Tạo chủng bacillus subtilis biểu hiện peptide kháng khuẩn thuộc họ cecropin và thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TẠO CHỦNG Bacillus subtilis BIỂU HIỆN PEPTIDE KHÁNG KHUẨN THUỘC HỌ CECROPIN VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh học Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Trần Quốc Tuấn Các thành viên tham gia: TS Lê Thị Thúy Ái TS Đinh Minh Hiệp TS Nguyễn Quỳnh Anh TS Nguyễn Hoàng Chương ThS Đinh Thị Lan Anh ThS Nguyễn Thị Hiền Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 ỦY BAN NHÂN DÂN TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ỨNG DỤNG SINH HỌC SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TẠO CHỦNG Bacillus subtilis BIỂU HIỆN PEPTIDE KHÁNG KHUẨN THUỘC HỌ CECROPIN VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 27/12/2018) Chủ nhiệm nhiệm vụ Trần Quốc Tuấn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG SINH HỌC Lê Thị Thúy Hằng TÓMG NGHIÊN CỨU TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG SINH HỌC Độc lập - Tự - Hạnh phúc HCM, ngày … tháng 12 năm 2018 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Tạo chủng Bacillus subtilis biểu peptide kháng khuẩn thuộc họ cecropin thử nghiệm khả kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Cơng nghệ Sinh học Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Trần Quốc Tuấn Ngày, tháng, năm sinh: 02/04/1981 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Điện thoại: Tổ chức 028 38300560 Mobile: 0907837841 Fax: 028.38 350 096 E-mail: trqtuan@hcmus.edu.vn Tên tổ chức công tác: Bộ mơn Sinh hóa – Khoa Sinh học- CNSH – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Tp.HCM Địa tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TP.HCM Địa nhà riêng: C11/23/1 Võ Văn Vân, Vĩnh Lộc B, H.Bình Chánh, TP.HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm nghiên cứu Ứng dụng Sinh học (CRAB) Điện thoại: 08 38295641 ; Fax: 3822 5435 Địa chỉ: 74 đường số 2, Khu dân cư Bình Hưng, Xã Bình Hưng, Huyện Bình Chánh, Tp.Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: ThS Lê Thị Thúy Hằng Số tài khoản: 3713.0.9069003 Kho bạc nhà nước huyện Bình Chánh Tên quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Cơng nghệ TP.HCM II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2018 - Thực tế thực hiện: từ tháng 04/2018 đến tháng 12/2018 - Được gia hạn (nếu có): + Lần từ tháng 04/2018 đến tháng 10/2018 + Lần từ tháng 10/2018 đến tháng 12/2018 : gia hạn báo cáo nghiệm thu Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 560 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 560 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Theo kế hoạch Số TT Thực tế đạt Ghi Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) 06/2016 280 10/2016 280 09/2017 224 10/2017 224 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Số Nội dung TT khoản chi Tổng NSKH Nguồn Thực tế đạt Tổng NSKH khác Trả công lao động 202,3 (khoa thông) học, phổ 202,3 Nguồn khác 202,3 202,3 Nguyên, vật liệu, 280,8 280,8 280,8 280,8 76,9 76,9 76,9 lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác 76,9 Tổng cộng Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: Số Số, thời gian ban TT hành văn Tên văn Ghi Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức Tên tổ chức đăng ký theo tham gia Thuyết minh thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân Tên cá nhân đăng ký theo tham gia Thuyết minh thực Trần Quốc Tuấn Trần Quốc Tuấn Lê Thị Thúy Lê Thị Thúy Nội dung tham gia Quản lý chung; Nội dung nghiên cứu chuyên môn Tuyển chọn tổng hợp nucleotide mã hóa peptide có tiềm kháng vi khuẩn gram âm; Viết báo cáo - Điều tra tạo Sản phẩm chủ yếu đạt Tuyển