Nghiên cứu thiết bị phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bằng atp và ứng dụng trong giám sát vệ sinh thực phẩm

663 i _ ỦY BAN NHÂN DÂN TP HỖ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG BAO CAO NGHIEM THU Dé tai: NGHIÊN CỨU THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA NHANH VI SINH VẬT BẰNG ATP -VA UNG DUNG TRONG GIAM SAT VE SINH THUC PHAM Cø quan chủ trì: Trường DH Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia TP HCM Chủ nhiệm đệ tài: PGS.TS TRAN LINH THƯỚC TP HCM 8/2003 ay MUC LUC PHAN 1: DAT VAN DE 11.M6 DAU 1.2 MUC TIEU 1.3 NỘI DUNG 14 TÓM TAT CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI “ SINH VẬT BANG ATP PHAN 2: VAT LIEU VA PHUGNG PHAP 2.1 VAT LIBU 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 GIỐNG VI SINH VẬT PLASMID sẻ VẬT TƯ, LINH KIÊN CỦA MÁY ĐẾM ÁNH SÁNG DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ HOA CHẤT 2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PHÁT SÁNG VÀ ĐO LƯỢNG ÁNH SÁNG 22.2 LY TRÍCH ATP TỪ TẾ BÀO VÀ ĐỊNH LƯỢNG ATP BẰNG PHẢN wed ỨNG PHÁT SÁNG 2.2.3, XAY DUNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN ¡TUYẾN TÍNH GIỮA MẬT BỘ TẾ BÀO VI SINH VẬT VÀ LƯỢNG ÁNH SÁNG TƯƠNG ĐỐI PHÁT RA es ve (RLU) 2.2.4 DINH LƯỢNG TONG vĩ SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG MẪU SUA 2.2.5 LAY MAU THIT VA MAU BE MAT LO MO HEO 2.2.6 TACH CHIET PLASMID BANG PHUONG PHAP SDS - KIỆM as 2.2.7 ĐIỆN BIẾN NẠP DNA VÀO vi KHUAN E coli 2.2.8 PHAN TICH VECTOR TAI TO HOP BANG ENZYME CẮT 'GIỚI HẠN se 2.2.9 PHẢN ỨNG LOẠI BO NHOM PHOSPHATE 2.2.10 PHAN UNG NOIDOAN DNA NGOAILAI VÀO PLASMID 2.2.11 LY TRICH LUCIFERASE TAI TO HOP RA KHOL TE BAO VI KHUAN Seo 2Ô VÀ THỬ HOẠT TÍNH — 2.2.12, PHAN TICH TONG PROTEIN 2.2.13 NUOI SINH KHOI TE BAO VA CHUAN BI DICH LUCIFERASE TAI TỔ HỢP THÔ cư wo 2] 2.14 TINH CHE LUCIFERASE TAI TỔ HỢP BẰNG SẮC KÝ Al LUC 'GIỮA ION Ni” VÀ POLYHISTIDINE 2222111 ererrrei 22 2.2.15 PHAN TICH PROTEIN BANG DIEN DI TREN GEL POLYACRYLAMIDE CÓ SDS (SDS-PAGE) 2.2.16 ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD PHAN 3: KET QUA VA BIEN LUAN 3.1 THIẾT KẾ VÀ CHẾ TẠO THIẾT BỊ DEM ANH SÁNG e 26 3.1.1 MÔ TẢ CẤU TẠO VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ 3.1.2 KIEM TRA TINH NANG CUA THIET BI 26 35 3.1.2.1 Độ ổn định tín hiệu đo 35 3.1.2.2 Xác định khoảng tuyến tính để định lượng ATP 36 3.1.2.3 Xác định khoảng tuyến tính để định lượng tế bào vi sinh vật 39 3.2 NGHIÊN CỨU CÁC DIEU KIỆN CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NHANH VI SINH VẬT BẰNG PHAN UNG PHAT SANG THONG QUA 3.2.1 KHẢO SAT HAM LUGNG LUCIFERASE, Mg” VA LUCIFERIN THICH HỢP TRONG PHAN UNG PHAT SÁNG s1 eee ¿ 3.2.1.1 Khảo sát lượng luciferase cần cho phần ứng phát sáng 3.2.1.2 Ảnh hưởng lượng Mẹ”? 3.2.1.3 Ảnh hưởng lượng lucif€rin che ereeeeo 44 3.2.2 NGHIEN CUU DIEU KIEN LY TRICH ATP RA KHOI TE BAO VI SINH 3.2.2.1 Khảo sát lượng chat ly trich B/S Extractant cho hiéu qué ly trích cao nha 3.2.2.2 Hiệu ly trích ATP từ tế bao cla chat ly trich n-DTMAB 3.2.2.3 So sánh hiệu ly trích ATP từ tế bào chất ly trích khác 3.2.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI SINH VẬT VÀ LƯỢNG ÁNH SÁNG PHÁT RA _— 39 3.3 ĐỊNH LƯỢNG TẾ BẢO VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG MẪU SỮA, s79 15 v11 50 3.3.1 ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT HIỆN DIỆN TRONG SỮA — 3.4 THÀNH PHẦN CỦA BỘ HOÁ CHẤT TỰ PHỐI TRỘN DÙNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT .- s 62 3.5 CÁC NGHIÊN CỨU ĐĨN ĐẦU: DỊNG HỐ, BIỂU HIEN VA TINH CHE LUCIFERASE TAI TO HGP DUNG CHO BỘ HOÁ CHẤT ĐỊNH LƯỢNG NHANH VI SINH VẬT ĐỰA VÀO ATP e.eee 64 3.5.1 CẤU TRÚC PLASMID THỂ HIỆN LUCIFERASE pQE-30/4c+ 65 3.5.2 CHON DONG VI KHUAN E coli XL1-Blue MANG PLASMID THE HIEN LUCIFERASE pQE- 30luc+ (E coli XL1-Blue/pQE-30luc+) 3.5.3 KIỂM CHỨNG SỰ BIEU HIỆN CUA LUCIFERASE TAI TO HOP BANG HOAT TINH VA BANG DIEN DI TREN GEL POLYACRYLAMIDE BIẾN TÍNH (SDS- PAGE) “ 3.5.4 TĨNH CHẾ LUCIFERASE TAI Tổ HOP PHAN 4: KET LUAN MUC LUC DAT VAN DE 1.1.MỞ ĐẦU Bệnh gây biến thực phẩm, Ở nước tiên chiếm tỷ lệ 1/10 thực phẩm luôn mối lo quan quản lý vệ sinh thực tiến Mỹ, hàng năm có khoảng 24 dân số Ở nước phát triển, ngại nhà sản xuất, chế phẩm người tiêu dùng triệu ca bị bệnh thực phẩm, có diéu kiện vệ sinh nước ta, tỷ lệ mắc bệnh thực phẩm chắn cao nhiều Trong nguyên nhân gây bệnh thực phẩm, vi sinh vật nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc nhiễm bệnh thông qua thực phẩm Người tiêu dùng ngày biết nguyên nhân gây dịch bệnh thực phẩm nên đồi hỏi nhà sản xuất, chế biến thực phẩm phải đảm bảo cung cấp thực phẩm vệ sinh, an toàn, mặt vi sinh vật Do vậy, an toàn, vệ sinh trở thành tiêu chuẩn chất lượng quan trọng thực phẩm giới Hiện nay, để đầm bảo chất lượng quan trọng này, nhà sẵn xuất, chế biến thực phẩm giới chuyển từ việc quần lý chất lượng dựa việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm, sang hệ thống quần lý chất lượng hữu hiệu gọi HACCP (Harzard Analysis and Critical Control Point, tam dich Phân tích mơi nguy Điểm kiểm soát giới hạn) Đây hệ thống quản lý vệ sinh thực phẩm dựa việc phòng ngừa nhiễm vi sinh vật liệu, gây bệnh tất cơng đoạn qui trình sản xuất chế biến, từ nguyên chuẩn bị sắn xuất, trình sản xuất thành phẩm Hiện nay, lĩnh vực chế biến thực phẩm sữa, thịt, bia HACCP tiêu chuẩn để đánh gid thống đấm bảo chất lượng nhà sản xuất chế biến thực phẩm để sản phẩm họ chấp nhận thị trường châu Au, châu Mỹ giới Như vậy, nhà thân thực phẩm phải đạt chất lượng, hệ thống đảm bảo chất lượng sản xuất trở thành tiêu chuẩn để sản phẩm chấp nhận Ở Việt Nam, hầu hết đơn vị sân xuất chế biến thực phẩm chưa xây san dựng hệ thống HACCP, vậy, việc đảm bảo an toàn, chất lượng vệ sinh phẩm chưa chặt chẽ Trong thời gian tới, thị trường mở rộng chung cho tồn khối Đơng Nam Á (ASEAN), tính cạnh tranh chất lượng sắn phẩm triệt để bị Do vay, đơn vị sản xuất chế biến thực phẩm Việt Nam cần chủ động chuẩn để đủ sức cạnh tranh, Xây dựng hệ thống HACCP chế biến thực phẩm khẩu, yêu nhu cầu thiết Đối với lĩnh vực chế biến thủy hải sản xuất hệ thống cầu thiết thực tiễn, thời gian qua, nhiều đơn vị nỗ lực xây dựng hàng thủy HACCP gần thị trường Châu Âu, Nhật Bản, Mỹ chấp nhận san cha Việt Nam Trang Í Để kiểm tra chất lượng vệ sinh vi sinh vật thực phẩm, phương pháp thông dụng đếm số khuẩn lạc Đây phương pháp vi sinh vật truyền thống, kiểm chứng thời gian dài, tin cậy dùng làm phương pháp chuẩn mức quốc gia quốc tế Tuy nhiên phương pháp có số nhược điểm cẩn có người có tay nghề vi sinh vật, tốn thời gian, cần từ đến vài ngày cho kết Vì vậy, phương pháp thường dẫn đến tình việc rồi: tức có biết nguyên liệu, bán thành phẩm khơng đạt chất lượng biết kết quả, nguyên liệu, bán thành phẩm vào thành phẩm q trình sản xuất dừng lại chờ kết phân tích Nói cách khác, phương pháp khơng thích hợp với tính chất phịng ngừa nhiễm vi sinh vật gây bệnh vào thành phẩm hệ thống HACCP Để khắc phục nhược điểm chậm cho kết phương pháp vi sinh vật truyền thống, nhiều phương pháp để kiểm tra vi sinh vật cho kết nhanh nghiên cứu sử dụng Một phương pháp nhanh sử dụng nhiều phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bing ATP Phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật ATP dựa phát sáng sinh học phản ứng luciferin - luciferase đom đóm Phương pháp có ưu điểm ngồi việc dễ thực hiện, cịn cho kết xác, độ nhạy cao vài phút đến vài Do vậy, dùng phương pháp để kiểm tra nhanh