15 Mương cấp có sinh vật hoang dã diện? Kể tên 129 THÔNG TIN VỀ DỊCH BỆNH 16 Hộ ni có tơm bị chết WSSV khơng? Có Khơng 17 Thời gian chết kéo dài? Giai đoạn tôm chết (thả ? ngày) ………………………………………… KT ……………………………………………………………………………………… àn h ……………………………………………………………………………………… ng 19 Dấu hiệu tơm có tượng chết WSSV (mô tả): sĩ tiế n án 20 Khi tôm nhiễm WSSV, tỷ lệ chết thường bao nhiêu? Lu ận 21 Trước thời gian tơm chết thời tiết có khác thường? Các yếu tố môi trường nhiệt độ nước, pH, S‰, khí độc, khí hậu ? 22 Khi tôm bắt đầu có tượng chết ơng (bà) có sử dụng thuốc để trị bệnh khơng? Hiệu quả? 130 23 Theo ơng (bà) tượng tơm chết WSSV có lây lan hộ khơng? Có Khơng Khơng biết 24 Khi tơm bị chết, lồi giáp xác khác ao (cua, cịng, tơm đất ) có bị chết khơng Có Khơng Khơng biết 25 Theo ơng (bà) WSSV nguyên nhân gây tượng tôm chết hàng loạt? Khơng KT Có tháng vụ khác àn tháng h 26 Sau kể từ tơm nhiễm WSSV, gia đình ni thả lại tơm? ng 27 Nhận định chủ quan, nguồn gốc tôm nhiễm WSSV từ đâu? sĩ tiế n 28, Bệnh WSSV xảy năm gần đây, có xảy ao ni gia án đình, tích dấu (x), ghi rõ tháng mấy? 2014 Lu ận Tên bệnh Vụ WSSV Vụ 2015 Vụ 2016 Vụ Vụ Vụ Ngày tháng .năm Người vấn 131 1.2 Hình ảnh danh mục sinh vật mang virus đốm trắng cơng bố giới DANH MỤC LỒI TƠM MANG VIRUS ĐỐM TRẮNG Farfantepenaeus duorarum Fenneropenaeus indicus KT Farfantepenaeus aztecus h Fenneropenaeus penicillatus Litopenaeus stylirostris ng àn Fenneropenaeus merguiensis Marsupenaeus japonicas Litopenaeus setiferus Lu ận án tiế n sĩ Metapenaeus dobsonii Metapenaeus monoceros Metapenaeus ensis Metapenaeus brevicornis Penaeus penicillatus Penaeus semisulcatus Penaeus chinensis Penaeus duorarum Penaeus merguiensis Penaeus schmitti 132 Penaeus setiferus Penaeus aztecus Trachypenaeus curvirostris Alpheus lobidens Alpheus brevicristatus Alpheus sp Callianassa sp n sĩ ng àn h KT Solenocera indica Parapenaeopsis stylifera án Lu ận Exopalaemon orientalis tiế X Macrobrachium rosenbergii Palaemon adspersus X Macrobrachium idella Macrobrachium lamerrae Exopalaemon carinicauda Panulirus homarus Panulirus longipes Panulirus ornatus 133 Panulirus polyphagus Panulirus versicolor Scyllarus arctus Astacus astacus Astacus leptodactylus Cherax destructor Cherax quadricarinatus Pacifastacus leniusculus Lu ận Procambarus clarkii án tiế n sĩ ng àn h KT Panulirus penicillatus Acetes sp Metapenaeus elegans Orconectes limosus Orconectes punctimanus X Aristeus sp Metapenaeus affinis 134 Heterocarpus sp Palaemon styliferus X Solenocera crassicornis Seranopsis longipes Solenocera choprai Trachypenaeus curvirostris Squilla mantis Farfantepenaeus brasiliensis Lu ận án tiế n sĩ ng Farfantepenaeus paulensis àn h KT Penaeus canaliculatus 135 Macrobranchium nipponense DANH MỤC LOÀI CUA NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Callinectes sapidus Callinectes arcuatus Uca arcuata KT Calappa philarigus Cancer pagurus n sĩ ng àn h Atergatis integerrimus Charybdis annulata Charybdis feriatus Charybdis granulata Charybdis japonica Charybdis lucifera Charybdis natator Charybdis cruciata Charybdis hoplites Lu ận án tiế Carcinus maenas 136 Charybdis riversandersoni Charybdis feriatus X X Charybdis natatus Demania splendida ng àn h KT Charybdis granulata Charybdis cruciate Lio puber Gelasimus marionis nitidus Halimede ochtodes Helice tridens Liocarcinus depurator Liocarcinus puber Lu ận Grapsus albolineatus án tiế n sĩ Doclea hybrida Liagore rubronaculata X Lithodes maja Macrophthalmus sulcatus 137 Matuta miersi Metapograpsus messor X X Paratelphusa hydrodomous Paratelphusa pulvinata sĩ ng X àn h Paradorippe granulate Menippe rumphii KT Matura planipes Parthenope prensor Podophthalmus vigil Lu ận án tiế n Phylira syndactyla Portunus pelagicus Portunus sanguinolentus Pseudograpsus intermedius Scylla serrata Scylla olivacea X Sesarma oceanica 138 X Somanniathelpusa tranquebaricca Thalamite danae KT Scylla paramamosain Lu ận án tiế n sĩ ng àn h Uca pugilator 139 DANH MỤC LOÀI THỰC VẬT PHÙ DU NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Alexandrium minutum Isochrysis zhanjiangensis sĩ Heterosigma akashiwo Scrippsiella trochoidea Lu ận án tiế n Platymonas subcordiformis ng àn h KT Alexandrium tamarense Isochrysis galbana Skeletonema costatum Dunaliella salina 140 Chlorella sp DANH MỤC LOÀI ĐỘNG VẬT PHÙ DU NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Branchiopoda Artemia franciscana n sĩ ng àn h KT Branchiopoda cladocera Acartia clause Nitocra sp Brachionus urceu Brachionus plicatilis X Lu ận án tiế Chaetognata Schmackeria dubia 141 DANH MỤC LỒI CƠN TRÙNG, GIUN NHIỀU TƠ VÀ NHUYỄN THỂ NHIỄM VIRUS ĐỐM TRẮNG Coleoptera Ephydridae Notonecta àn h KT X Dragon nymph Dendronereis spp sĩ ng Ranatra Crassostrea gigas Lu ận Marphysa gravelyi án tiế n X 142 Perinereis sp