chọn tổng hợp nucleotide mã hóa peptide Ghi chú* Ái Ái Đinh Thị Lan Anh Đinh Thị Lan Anh Nguyễn Quỳnh Anh Nguyễn Quỳnh Anh Đinh Minh Hiệp Đinh Minh Hiệp Nguyễn Hoàng Chương Nguyễn Hoàng Chương Nguyễn Thị Hiền Nguyễn Thị Hiền liệu lựa chọn peptide có tiềm kháng khuẩn - Nghiên cứu cấu trúc vectror cảm ứng biểu peptide kháng khuẩn - Nghiên cứu thiết lập chủng Bacillus subtilis biểu peptide tái tổ hợp ngoại bào - Viết báo cáo Nội dung nghiên cứu chuyên môn Tuyển chọn tổng hợp nucleotide mã hóa peptide có tiềm kháng vi khuẩn gram âm - Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis biểu peptide tái tổ hợp ngoại bào - Lên men đánh giá hiệu biểu điều kiện nuôi cấy Thu nhận dịch ngoại bào peptide đánh giá ổn định họat tính kháng khuẩn peptide điều kiện pH, nhiệt độ, diện protease Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, Vibrio sp, gây bệnh cá dịch ngoại bào peptide thu nhận Thực nghiệm đánh giá khả bảo vệ cá tra giống (10-15g) tuổi Tuyển chọn tổng hợp nucleotide mã hóa peptide Tạo dịng tế bào Bacillus subtilis biểu peptide tái tổ hợp ngoại bào - Điều kiện lên men Thu nhận dịch peptide đánh giá ổn định họat tính kháng khuẩn MIC loại vi khuẩn khảo sát Dữ liệu kết thử nghiệm đánh giá hiệu - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm, tên tổ chức hợp tác, số điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa (Nội dung, thời gian, kinh điểm ) Ghi chú* phí, địa điểm ) - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Nội dung 1: Tuyển chọn tổng hợp nucleotide mã hóa peptide có tiềm kháng vi khuẩn gram âm Nội dung 2: Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis biểu peptide tái tổ hợp ngoại bào Nội dung 3: Điều kiện nuôi cảm ứng biểu đánh giá sơ Nội dung 4: Thu nhận Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế hoạch đạt 4/2016- 4/20168/2016 8/2016 Người, quan thực Trần Quốc Tuấn ĐH KHTN; Lê Thị Thúy Ái: Khu NNCNC, Đinh Thị Lan Anh: ĐH KHTN 9/201612/2016 9/201612/2016 Trần Quốc Tuấn ĐH KHTN; Lê Thị Thúy Ái: Khu NNCNC, Đinh Thị Lan Anh: ĐH KHTN 1/20174/2017 1/20174/2017 Trần Quốc Tuấn ĐH KHTN; Lê Thị Thúy Ái: Khu NNCNC 5/2017- 5/2017- Đinh Minh Hiệp: Khu NNCNC dịch ngoại bào chứa peptide đánh giá sơ tính kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri điều kiện pH, nhiệt độ có diện protease mơ hình đĩa thạch Nội dung 5: Nghiên cứu thu nhận peptide tái tổ hợp từ dịch ngoại bào Nội dung 6: Thực nghiệm đánh giá khả bảo vệ cá tra giống (10-15g) tuổi mơ hình cho nhiễm vi khuẩn bệnh peptide kháng khuẩn bổ sung với thức ăn qui mơ phịng thí nghiệm 8/2017 8/2017 Nguyễn Quỳnh Anh: KHTN 9/201712/2017 9/201712/2017 Nguyễn Hoàng Chương: KHTN Nguyễn Quỳnh Anh: KHTN 1/20185/2018 9/201812/2018 Nguyễn Thị Hiền: Viện Thủy sản II Viết báo cáo 4/2018 11/2018 Trần Quốc Tuấn ĐH KHTN; Lê Thị Thúy Ái: Khu NNCNC Nghiệm thu đề tài cấp sở 10/2018 12/2018 - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Dòng tế bào vi khuẩn Bacillus subilis Chế phẩm dịch thể chứa peptide kháng khuẩn Đơn vị đo Số lượng 01 ml 10 Theo kế hoạch Biểu tiết ngoại bào peptide thuộc họ cecropin Chứa hàm lượng protein tối thiểu (100mg/ml) có hoạt tính kháng vi khuẩn khảo sát Thực tế đạt Có dòng vi khuẩn biểu tiết ngoại bào peptide Đạt b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Điều kiện nuôi cấy chủng B Subtilis biểu tiết peptide kháng khuẩn ngoại bào Qui trình thu nhận tinh chế peptide Kết thử nghiệm đánh giá hiệu bảo vệ cá tra nuôi bệnh gan thân mủ chế phẩm chứa peptide mục tiêu thu nhận mơ hình phịng thí nghiệm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế đạt hoạch 01 01 01 01 01 01 Ghi Các điều kiện nuôi cấy xác lập (thành phần môi trường, (g/l): 12,4 pepton, 5,1 