chóng nguyên liệu trường, trước nhập kho, kiểm tra tình trạng vệ sinh thiết bị, nhà xưởng trước vào sản xuất, theo đỗi phát nhiễm vi sinh vật sẩn xuất, nhờ có biện pháp xử lý khắc phục Một cách tóm lược, phương pháp công cụ hữu hiệu để kiểm tra giám sát vệ sinh, phòng ngừa nhiễm vi sinh vật vào sản phẩm, nên công cụ hữu hiệu cho chương trình HACCP Phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật ATP sử dụng nhiều bổi nhà sẩn xuất chế biến thực phẩm lớn giới từ năm 1980 Phương pháp định lượng vi sinh vật ATP sử dụng để kiểm tra vi sinh vật nhiều dạng mẫu khác như: chẳng gốc, chủng trình lên men, bùn hoạt tính, nước uống, nước q trình sản xuất, chế biến; dịch từ thể (sữa, nước tiểu, máu ), thực phẩm (thịt, rau, quả, thực phẩm chế biến đông lạnh ); sân phẩm trùng khử trùng (sữa trùng, đỗ hộp ), mỹ phẩm Ở nước ta đáp ứng cho yêu cầu nâng cao chất lượng vệ sinh an toàn thực hội nhập với thị trường giới, yêu cầu xây dựng chương trình phẩm để HACCP đơn vị sản xuất chế biến thực phẩm, phương pháp kiểm tra nhanh ví sinh vật ATP công cụ tất.hữu hiệu Trang Tại Việt Nam, nhà sản xuất, chế biến thực phẩm sữa, bïa, thịt, thực phẩm chế biến xuất khẩu, đỗ hộp , phương pháp dùng để làm công cụ kiểm tra nhanh tổng vi sinh vật nguyên liệu, để giám sát vệ sinh chuyền sẵn xuất, thành phẩm, để xây dựng chương trình ATP Đối với quan quần lý nhà nước, phương pháp dùng để kiểm tra nhanh biện trường tình trạng vệ sinh sở sắn xuất, kiểm tra tiêu vi sinh nước nguyên liệu, nước thải Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp Việt Nam gặp khó khăn thiết bị, hóa chất đắc tiền phí kiểm tra cao (6.000 USD/máy xách tay 23.000 USD/máy phịng thí nghiệm, 240 UST/bộ Kit cho 100 lân kiểm tra) Trong bối cảnh nay, để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng Việt Nam để đưa sản phẩm thực phẩm chế biến nội địa thống thị trường giới nhà sắn xuất Việt Nam cần nhanh chóng thiết lập hệ bảo đầm an tồn vệ sinh thực phẩm mình, xây dựng chương trình HACCP hệ thống chung quản lý chất lượng sản phẩm đơn vị Do việc áp dụng phương pháp kiểm tra nhanh ví sinh vật thay cho phương pháp truyền thống nhu cầu thiết thực tiễn 1.2 MỤC TIEU Để tài "Nghiên cứu thiết bị, phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật bing ATP bị ứng dụng giám sát vệ sinh thực phẩm" nhằm nghiên cứu chế tạo thiết đếm ánh sáng nghiên cứu hóa chất phần ứng phát sáng dùng định lượng vụ vi sinh vật ATP tạo sở để ứng dụng phương pháp vào phục thực tiễn sản xuất Việt Nam 1.3 NỘI DUNG Đề tài Hội đẳng xét duyệt thơng qua với nội dung sau: L Thiết kế chế tạo thiết bị đếm ánh sáng để kiểm tra nhanh ví sinh vật phản ứng phát sáng can ATP Khảo sát điều kiện hoá chất để xác định ATP vi sinh vật Thử nghiệm định lượng ví sinh vật tổng số diện bể mặt thiết bị, nhà xưởng thực phẩm chế biến Trang 1.4 TOM TAT CO SO KHOA HOC CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG ATP Sự phát sáng sinh học Đom đóm phát sáng phản ứng ơxy hóa luciferin enzyme luciferase, có diện ion Mẹ?” cdn ATP theo phần ứng sau: ott luciferase + luciferin + ATP ———— lueiferase - lucifery-AMP +O; ——> luciferase - luciferyl-AMP + PP; luciferase + oxuciferin + AMP + CĨ¿ + Av (560nm) Một phân tử Iuciferin bị ơxy hóa theo phương trình nêu phóng thích quang tử ánh sáng ATP chất tham gia vào phản ứng phát sáng số vào lượng quang tử ánh sáng phát tỷ lệ thuận với số lượng phân tử ATP tham gia lượng ánh phản ứng Trong điều kiện có diện thừa luciferin, luciferase, sáng sinh phản ứng phụ thuộc vào lượng ATP diện phản có ứng Bằng thiết bị có khả đếm lượng ánh sáng phát ra, người ta tương quan thể định lượng lượng ATP dựa vào đường chuẩn thể mối lượng ánh sáng đo lượng ATP Mặt khác, tất tế bào sinh vật chứa ATP