Nghiên cứu khả năng và con đường lây nhiễm của chủng aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG VÀ CON ĐƯỜNG LÂY NHIỄM CỦA CHỦNG Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA Mã số: TS01/14-15 Chủ nhiệm đề tài: ThS.Trương Ngọc Thùy Liên Cán thực hiện: ThS Trương Ngọc Thùy Liên ThS Ngơ Thị Bích Phượng KS Lê Văn Hậu KS Trần Văn Hương TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 MỤC LỤC THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI v TÓM TẮT ix I ĐẶT VẤN ĐỀ x II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Aeromonas hydrophila bệnh xuất huyết 2.2 Khả năng xâm nhiễm của A hydrophila 2.2 Protein phát huỳnh quang ứng dụng 2.3 TAC promoter 4 III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu phát huỳnh quang cho nghiên cứu khả lây nhiễm chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila vào cá tra 3.1.1 Tạo vector biểu protein phát huỳnh quang tế bào vi khuẩn 3.1.2 Tạo chủng vi khuẩn phát sáng 7 3.2 Nội dung 2: Khảo sát khả xâm nhiễm chủng A hydrophila hoang dại vào cá tra giống phương pháp ngâm cảm nhiễm 3.3 Nội dung Kiểm tra nhận diện dòng A hydrophila gây bệnh cá tra Việt Nam 10 3.4 Nội dung Thử nghiệm khả xâm nhiễm chủng A.hydrophila hoang dại phương pháp ngâm 11 3.5 Nội dung Quan sát xâm nhập A.hydrophila vào mô phương pháp mô học 11 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 4.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu phát huỳnh quang cho nghiên cứu khả lây nhiễm chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila vào cá tra 14 4.1.1 Tạo vector biểu gen CFP 14 4.1.3 Biến nạp plasmid pJET::TAC-CFP vào E.ictaluri khả nạp phương pháp điện biến nạp 20 4.1.4 Biến nạp plasmid pJET::Km-CFP vào A hydrophila phương pháp điện biến nạp 22 4.2 Nội dung 2: Khảo sát khả xâm nhiễm chủng A hydrophila hoang dại vào cá tra giống phương pháp ngâm cảm nhiễm 23 4.3 Nội dung Kiểm tra nhận diện dòng A hydrophila gây bệnh cá tra Việt Nam 26 4.3.1 Phân tích thơng tin dịng A hydrophila công bố 26 4.3.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhận biết dòng A hydrophila gây bệnh cá 28 4.3.3 Thiết kế mồi dùng cho giải trình tự định danh dịng A hydrophila 32 4.3.4 Phân nhóm định danh chủng A hydrophila gây bệnh cho cá tra Đồng Sông Cửu Long 34 4.3.5 Giải trình tự định danh một số chủng thuộc 2 nhóm 36 4.4 Nội dung Đánh giá độc lực khả gây bệnh số chủng A hydrophila phương pháp ngâm 36 4.5 Nội dung Quan sát xâm nhập A.hydrophila vào mô phương pháp mô học 38 V KẾT LUẬN 40 i VI ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined ii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc nhóm mang màu p-hydroxybenzylideneimidazolinone Hình 2.2 Cấu trúc bậc ba protein GFP Hình 2.4 Hình minh hoạ cấu trúc gen CFP sau PCR Hình 2.5 Hình minh hoạ vector pJET-CFP Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi F_CFP/R_CFP với mẫu pAmCyan1_N1 gel agarose 1% 14 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi FKm_XbaI/RKm_XbaI với mẫu pJET::Km gel agarose 1% 17 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm plasmid pJET::Km cắt enzyme XbaI gel agarose 1% 17 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid pJET ::TAC-CFP enzyme XbaI gel agarose 1% 18 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc biến nạp pJET::TAC-CFP-Km cặp mồi F_pJET1.2/R_pJET1.2 gel agarose 1% 18 Hình 4.9 Khuẩn lạc quan sát đèn UV A Khuẩn lạc E coli DH5α; B Khuẩn lạc E coli DH5α::pJET::TAC-CFP-Km 19 Hình 4.10 Khuẩn lạc E coli quan sát kính hiển vi huỳnh quang A Khuẩn lạc quan sát ánh sáng trắng; B Khuẩn lạc quan sát kính hiển vi huỳnh quang 19 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc biến nạp pJET::TAC-CFP với cặp mồi F_SerC/R_SerC gel agarose 1% 20 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc biến nạp pJET::TAC-CFP với cặp mồi F_pJET1.2/R_pJET1.2 gel agarose 1% 21 Hình 4.13 Khuẩn lạc quan sát kính hiển vi huỳnh quang A Khuẩn lạc quan sát ánh sáng trắng; B Khuẩn lạc quan sát kính hiển vi huỳnh quang 21 Hình 4.15 Hình cá chết ngày đẩu (ảnh trên) sau ngày thứ (ảnh dưới) 25 Hình 4.16 Thơng tin số dịng cơng bố ngân hàng gen (nguồn: NCBI) 26 Hình 4.17 Cây phát sinh loài A hydrophila dựa so sánh genome (nguồn: NCBI) khung màu đỏ dòng A hydrophila gây bệnh cá 28 Hình 4.18 Cấu trúc protein mã hố gen wzz nhóm 29 Hình 4.19 Cấu trúc protein mã hố gen wzz nhóm 30 Hình 4.20 Cấu trúc protein mã hoá gen wzz nhóm 30 iii Hình 4.21 Cấu trúc protein mã hố gen wzz nhóm 30 Hình 4.22 Kết so sánh đoạn trình tự từ sản phẩm 923bp khuếch đại cặp mồi Aho-F/R dịng A hydrophila cơng bố ngân hàng gen 33 Hình 4.23 Hình điện di kết PCR multiplex chủng A hydrophila phân lập An Giang Đồng Tháp năm 2013 34 Hình 4.24 Hình điện di kết PCR multiplex chủng A hydrophila phân lập An Giang năm 2015 35 Hình 4.25 Hình ảnh hiển vi mẫu mô cá nhiễm A hydrophila nhuộm Giemsa 38 Hình 4.26 Mẫu mơ cá khơng cảm nhiễm với A hydrophila nhuộm giemsa quan sát vật kính 100x 39 DANH SÁCH BẢNG - BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.2 Biểu đồ số cá chết tích lũy 24 Biểu đồ 4.3 Biểu đồ tỉ lệ cá chết thử nghiệm khảo sát khả xâm nhiễm chủng A hydrophila hoang dại phương pháp ngâm 37 Bảng 4.1 Danh sách dịng A hydrophila giải trình tự tồn genome 27 iv THƠNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: Nghiên cứu khả đường lây nhiễm chủng Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá tra (Mã số: TS01/14-15) Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: Km 1900, quốc lộ 1A, phường Trung mỹ tây, quận 12, TP HCM Điện thoại:08 37159511 Cơ quan chủ trì: Phịng CNSH Thủy Sản Địa chỉ: Km 1900, quốc lộ 1A, phường Trung mỹ tây, quận 12, TP HCM Điện thoại: Chủ nhiệm đề tài: ThS Trương Ngọc Thùy Liên Phòng CNSH Thủy Sản Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Cán bộ/Nhóm thực hiện: ThS Trương Ngọc Thùy Liên ThS Ngơ Thị Bích Phượng KS Lê Văn Hậu KS Trần Văn Hương Thời gian thực hiện: Từ 3/2014 đến 3/2016 Kinh phí duyệt: 450,000,000 VNĐ Mục tiêu đề tài Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký STT Nội dung đăng ký Tạo chủng A hydrophila E ictaluri phát sáng Thời gian (bắt đầu – kết thúc) 3/2014 – 8/2014 Kết thực - - v Đã thiết kế xây dựng vector biểu gen phát huỳnh quang Đã tạo dòng E ictaluri Đánh giá Đã thực 70% nội dung đăng ký Tuy nhiên, đề tài chuyển hướng nên