K2HPO4 rỉ đường, glucose, ammonium citrate, 0,5 uM FeSO4.7H2O, 0,3 MgSO4.7H2O, 0,01 CaCl2 pH môi trường 8,0, tốc độ lắc 250rpm) Quy trình đạt hiệu suất 80% hoạt tính Dữ liệu kết thử nghiệm đánh giá hiệu c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Nghiên cứu thành phần môi trường lên men thu nhận peptide kháng khuẩn tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis DB104 Tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men chủng Bacillus subtilis DB104 thu nhận peptide kháng khuẩn phương pháp đáp ứng bề mặt Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt 01 01 01 01 Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Đã chấp nhận đăng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Đã chấp nhận đăng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Đại học Số lượng Theo kế Thực tế hoạch đạt 02 02 Ghi (Thời gian kết thúc) Lại Nguyễn Minh Thư - 2016 Nguyễn Thị Kim Liên 2017 đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký Kết Thực tế đạt Theo kế hoạch Ghi (Thời gian kết thúc) e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số Tên kết TT ứng dụng Địa điểm (Ghi rõ tên, địa Thời gian nơi ứng dụng) Kết sơ Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Peptide kháng khuẩn xem thành phần kháng khuẩn tự nhiên, có tính chọn lọc khơng tác dụng phụ đến sinh vật chủ Do vậy, peptide kháng khuẩn nhận định có tiềm trở thành hệ kháng sinh diệt khuẩn hệ có phổ hoạt động rộng Đa phần peptide kháng khuẩn sản xuất sử dụng phương pháp tái tổ hợp phương pháp có ưu điểm nhanh, chủ động can thiệp trình sinh tổng hợp sản phẩm dạng có hoạt tính sinh học Vì cho phép thu đủ lượng peptide để đáp ứng nhu cầu cho nghiên cứu chế nghiên cứu phát triển loại thuốc điều trị chống lây nhiễm Việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp lên men thu nhận peptide kháng khuẩn có hoạt tính bước tiếp cận hứa hẹn mở tiềm ứng dụng thực tiễn y học, sản xuất nông nghiệp thủy sản b) Hiệu kinh tế xã hội: Nghiên cứu thiết lập dòng vi sinh vật tổng hợp peptide kháng khuẩn có hoạt tính sở khoa học cho việc ứng dụng kỹ thuật gen thu nhận, sản xuất chế phẩm có hoạt tính sinh học giá thành rẻ phục vụ thực tiễn ứng dụng; Kết nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm đánh giá xây dựng giải pháp ứng dụng trường hợp cụ thể Từ đó, hướng đến hội chuyển giao quy trình sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng thủy sản nông nghiệp Đối chứng âm Đối chứng dương Ta-A1 Ta-A2 Ta-A3 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 Tỉ lệ chết cộng dồn 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 Ngày sau gây nhiễm Hình 2.28 Tỉ lệ chết cá thí nghiệm theo thời gian (ngày) sau gây bệnh thực nghiệm với vi khuẩn E ictaluri Cá nghiệm thức đối chứng âm bên ngồi khơng có dấu hiệu bệnh (hình 2.29a) Dấu hiệu cá bị gan thận mủ: bên ngồi có dấu hiệu điển hình, nghiệm thức chứng dương nghiệm thức cho ăn peptide nồng độ thấp (A2 A3), cá chết có dấu hiệu xuất huyết nhẹ gốc vây, da cá có số đốm đen nhỏ, đường kính 12 mm (hình 2.29) 50 Hình 2.29 Cá tra bị gan thận mủ, dấu hiệu bên (A) cá biểu ngồi cá bình thường; (B): cá bị xuất huyết gốc vây Dấu hiệu bệnh lý: cá tra nhiễm E ictaluri có biểu lờ đờ, khơng có tượng xuất huyết da hậu môn, cá ăn giai đoạn chớm bệnh Ở cá thí nghiệm nhiễm bệnh có biểu đầu, bơi lờ đờ mặt nước Quan sát nội tạng thấy có đốm nhỏ màu trắng đốm hoại tử (Hình 2.30b-d) xuất gan, thận tỳ tạng đặc biệt thận Kết cấy vi khuẩn từ thận lên đĩa BA, ủ 30°C, sau 36 xuất khuẩn lạc đặc trưng E ictaluri (Hình 2.31) Cho đến kết thúc thí nghiệm vào ngày thứ 18, cá nghiệm thức đối chứng âm không xuất cá chết, cá ăn bình thường chứng tỏ thí nghiệm diễn điều kiện tốt Nghiệm