có lượng tưởng đối ổn định (lượng ATP trung bình vi sinh vật 0,3fg/tế bào hay 10'g/tế bào) Do vậy, nguyên tắc, định lượng vi sinh vật trị số ATP ly trích khỏi tế bào lượng cách dựa đường chuẩn thể mối tương quan tuyến tính RLU ánh sáng phát đo (do phan ting véi luciferase luciferin) thé pháp (Relative Light Units) va lượng tế bào vi sinh vật (được xác định phương đếm số khuẩn lạc thơng thường) (Hình 1.1) rase Qui trình định lượng vi sinh vật phần ứng phát sáng luciferin-lucife cần ATP eó thể tóm tắt sau: hút huyển phù tế bào sinh vật vào ống đo, ánh tiến hành ly trích ATP khỏi tế bào Đặt ống đo vào buồng đo thiết bị đếm đọc lượng ánh sáng, sau bổ sung hỗn hợp luciferin-luciferase Tiến hành đo (Hình sáng phát hiển thị bing RLU Qui đổi lượng RLU thành mật độ tế bào 1.2) Trang a a ˆ oe " Jog(RLU) > log (CFU/ml) Hình 1.1: Đường tương quan tuyến tính lượng ánh sáng phát mật độ tế bào vỉ sinh vật Ống chứa je huyền phù tế bảo ví sinh vat & EN BS sung chat ly trich ATP Bổ sung hỗn hep fee, h | Phần ứng xây sau bổ sưng hỗn hợp luciferaseluciferin Đặt ống đo { vào buồng đo máy đếm ánh sáng e3 Bảng hiển thị số | ———— RLU máy đếm ánh sáng Boc sé RLU đu Hình 1.2: Qui trình định lượng nhanh sinh vật phân ứng phát sdng luciferase-luciferin can ATP Trang Bang 3.20; Két qua dinh luong vi sinh vat dién trén bề mặt Ký hiệu mẫu RLU¿ Mật độ tế bao vi sinh Mật độ tế bào vi sinh vật xác định vật xác định theo phương pháp theo phương pháp ATP đếm khuẩn lạc 3,3x108 2,8x10” (CFU/100cm?)/ (CFU/100cm?) XMI 0,258 XM3 XM4 XMS XM6 0,544 0,116 1,470 0,035 6,4x10° 1,6x108 16x10’ 5,4x10" 0,329 4,1x108 49x10" INOX2 0,017 2,9x10" 14x10? INOX4 INOXS 0,016 0,019 2,7x10" 3,Ix10” INOX8 0,024 XM2 XM7 XM§ mm XM10 INOX1 INOX3 INOX6 INOX7 INOX9 INOX10 Đối chứng 0,318 0,015 0,284 0,678 0,018 0,013 0,024 0,017 0,066 0,068 4x10° 2,5x10” 3,6x10° 10” 3x10” 2,2x10" 3,5x108 7x10" 2,1x10° 2,5x10° 1,4x10° 5,6x10” 2,8x10” 2,1x108 3,5x10° 7x10? 1,8x10° 1,8x10? 3,8x10" 2,8x10” 4,2x10? 14x10? 108 10° 2,8x10` 4,9x10° 0 3,8x L0” | 2,8x10? 1) suy từ đường chuẩn Hình 3.21 qui vé 100cm? bé mat 3.4 THANH PHAN CUA BO HOA CHAT TU PHOI TRON DUNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VISINH VẬT Từ điểu kiện xác định mục 3.2.1 - 3, tiến hành phối trộn thành phần cần thiết cho phan ting phat sáng sinh học cân ATP thành hoá chất (ki) Việc phối trộn thành kit làm tăng tính linh động phương pháp áp dụng việc định lượng nhanh ATP vi sinh vật Trang 62 - Bộ hoá chất thiết kế dạng hộp 15 x 15 x 9,5 cm (Hình 3.22) điều kiện bảo quản thành phần dẫn cụ thể Mỗi hộp (mỗi bộ) thiết kế cho 80 phần ứng phát sáng bao gôm: 4ml hỗn hợp phẩn ứng phát sáng chứa 400ug luciferase, 2,56mg luciferin, 1,3 mg DTT (dithiothreitol), 16mg BSA (bovine serum albumine), 50mM MgSO, 5mM EDTA Hỗn hợp chứa ống 2ml sậm màu, ống tương đương cho 40 phản ứng phát sáng Hỗn hợp phản ứng phát sáng bảo quản -20°C có giá trị sử dung vòng - tháng Cần tránh việc giải đơng nhiều lần hoat tinh luciferase sé bi gidm sau lần giải đơng Khi có nhu cầu sử dụng, để tan hồn tồn nhiệt độ phịng (khoảng - 10 phút), lắc đều, sau để vào đá giữ đá suốt thời gian sử dụng ˆTmI ATP chuẩn (CiHi,N;OiP2Na;.3H,O) có nồng độ 10” g/rnl (2mM) chứa ống 2ml (ATP hoà tan với dung dịch đệm Tris — succinic 0,1M, pH7,75, ImM EDTA) Bao quản -20°C 1,5ml dung dịch chất ly trích ATP từ tế bào vi sinh vật benzalkonium chloride 0,2% (w/v) Nhiệt độ bảo quần — 8°C 40m] dung dịch đệm Tris - succinic 0,1M, pH 7/75, ImM EDTA Nhiệt độ bảo quản — 8°C 100 que tampon vô trùng cho 100 lần lấy mẫu bể mặt Bảo quản nhiệt độ phòng, nơi khơ giữ kín miệng bao sau sử dụng 01 bảng hướng dẫn sử dụng Trang 63 Hinh 3.21: Thanh phan hoá chất tự phối trộn đàng cho định lượng nhanh