thức đối chứng dương cá chết 100% 51 Hình 2.30 Dấu hiệu bên cá tra bị gan thận mủ (A) cá tra bình thường, khơng có dấu hiệu xuất huyết; (B),(C),(D) cá bị gan thận mủ, dấu hiệu xuất huyết nặng, gan, thận lách có đốm trắng Hình 2.31 Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri đĩa thạch BA (A) vi khuẩn cấy từ ống giống; (B) cấy trực tiếp từ dịch thận cá bị gan thận mủ sau gây bệnh thực nghiệm Nhận xét: - Phương pháp gây bệnh sử dụng nghiên cứu phương pháp ngâm với vi khuẩn E ictaluri, ưu điểm phương pháp vi khuẩn thêm vào bể nuôi không tác động đến cá hay gây sốc cho cá phương pháp tiêm hay tắm cá Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp khó kiểm soát tỉ lệ chết tỉ lệ phụ thuộc vào lượng vi khuẩn xâm nhập vào cá khả miễn 52 dịch cá, việc cá chết thải vi khuẩn vào bể nuôi làm tăng thêm nồng độ vi khuẩn gây bệnh cục nguyên nhân khiến cho tỉ lệ chết nghiệm thức có sai số cao Thức ăn bổ sung peptide thí nghiệm cho thấy hiệu bảo vệ cá gây nhiễm với E ictaluri chưa rõ Tuy nhiên, thí nghiệm thăm dò hiệu peptide phòng trị bệnh gan thận mủ, qua thí nghiệm thấy việc trộn peptide với thức ăn chưa thực hiệu Điều dự đốn: kỹ thuật phối trộn phân tử thức ăn thô dẫn đến phân bố không đồng đều; cá nhiểm bệnh khơng ăn nhược điểm phương cách cung cấp peptide đường ăn (dẫn đến không đủ lượng peptide kháng khuẩn bỏ ăn) Do đó, cần thiết phải thực thêm thí nghiệm đánh giá hiệu peptide cá với thay đổi: i/Cải thiện kỹ thuật phối trộn peptide thức ăn; ii/ Thử nghiệm tăng liều peptide bổ sung vào thức ăn; iii/ Thử nghiệm phương cách bổ sung peptide vào môi trường nước nuôi cá CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.1 Kết luận Đề tài thực đầy đủ nội dung đăng ký kết thực nghiệm nhận định sau: - Đề tài tạo thành công chủng Bacillus subtilis amyE::PcotB-cecB cho mục tiêu sinh tổng hợp peptide kháng khuẩn cecropin B ngoại bào có hoạt tính - Thành phần mơi trường tối ưu hóa cho sinh tổng hợp peptide kháng khuẩn từ chủng Bacillus subtilis tạo gồm (g/l): 12,4 pepton, 5,1 K2HPO4 rỉ đường, glucose, ammonium citrate, 0,5 uM FeSO4.7H2O, 0,3 MgSO4.7H2O, 0,01 CaCl2 pH môi trường 8,0 - Thời gian nuôi cấy để thu nhận chế phẩm peptide sau 36 ± - Hoạt tính peptide khơng bị ảnh hưởng nhiều pH thay đổi từ 2,0 đến 9,0 nhiệt độ 25ºC - 55ºC Peptide trì hoạt tính từ 80 – 100% 53 ảnh hưởng protease (proteinase K, pepsin, trypsin bromelain) Như vậy, peptide tồn bền mơi trường đường tiêu hóa - Peptide thu nhận theo phương pháp tủa muối 80% bão hòa phương pháp cho hiệu thu hồi peptide kháng khuẩn với lượng cao Tuy nhiên phương pháp lọc tiếp tuyến cho hiệu thu nhận peptide có tổng hoạt tính tốt phương pháp có khả thi cho nâng cấp quy mơ thu nhận - Peptide kháng khuẩn có hoạt tính đối kháng vi khuẩn kiểm định Vibrio parahaemolyticus Edwardsiella ictaluri Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định Vibrio parahaemolyticus 50 ppm Edwardsiella ictaluri 200 ppm - Mô hình thí nghiệm thăm dị hiệu tác động peptide cá tra giống gây bệnh thực nghiệm cho thấy hiệu bảo vệ peptide thấp chưa rõ 3.2 Kiến nghị Khoa học ứng dụng peptide kháng khuẩn mẻ nhiều tiềm Hiện chưa có nhiều liệu thực nghiệm để hỗ trợ xây dựng giải pháp ứng dụng peptide phòng trị bệnh nhiễm khuẩn đối tượng cụ thể Vì vậy, qua nghiên cứu này, kiến nghị: Cần tiếp tục khảo sát thêm giải pháp ứng dụng peptide (như phương thức gây nhiễm, liều lượng peptide phối hợp với tác nhân có ảnh hưởng khác, …) thực nghiệm đánh giá khả bảo vệ cá tra giống loài thủy sản tác nhân vi khuẩn gây bệnh quan trọng 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phạm Anh Thùy Dương, Tạ Minh Hiếu, Lê Hùng, Võ Thị Thương Lan (2009) Tổng hợp nhân tạo cải biến gen