ATP Yả vị sinh vật 01: Hộp đựng hoá chất; 02: Lọ đựng dung dịch đệm; 03: Ong đựng hỗn hợp phần ứng phái sắng; 04: Ống đựng ATP chuẩn; 05: Ống dung dung dich ly trich ATP; 06: Bang hudng dan sit dung; 07: Tampon vé tring 3.5 CÁC NGHIÊN CỨU ĐÓN DAU: DONG HOÁ, BIỂU HIEN VA TINH CHE LUCIFERASE TAI TO HOP DUNG CHO BO HOA CHAT ĐỊNH LƯỢNG NHANH VI SINH VẬT DỰA VÀO ATP Như để cập, luciferase thành phần đắc tién phần ứng phát sáng luciferase — luciferin cin ATP Luciferase déng vai trd quan trọng việc định giá thành hố chất, mà lượng sử dụng khơng dẫn rõ ràng Nguễn luciferase tự nhiên chiết tách từ đom đóm tự nhiên yếu loài Phøtinus pyralis (ở Bắc Mỹ Tuy nhiên, với tốc độ thị hố phát triển Trang 64 nơng nghiệp nay, không chi Bắc Mĩ mà giới nguồn đom đóm tự nhiên khơng cịn nguồn cố thể sử dụng lâu dài Chính vậy, nhiều chiến lược trì nguồn đom đóm để cung cấp luciferase triển khai Việc ni đom đóm ý khơng phải giải pháp tối ưu q` trình ni gặp số khó khăn Sự phát triển công nghệ di truyền đưa tới giải pháp khác để chủ động nguồn enzyme luciferase dùng hệ thống vi khuẩn để sản xuất luciferase đom d6m (luciferase tái tổ hợp) Hướng thành công xem tốt ưu giới ˆ tiếp cận Vấn để đặt là: luciferase tự nhiên luciferase tái tổ hợp có khác nhau? Liệu dùng luciferase tái tổ hợp để định lượng nhanh ATP, vi sinh vat? Nhiễu kết nghiên cứu cho thấy cấu hình luciferase tự nhiên luciferase t4i t6 hgp có khác Nhưng hai loại luciferase có động phần ứng, pH tối ưu số thuộc tính khác Từ kết cho thấy việc sử đụng luciferase tái tổ hợp việc định lượng nhanh ATP vi sinh vật khơng có gi rở ngại Vã nhữ vậy, trong lai hứa ẹm giá thành ki ———định lượng nhanh ATP vi sinh vật giảm đáng kể từ mở rộng khả qui mô sử đụng phương pháp định lượng nhanh vi sinh vật ATP Trước tình hình chung giới Việt Nam, nhằm chủ động nguồn luciferase va làm giảm giá thành phương pháp, trình bày kết nghiên cứu đón đầu việc ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vi sinh vật ATP dịng hố gen mã hố luciferase tif dom đóm- vào vi khuẩn E, coli, biểu hiện, chiết tách tỉnh chế luciferase tái tổ hợp 3.5.1 CẤU TRÚC PLASMID THỂ HIỆN LUCIFERASE pQE-30izc+ Nuôi cấy dòng DHSœ/pBiuc+, tách chiết plasmid pBluc+ thu nhận izc+ mô tả 2.2.8 Tiến hành phản ứng nối lzc+ vào pQE-30 mơ tả 2.2.10 Hình 3.23 mô tả bước việc cấu trúc plasmid pQE-30/uc+ Điện biến nạp hỗn hợp phần ứng nối vào E coli XL1-Blue, trai mơi trường LB có bổ sung ampicillin Từ khuẩn lạc thu được, tiến hành chọn lọc dòng E coli XL1-Blue/pQE-30luc+ cn tim Trang 65 Bam bxHis Đam HìndfIL ‘Amp pBluct luce 4642bp Hind{tl Xt ly BamHI, Hindm TS promoter ig imp Tinh ché pQE-30 3400bp ColEL TS promoter —, #ữg Amp —— BamHL lue+ pQE-30lue+ 5057bp CoE Cc) T4 DNA ligase ` Hư Điện biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli XLI-Blue Trãi đĩa tuyển chọn Hình 3.23: Cấu trúc plasmid pQE-30luc+ tạo dòng vi khuẩn E coli XLI-Blue/pQE-30luc+ Trang 66 3.5.2 CHON DONG VI KHUAN E coli XL1-Blue MANG PLASMID THE HIEN LUCIFERASE pQE-30/uc+ (E coli XL1-Blue/pQE-30luc+) Hình 3.24: Két qud tuyển chọn dong E coli XL1-Blue/pQE-30luc+ cắt han ché voi BamHI HindIII 1, thang phân tử lượng Ikbp; 2, sân phẩm cắt plasmid chiết tách từ khuẩn lạc mọc mơi trường LB có bẩ sưng kháng sinh trãi hỗn hợp điện biến nạp; 3, gen luc+ khuấch đại từ plasmid pSP-luc+ với cặp IuBamHI IuHindHI Plasmid pQE-30 xử lí với BamHI HindIIH nối với luc+ sé cấu trúc thành plasmid pQE-30/u„c+ có kích thước 5075bp Khi xử lý plasmid pQE- 30luc+ tré lại với hai enzyme cắt hạn chế cho hai vạch DNA với kích thước tượng ứng khoảng 3419 1656bp Dựa vào kết dự đoán này, chúng tơi tiến hành chọn lọc địng E cøli XL1-Blue/pQE-30iuc+ từ khuẩn lạc mọc môi trường LB có bổ sung ampicilin trãi