mã cho peptide kháng khuẩn cecropin, Hội nghị tồn quốc Cơng nghệ sinh học phục vụ Nông - Lâm nghiệp, Thủy sản, Công nghiệp, Y - Dược Bảo vệ môi trường, Thái Nguyên, trang 551-554 Ngô Thị Hà cộng (2010) Biểu xác định hoạt tính kháng khuẩn cecropin tái tổ hợp Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội 26, trang 512517 Tài liệu tiếng Anh Andreu D., Merrifield R.B., Steiner H., Boman H.G (1985) N-terminal analogues of cecropin A: synthesis, antibacterial activity, and conformational properties Biochemistry, 24(7), pp 1683–1688 Andreu D., Ubach J., Boman A., Wåhlin B., Wade D., Merrifield R.B., Boman H.G (1992) Shortened cecropin A-melittin hybrids Significant size reduction retains potent antibiotic activity FEBS letters, 296(2) pp 190–194 Argüello-Morales (2001) Antimicrobial peptide activity against dengue virus Advances in Virus Research, 59, pp 23-35 Boman H.G (1994) Cecropins: Antibacterial peptides from insects and pigs Phylogenetic Perspectives in Immunity: The Insect Host Defence Hoffmann, J.A., Janeway, C.A and Natori, S (eds), pp 3-17 Boman H.G (1994) Cecropins: Antibacterial peptides from insects and pigs, Phylogenetic Perspectives in Immunity: The Insect Host Defence Hoffmann, pp 317 Boman H.G (1995) Peptide antibiotics and their role in innate immunity, Annual review of immunology, 13(1), pp.61-92 Boman H.G., Wade D., Boman I.A., Wahlin B., Merrifield R.B (1989) Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids FEBS Lett., 259 pp 103–106 55 10 Box G., Behnken D (1960) Some new three level designs for the study of quantitative variables, Technometrics, 2(4), pp 455-475 11 Brogden Kim A., (2005) Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nature Reviews Microbiology 3(3), pp 238-250 12 Bulet P., Charlet M., Hetru C (2003) “Innate Immunity, Humana Press”, Totowa, pp 89-107 13 Bulet P., Stöcklin R., Menin L (2004) Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates, Immunological Reviews, 198(1), pp 169-184 14 Chalk R., Townson H., Ham P.J, (1995) "Brugia pahangi: the effects of cecropins on microfilariae in vitro and in Aedes aegypti," Experimental parasitology, 80(3), pp 401-406 15 Chen C.W.S (1997) Effects of the anti-bacterial peptide cecropin B and its analogs, cecropins B-1 and B-2, on liposomes, bacteria, and cancer cells, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1336(2), pp 171-179 16 Chen H.M., Chan S.C., Lee J.C., Chang C.C., Murugan M., Jack R.W (2003) Transmission electron microscopic observations of membrane effects of antibiotic cecropin B on Escherichia coli Microscopy research and technique, 62(5), pp 423-430 17 Chen H.M., Wang W., Smith D., Chan S.C (1997) Effects of the anti- bacterial peptide cecropin B and its analogs, cecropins B-1 and B-2, on liposomes, bacteria, and cancer cells Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects,1336(2), pp.171-179 18 Chen W.S.C (1997) Effects of the anti-bacterial peptide cecropin B and its analogs, cecropins B-1 and B-2, on liposomes, bacteria, and cancer cells, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1336(2), pp 171-179 19 Chen X., Zhu F., Cao Y., Qiao S (2009) Novel expression vector for secretion of cecropin AD in Bacillus subtilis with enhanced antimicrobial activity Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53(9), pp 3683-3689 20 Chen Z.M., Li Q., Liu H.M., Yu N Xie T.J., Yang M.Y., Shen P., Chen X.D., (2010) Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged 56 cultures by optimization of medium composition through statistical experimental designs, Applied Microbiology and Biotechnology 85(5) pp.1353 – 1360 21 Chen Z.M., Li Q., Liu H.M., Yu N., Xie T.J., Yang M.Y., Shen P., Chen X.D (2010) Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged cultures by optimization of medium composition through statistical experimental designs, Applied Microbiology and Biotechnology, 85(5), pp 1353-1360 22 Christensen B., Fink J., Merrifield R.B., Mauzerall D (1988) Channel- forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(14), p 5072-5076 23 Díaz M , Venturini E., Marchetti S., Arenas G., Marshall S.H (2012) Intein-mediated expression of cecropin in Escherichia coli Electronic Journal of Biotechnology, 15(2), pp 1-10 24 Dickinson L., Russell V., Dunn P.E (1988) A family of bacteria-regulated, cecropin D-like peptides from Manduca sexta The Journal of Biological Chemistry, 263(36), pp 19424–19429 25 Fink J., Boman A., Boman H.G., Merrifield R.B (1989) Design, synthesis and antibacterial activity of cecropin-like model peptides International journal of peptide and protein research, 33(6) pp 412–421 26 Ghiselli R., Giacometti A., Cirioni O., Mocchegiani F., Orlando F., D'Amato G., Sisti V., Scalise G., Saba V (2004) Cecropin B enhances betalactams activities in experimental rat models of gram-negative septic shock Annals of Surgery, 239, pp 251–256 27 Guo C., Huang Y., Zheng H., Tang L., He J., Xiang L., Liu D., Jiang H (2012) Secretion and activity of antimicrobial peptide cecropin D expressed in Pichia pastoris, Experimental and therapeutic medicine, 4(6), pp 1063-1068 28 Hu H., Wang C., Guo X., Li W., Wang Y., He Q (2013) Broad activity against porcine bacterial pathogens displayed by two insect antimicrobial peptides moricin and cecropin B Molecules and cells, 35(2), pp.106-114 57 29 Hue Nguyen Thi Minh, Alain Durand, Pauline Loison, Jean-Marie Perrier- Cornet, Patrick Gervais, (2011) Effect of sporulation conditions on the resistance of Bacillus subtilis spores to heat and high pressure, Applied Microbial and Cell Physiology, 90(4) pp 1409–1417 30 Hultmark D., Engström Å., Bennich H., Kapur R., Boman H.G (1982) Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae, European journal of biochemistry, 127(1), pp 207-217 31 Juan S., Xin L.Z., Mei B.X., Xia L.F and Qing H.X (2005) Media optimization for the novel antimicrobial peptide by Bacillus sp fmbj224, Chinese Joural of Biotechnology, 21(4), pp 609-614 32 Kong F., Zhong W., Wang H., Cui Y., Li J., Zhao G., Qu J.M (2010) Expression and biological characterization of cecropin P1 from Ascaris in Pichia pastoris Journal of Pathogen Biology 5(2), pp.120-123 33 Laemmli U.K (1970) Cleavage of Structural Proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, pp 680-685 34 Lee J.Y., Boman A., Sun C.X., Andersson M., Jornvall H., Mutt V., Boman H.G (1989) Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A, 86(23) pp 9159–9162 35 Lu X.M., Jin X.B., Zhu J.Y., Mei H.F., Ma Y., Chu F.J., Wang Y., Li X.B (2010) Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in Escherichia coli, Applied Microbiology and Biotechnology 87(6), pp 2169-2176 36 Maloy W.L., Kari U.P (1995) Structure–activity studies on magainins and other host defense peptides Biopolymers, 37(2) pp 105–122 37 Mkrtchyan H., Gibbons S., Heidelberger S., Zloh M., & Limaki H.K (2010) Purification, characterisation and identification of acidocin LCHV, an antimicrobial peptide produced by Lactobacillus acidophilus n.v Er 317/402 strain Narine International Journal of Antimicrobial Agents, 35, 255-260 58 38 Monteiro S.M., Clemente J.J., Henriques A.O., Gomes R.J., Carrondo M.J., Cunha A.E (2005) A Procedure for High-Yield Spore Production by Bacillus subtilis, Biotechnology Progress 21(4), pp 1026−1031 39 Monteiro S.M.S., Clemente