hỗn hợp điện biến nạp Tiến hành tách chiết plasmid từ khuẩn lạc đơn thu Cắt hạn chế plasmid với BamHI HindlII mô tả 2.2.8 Phân tích gel agarose 1% với thang phân tử lượng với sản phẩm LB có bổ sung với kích thước Ikbp, chúng tơi thu kết Hình 3.24 Giếng số 2, nạp cắt plasmid chiết tách từ khuẩn lạc mọc môi trường ampicillin trãi hỗn hợp điện biến nạp, xuất hai vach DNA khoảng 3400 1600bp Kết qua cho thay cấu trúc vector thể pQE-30/,c+ Blue/pQE-30luc+ đồng vi khuẩn biểu biện luciferase E coñi XLI- Trang 67 3.5.3 KIEM CHUNG SU BIEU HIEN CUA LUCIFERASE TAI T6 HỢP BANG HOAT TINH VA BANG DIEN POLYACRYLAMIDE BIEN TINH (SDS - PAGE) DI TREN GEL Để đánh giá khả biểu luciferase đòng vi khuẩn E coli XLIBlIue/pQE-30/uc+ vừa tạo được, tiến hành xác định hoạt tính luciferase từ dich đồng dịng tái tổ hợp phân tích tổng protein gel polyacrylamide 12,5% với tấc nhân biến tính protein SDS (SDS - PAGE) Tiến hành thử hoạt tính luciferase mô tả 2.2.11 khuẩn lac bat ky cla dong E coli XLIBlue/pQE-30luc+, thu số đơn vị ánh sáng tương đối (RLU) 520, 450 670 Trong đó, trường hợp đối chứng (không cảm ứng với IPTG) khuẩn lạc trên, số RLU đo 2,032, 1,056 1,524 Mặt khác, thực thao tác mô tả 2.2.12, thu kết Hình 3.25 Giếng số 3, nạp với dich tế bào E coli XL1-Blue/pQE-30iuc+ cảm ứng với IPTG, xuất vạch protein rõ có kích thước tương đương với vạch luciferase chuẩn Sigma Trong vị trí, giếng số 4, nạp với dich t€ bao E coli XL1-Blue/pQE-30luct khéng cảm ứng với IPTG, không thấy xuất vạch protein tương ứng Như vậy, từ kết phân tích cho thấy chúng tơi tạo dòng vi khuẩn biểu biện luciferase E coli XLI- Blue/pQE-30luc+ Dong vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm tỉnh chế luciferase tái tổ hợp 94kDa_ 67KDA 43kDa anes > 14kDa_ oe Hình 3.25: Phan tich tong protein trén SDS - PAGE 12,5% 1, thang protein phân tit lượng nh; 2, luciferase chuẩn (Sigma); 3, E coli XLI-Blue/pQE-30luc+ cdm ứng với IPTG; 4: E coli XL]-Blue/pQE-30luc+ khéng cdm ứng với IPTG Trang 68 3.5.4 TINH CHE LUCIFERASE TAI TO HOP Tw dong £ coli XL1-Blue/pQE-30luc+ tạo được, thực thao tấc mô tả 2.2.13 thu 0,8g sinh khối từ 600ml mơi trường LB Tiến hành ly trích luciferase, chạy sắc ký phân đoạn với cột NỈ” - NTA agarose hệ thống AKTA giám sát phẩn mễm Unicorn 3.10 với thông số 2.2.14 Các phân đoạn có hoạt tính luciferase gom lại, tiến hành thử hoạt tính, định lượng protein theo phương pháp Bradford phân tích protein gel SDS ~ PAGE 12,5%, chúng tơi thu kết trình bầy Bảng 3.21 Hình S26 Te két thu Bảng 3.21, thấy tỉnh chế luciferase tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực với đuôi His làm tăng độ lên 23,1 lần với hiệu suất thu hồi 44,59% Như vậy, hiệu suất thu hồi thấp Tổng hoạt tính gidm từ 287.875 đơn vị dịch chiết thơ cịn 128.370 phân đoạn sắc ký, tức 55,41% hoạt tính Sự hoạt tính đáng kể giải thích đuôi histidine bị che nên không tiếp xúc với ion Ni” tương tác Ni” - polyhistidine khơng xẩy Chính điểu làm cho luciferase không giữ lại cột khỏi cột giai đoạn rửa Phân tích SDS - PAGE cho thấy q trình tính chế luciferase tái tổ hợp qua cột Ni” loại bỏ nhiều thành phần protein phức tạp Nhiều vạch protein dịch chiết thô (giếng số 3) bị qua sắc ký (giếng số 4) Trong phân đoạn sắc ký thu vạch luciferase tương ứng với vạch luciferase tỉnh khiết (Sigma) Từ kết trên, kết luận tỉnh chế luciferase tái tổ hợp Bảng 3.21: Kết chiết tách tỉnh chế luciferase tái tổ hợp Tổng = Tổng 1T ống Phân đoạn thể tích (ml) lượng hoạt tính (RLU) rotein _ 35 287.875 634 454062 100 Sắc ký cột N.NỊA lÔ 18370 012 10522142 232 44,59 vm - Hoạt tính | Hồng RLUImg protein) Hiệu suất Độ sạch” — TỬ thu hồi (oo “7 d6 hoạt tính riêng tương đối phân đoạn xét sơ với dịch chiết thơ ban đâu ®/hiệu suất thu hồi