J.J., Carrondo M.J.T., Cunha A.E (2014) Enhanced spore production of Bacillus subtilis grown in a chemically defined medium, Advances in Microbiology, 4(8), pp 444-454 40 Ogunbanwo S.T, Sanni A.I., and Onilude A.A (2003) Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1, African Journal of Biotechnology, 2(8), pp 219-227 41 Plackett R.L., Burman J.P (1946) The design of optimum multifactorial experiments, Biometrika, 33, pp 305-325 42 Ramachandran R., Chalasani A.G., Lal R., Roy U (2014) A Broad- Spectrum Antimicrobial Activity of Bacillus subtilis RLID 12.1, The Scientific World Journal Volume, 2014, pp 1-10 43 Sallum U.W and Chen T.T (2008) Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the antimicrobial peptide Cecropin B Antimicrobial Agents and Chemotherapy 52(9), pp 3006–3012 44 Sarmasik A., Warr G., Chen T.T (2002) Production of transgenic medaka with increased resistance to bacterial pathogen Marine Biotechnology, 4(3), pp 310-322 45 Sato H., Feix J.B (2006), Peptide–membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic α-helical antimicrobial peptides Biochimica et Biophysica Acta 1758(9) pp.1245-1256 46 Shi F.Y., Zhu Y.B (2007), Application of statistically-based experimental designs in medium optimization for spore production of Bacillus subtilis from distillery effluent, BioControl, 52(6), pp 845-853 47 Sipos D., Andersson M., Ehrenberg A (1992) The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin P1 in solution, determined by protonNMR European Journal of Biochemistry, 209(1), pp 163–169 59 48 Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G (1981) Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity Nature, 292, pp 246–248 49 Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G (1981) Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity, Nature, 292, pp 246-248 50 Todorov S.D., Dicks L.M (2009) Effect of modified MRS medium on production and purification of antimicrobial peptide ST4SA produced by Enterococcus mundtii, Anaerobe 15(3) pp 65–73 51 Vizioli J., Salzet M (2002) Antimicrobial peptides from animals: focus on invertebrates, Trends in Pharmacological Sciences, 23(11), pp 494-496 52 Wade D., Andreu D., Mitchell S.A., Silveira A.M., Boman A., Boman H.G., Merrifield R.B (1992) Antibacterial peptides designed as analogs or hybrids of cecropins and melittin International journal of peptide and protein research, 40, (5)p 429–436 53 Wade D., Boman A., Wåhlin B., Drain C.M., Andreu D., Boman H.G., Merrifield R.B (1990) All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides, Proceedings of the National Academy of Sciences, 87, pp 4761-4765 54 Wang X., Zhu M., Yang G., Su C., Zhang A., Cao R., Chen P (2011) Expression of cecropin B in Pichia pastoris and its bioactivity in vitro, Experimental and therapeutic medicine, 2(4), pp 655-660 55 Warriner K and Waites W.M., (1999) Enhanced sporulation in Bacillus subtilis grown on medium containing glucose:ribose, Letters in Applied Microbiology, 29(2), pp 97–102 56 Xia L., Liu Z., Ma J., Sun S., Yang J., Zhang F (2013), “Expression, purification and characterization of cecropin antibacterial peptide from Bombyx mori in Saccharomyces cerevisiae”, Protein expression and purification, 90(1), pp 47-54 60 57 Xu X., Jin F., Yu X., Ji S, Wang J., Wang C., Zhang W (2007) Expression and purification of a recombinant antibacterial peptide, cecropin, from Escherichia coli Protein Expression and Purification 53(2), pp 293-301 58 Zhang J., Zhang S., Wu X., Chen Y., Diao Z (2006) Expression and characterization of antimicrobial peptide ABP-CM4 in methylotrophic yeast Pichia pastoris Process Biochemistry 41(2), pp 251-256 