luciferase phẩn trăm tương đối hoại tính luciferase phân đoạn xét sơ với hoạt tính ensyme dịch chiết thô bạn đầu Trang 69 o4kDa_, 67kDa_, 23 OF — luciferase 43kDa_y 14kDa, J]†—_ —— Hình 3.26: Phân tích protein SDŠ ~ PAGE 12,5% 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, lucjferase tỉnh khiết (2/úg, Sigma); 3, dịch chiết thô luciferase (Sud dich chiết thô); 4, phân đoạn sắc ký NỈ” - NTA (100ng protein) Như vậy, từ 0,8g sinh khối ban đầu dịng E coli XL1-Blue/pQE-30luc+, chúng tơi thu 4ml dịch trích luciferase tái tổ hợp thơ Bằng sắc ký phẩn đoạn với cột Ni ~ NTA agarose, 0,244mg protein thu với độ tăng 23,2 lần so với dịch chiết thơ ban đâu Phân tích SDS - PAGE, xuất rõ vạch Iuciferase có trọng lượng phân tử với trọng lượng phân tử luciferase chuẩn (Hình 3.26) Trang 70 KET LUAN Tom lại nội dung thực tóm tắt sau: - Đã thiết kế chế tạo thiết bị đếm ánh sáng thu tín hiệu phát sáng ổn định vùng lượng ATP từ 10'! - 10? mole ATP/phắn ứng - Sử dụng thiết bị này, xác định nổng độ A'TP vùng từ 1073 - 10 mole ATP/phẩn ứng số tế bào vùng từ 10? — 10” tế bào/phắn ứng ~ Tín hiệu ánh sáng thu tương đương với 0,2pg ATP 1,5SRLU với thang đo từ 0,001 đến 9999RLU - Đã xác định duc lwgng luciferase, Mg”* va luciferin thich hợp phần ứng phát sáng để làm sở chế tạo hóa chất dùng cho phần ứng định lượng ATP vi sinh vật phản ứng phát sáng - Đã lâm chất ly trích xác định nồng độ thích hợp để ly trích ATP khỏi tế bào vi sinh vật benzalkonium chloride, tao cd sở để định lượng vi sinh vật phần ứng phát sáng - Đã chứng mính xây dựng đường tương quan tuyến tính mật độ tế bao vi sinh lượng ánh sáng phát (RLU) làm sở để định lượng vi sinh vật phần ứng phát sáng - Kết cho thấy định lượng tế bào vi sinh vật diện mẫu sữa hoá chất tự phối trộn - Đã thử nghiệm định lượng tế bao vi sinh vật điện số bể mặt lò mổ heo mẫu thịt heo hoá chất tự phối trộn - Đã tạo hố chất tự phối trộn dịng cho việc định lượng nhanh ATP tế bào vi sinh vật - Đã thành cơng việc dịng hố, biểu tỉnh ché luciferase tái tổ hợp Từ kết thành công này, tạo sở cho việc sắn xuất luciferase tái tổ hợp quy mô công nghiệp, từ làm giảm giá thành phương pháp định lượng nhanh vi sinh vật ATP ứng dụng Việt Nam Trang 71 PHY LUC HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG BỘ HOÁ CHẤT ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT Trang 72 HƯỚNG DẪN Sử DỰNG BỘ HOÁ CHẤT ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT CƠ SỞ KHOA HỌC Sự phát sáng sinh học Bom Dém 1a sy phat sang luciferin bdi enzyme luciferase, có diện phản ứng sau: ““€fE7Z52 oxytuciferin + AMP + PP; + CO, + ánh sáng ATP chất tham gia vào phần ứng phat sáng số lượng quang tử ánh sáng phát tỷ lệ thuận với số lượng phân tử ATP tham gia vào phản ứng Trong điều kiện có diện thừa luciferin, - iuciferase, lượng ánh sáng sinh phản ứng phụ thuộc vào lượng ATP điện phản ứng Bằng thiết bị có khả logfRLU) ATP + D-luciferin + 0, phản ứng ưxy hóa ion Mẹ?” ATP theo đếm lượng ánh sáng phát ra, người ta định lượng lượng ATP đựa vào đường chuẩn thể mối tương quan lượng ánh sáng đo lượng ATP Mật khác, tất tế bào sinh vật sống đếu chứa ATP có lượng tương đối ổn định (lượng ATP trung bình vi sinh vat [8 0,3fgté bao log(CFG/mt) Tình 1: Tương quan tuyến tính giữu số tế bào hay 10!5g/#tế bào) Do vậy, định lượng vi sinh vật trị số ATP dựa đường chuẩn thể mối tương quan tuyến tính vã ánh súng phẩt lượng ánh sáng RLU đo lượng té bao vi sinh vật (được xác định phương pháp đếm số khuẩn lạc thông thưởng) Trong thực tế, để định lượng tế bảo vỉ sinh vật, người ta xây dựng đưởng tương quan tuyến tỉnh phù tế bảo vi sinh vật biết trước mật độ lượng ú: đỗ thị dạng tham khảo) Muốn định lượng tế bào hành ly trích ATP, thực phản ứng phát