59 Zhang Z., Ke T., Zhou Y., Ma X., Ma L (2009) High expression of antimicrobial peptide Cecropin AD in Escherichia coli by fusion with EDDIE Chinese journal of biotechnology 25(8), pp 1247-1253 61 PHỤ LỤC Phụ lục nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Khuếch tán giếng thạch Muller Hinton: Chuẩn bị đĩa thạch đường kính nhau, có độ dày thạch khoảng 2mm Vi khuẩn ủ tăng sinh 16-18 mơi trường Cao thịt pepton Sau pha loãng để đạt giá trị OD610nm khoảng 0,5 Vi khuẩn trải lên bề mặt thạch đến khô Sau đục lỗ giếng thạch có đường kính 5mm kim loại vô trùng Chế phẩm peptide bơm vào giếng khuếch tán agar sau 15-20 phút Đo vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thạch sau ủ 24 37oC Xác định hoạt tính kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn (AU/ml) theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp (Schilliner Rest): Xác định độ pha loãng cao cho thấy vịng vơ khuẩn xác định hoạt tính peptide kháng khuẩn (AU/ml) dịch lên men: AU/ml = DFi x (1/V), AU: đơn vị hoạt tính; Dfi: độ pha lỗng cao có vịng ức chế S.T.Ogunbanwo et al (2003) Môi trường nuôi cấy - Môi trường cao thịt - peptone có thành phần 10 g/l peptone, g/l cao thịt, g/l NaCl - Môi trường TSB: (trytone soya broth) có thành phần 5g/l tryptone soya, 2,5g/l cao nấm men, 10g/l glucose, nước cất vừa đủ 1000 mL - Môi trường TYE (trytone yeast extract): g/l typtone, 2,5 g/l cao nấm men nước cất vừa đủ 1000 mL - Môi trường BHI: (Brain Heart Infusion) - Mơi trường DSM (Difco nutrient broth Sporulation Medium): có thành phần 2g/l KCl, 5g/l MgSO4.7H2O, 1g/l glucose, nước cất vừa đủ 1000 mL chỉnh pH 7,0 thêm 1ml (CaNO3 1M, MnCl2.4H2O 0.1M, FeSO4 1mM) - Môi trường 2xSG: (I): 10,5g/l K2HPO4, 3,5g/l KH2PO4, 0,5g/l NH4Cl, 2g/l glucose, nước cất vừa đủ 1000 mL; (II): 0,1g MgSO4.7H2O, 0,01g 62 FeSO4.7H2O, nước cất vừa đủ 20 mL (III): 0,1g CaCl2, 0,01g MnCl2.4H2O nước cất vừa đủ 20 mL Hấp riêng dung dịch Trộn I, II III - Môi trường TK: (Tham khảo) [5] 10g/l glucose, 1.7g/l ammonium citrate, 11,13g/l peptone,7,2g/l rỉ đường, 1uM FeSO4.7H2O, 0,38g/l MgSO4.7H2O, 4,58g/l K2HPO4, 0,01g/l CaCl2 Thu nhận peptide phương pháp tủa ammonium sulfate Dịch protein thu nhận sau thời gian nuôi cấy vi khuẩn thích hợp Tiến hành tủa theo phương pháp tủa phân đoạn với % muối bão hòa (NH4)2SO4 (40 – 80%) cách 5% phân đoạn Tủa thu nhận ly tâm 15000 vòng/phút 15 phút Hòa tủa đệm Tris-HCl pH7,0 Dịch sau tủa thẩm tách 16-18 để loại muối Xác định hoạt tính hàm lượng protein dịch protein trước tủa sau tủa Chạy điện di SDS-PAGE để xác định kích thức khơng biến tính để xác định hoạt tính Điện di SDS-PAGE kiểm tra kích thước hoạt tính gel - Điện di protein SDS-PAGE thực gel 12,5% polyacrylamide 4% gel gom theo phương pháp mô tả Leammli (1970) - Để thử nghiệm hoạt tính, tiến hành điện di tương tự SDS-PAGE nhiên mẫu không qua bước xử lý nhiệt Sau chạy điện di xong, cắt phần gel chứa peptide áp lên đĩa thạch chứa môi trường cao thịt peptone trải vi khuẩn khảo sát Ủ 37oC 24 Quan sát vùng vô khuẩn Phương pháp xác định hàm lượng protein: sử dụng phương pháp Bradford (Anal Biochem, 1976) Khảo sát khả kháng khuẩn chế phẩm peptide Tăng sinh chủng chủng vi khuẩn khảo sát môi trường thích hợp Sử dụng đĩa 96 giếng, tiến hành pha loãng chế phẩm peptide để đạt nồng độ cuối từ 50 – 1.000ppm Bơm 100 µl chế phẩm vào giếng, thêm vào 100µl thể tích vi khuẩn cần khảo sát Tiến hành với chứng âm môi trường không bổ sung vi khuẩn bổ sung chế phẩm peptide Tiến hành đo OD620 thời điểm đem ủ 370C, cách 60 phút đo lần, thực Tính ΔOD với giá trị OD lúc 0h 63 mẫu dựng đường cong tăng trưởng vi khuẩn Từ xác định nồng độ ức chế tối thiểu mà chế phẩm kháng vi khuẩn mục tiêu 64