sáng dựa mật độ tế bảo diện mẫu mật độ tế bào [log(CFt/mÙ] từ huyền sáng tương đối phát [log(RLU)] (nh - Chú vi sinh vật mẫu bất kỷ, tiến vào đường tướng quan xây dựng để qui THANH PHAN CGA BO HOA CHAT Bộ hoá chất bao gồm 80 phản ứng: woe Hỗn hợp phản ứng phát sáng (DTT, BSA, Mg”’, luciferin va luciferase): ống (40 phản ứng/ống) ATP chuẩn (C¡oH„xzO¡aPaNas.3H;O): ống (0,001g) Chất ly trích ATP từ tế bào vi sinh vật: ống (1,5ml) Dung dich dém Tris - succinic 0,1M, pH 7,75, IraM EDTA: lọ (40m) Tampon vơ trùng: gói (100 que) Chú ý: Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu ĐIỀU KIỆN BAO QUAN câu sử Hỗn hợp phản ứng phát sáng giữ -20°C có giá trị sử dụng - tháng, Khi có nước dụng, để tan hồn tồn nhiệt độ phịng (khoảng ~ 10 phút), lắc đều, sau để vào tính hoạt làm lân đá giữ đá suốt thời gian sử dụng Chứ ý: Việc giải đông nhiều luciferase ATP chuẩn giữ -20°C dùng giữ Chất ly trích ATP, dung dịch đệm giữ - 8°C dùng, q trình thí nghiệm nhiệt độ phịng HƯỚNG DAN Sử DỊNG BỘ HỐ CHẤT ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT CÁCH SỬ DỤNG 4.1 Định lượng nhanh ATP l Xây dựng tương quan log (moles ATP) hog(REL0G) Tiến hành pha lỗng bậc 10 eppendorf 1,5ml vơ trùng để tạo huyễn phủ ATP chuẩn có nỗng độ khác bậc 10 Bé sung 150, dung dịch đệm vào ống đo Thêm 50ql dụng dịch phản ứng phát sáng vào đo, hút lên bơm xuống vài lần Đặt ống đo vào buồng đo, nạp nhanh 50ul dung dịch ATP chuẩn vào ống Day nắp buồng đo, nhấn ¬út va doc sé RLU Vẽ đề thị tương quan log(moles ATP) va log(RLU) Đo mẫu xác định lượng ATP Việc đo mẫu thực tương tự, thể tích mẫu đưa vào bù trừ với dung dịch đệm cho ống thể tích phản ứng 200l Te sé RLU, suy log(RLt), đối chiếu đường chuẩn để xác định lượng ATP (moles) có trang mẫu 1.2 Định lượng nhanh vi sinh vật điện bề mặt Xây dựng đường tương quan mật độ tế bao vi sinh vat log (CFG/mil) log(RL0) Từ dịch huyền phủ tế bảo vi sinh vật biết trước mật độ (được xác định phương pháp đếm xhuẩn lạc), hút 135ul cho vào ống đo Bổ sung thêm 15ul dung dịch ly trích ATP, vortex 15 giây, để yên 45 giây Bổ sung thêm 50ul dung dịch đệm, lắc đều, đặt vào buồng đo Nạp nhanh 50ụ! dung dịch phan ứng phát sáng vào ống đo Đậy nắp buồng đo, nhấn nút đo joc sé RLU Vẽ đường tương quan log(CF(/ml} với log(RLQ) “Xác định số lượng tế bảo vi sinh vật diện bé mặt Đặt khung inox có kích thước 10 x 10 cm lau cồn lên vị trí muốn lấy mẫu Lấy tampon vô trùng thẩm ướt nước cất vô trủng Quẹt lấy sinh khối tế bao vi sinh vật diện bể mặt khung inox Dùng kéo lau cồn, cắt lấy đâu tampon cho vào eppendorf vô trùng Lau khung inox côn, đặt lên vị trí muốn lấy mẫu khác thao tác thực tương tự Bổ sung 700g] nước cất vô trùng vào eppendorf có chứa đầu tampon Vortex mạnh 45 ~ 60 giây Hút 135ul dịch thu cho vào ống đo Bể sung 15ụl dung dich ly trích ATP Vortex 15 giây, để yên 45 giây Bổ sung thêm 50pl dung dich đệm, lắc Đặt vào buồng đo we Nạp nhanh 50i dụng dịch phản ứng vào ống do, day buồng đo, nhấn nút đo đọc số RLU Từ số RL(, qui déi sang log(RLU), đối chiếu đường tương quan log(CFd/m)) log(RLU) để :ác định mật độ tể bào vi sinh vật diện bể mật lấy mẫu HUGNG DAN S¢f DUNG BO HOA CHẤT ĐỊNH LƯỢNG NHANH ATP VÀ VI SINH VẬT a CĐ, múng tampon 4d lại ống đo, xoay mạnh lampon | Nước cất > Ấn tampon lên thảnh ống đo, xoay để vắt tampon Những ớt tampon v6 tring | Quạt bể mặt mong muốn ‡£ \o Thêm chất ly trich ATP trộn nhanh Lập tức thêm dụng dich hản ứng, trận đặt vào buồng đa LT Doc anh sang phat (RL) Hình 2: Qui trình định lượng tế bão vi sinh vật hign dign trén bé mit Mọi diết, xu liên hệ: vt PTN Cơng nghệ Sình học phản tử Trường ĐH, Khoa học tự nhiềm g 327 Nguyễn Văn Cũ Q5, Tp, Hỗ Chí Minh & Bign thogi: U4-8307079 Exuit: mbtech @hemuns.eduvn % te "4 % oY