nội dung không tiếp phát sáng tục Khảo sát khả xâm nhiễm chủng A hydrophila hoang dại cá tra có diện E ictaluri hoang dại 5/2014 – 10/2014 - Đã tiến đánh giá Đạt khả xâm nhiễm A hydrophila cảm nhiễm đơn đồng cảm nhiễm với E ictaluri Phân tích di truyền nhận diên dòng A hydrophila gây bệnh cho cá tra Việt Nam 11/2014 – 1/2015 Đã phân tích liệu Đạt di truyền A hydrophila thiết kế cặp mồi giúp định danh dòng A hydrophila gây bệnh Đã tiến hành phân nhóm 33 dịng A hydrophila giải trình tự định danh dịng Kiểm tra lây nhiễm A hydrophila vào cá phân tích mơ học mẫu cá thử nghiệm ngâm với A hydrophila real-time PCR 2/2015 – 6/2015 - - vi Đã hồn thành thí nghiệm kiểm tra lây nhiễm A hydrophila vào mô cá phương pháp mô học Kết quan sát diện A hydrophila mô cá sau cảm nhiễm ngâm Chưa tối ưu được quy trình real-time PCR để phát A hydrophila mô cá Đã thực 50% nội dung đăng ký Đánh giá khả xâm nhiễm chủng A hydrophila có genome khác 7/2015 – 3/2016 Đã hồn Đạt nghiệm đánh khả xâm nhiễm chủng A hydrophila có genome khác đại diện cho dịng A hydrophila gây bệnh cá tra Việt Nam Sản phẩm đề tài Sản phẩm KHCN dạng kết I, II STT Tên sản phẩm Số lượng Chỉ tiêu kinh tế - kĩ Kết thuật Chủng vi vinh vật mang gen phát sáng Vi khuẩn mang plasmid Tạo chủng có protein phát huỳnh E ictaluri mang quang gen CFP Phương pháp lây nhiễm A hydrophila vào cá tra qua đường ngâm Phương pháp chuẩn bị vi Như trình bày khuẩn, nồng độ vi khuẩn, phương thời gian ngâm cá, cách pháp theo dõi, chăm sóc cá q trình thí nghiệm Phương pháp kiểm Quy trình cách thức thu mẫu, cách xử lý mẫu, phương pháp nhuộm mẫu, quan sát; phương pháp real-time pcr kiểm tra mật độ vi khuẩn mẫu tra lây nhiễm A.hydrophila vào cá vii Phương pháp mơ học trình bày phần phương pháp Sản phẩm KHCN dạng kết III, IV STT Tên sản phẩm Số lượng Bài báo đăng 1-2 tạp chí khoa học báo cáo hội nghị Hướng dẫn sinh 2-3 sinh viên đại học sau viên đại học thực đề tài nghiên cứu Chỉ tiêu kinh tế - Kết kĩ thuật Được chấp nhận Tham gia trình bày Poster đăng tải tạp hội nghị AFOB 2016 chí khoa học hay Huế hội nghị chuyên ngành nước Hướng dẫn sinh viên trường ĐH Công Nghệ thực phẩm thực đồ án tốt nghiệp 1- Khâu Đăng Quang 2- Nguyễn Chí Tâm 3- Nguyễn Ngọc Kiên viii TÓM TẮT Đề tài tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả xâm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila vào cá tra phục vụ cho quy trình sản xuất vaccine ngâm ngừa bệnh xuất huyết cho cá tra Trên sở nghiên cứu nhiều tác giả trước kết luận vai trò tác nhân gây bệnh thứ cấp A hydrophila, đề tài đề xuất sử dụng marker phát huỳnh quang để đánh dấu A hydrophila theo dõi đường vi khuẩn vào thể cá có khơng có diện Edwardsiella ictaluri, tác nhân gây bệnh gan thận mủ cho tác nhân dẫn đường cho A hydrophila Với mục đích sử dụng chủng vi khuẩn có khả phát huỳnh quang khác để thay cho thí nghiệm hóa mô miễn dịch, chủng vi khuẩn E ictaluri A hydrophila biến nạp với plasmid mang gen phát huỳnh quang xanh Vector biểu gen phát huỳnh quang CFP với promoter TAC biểu mạnh tế bào vi khuẩn thiết kế xây dựng Sau điện biến nạp, có chủng vi khuẩn E ictaluri phát huỳnh quang thu nhận Đối với chủng A hydrophila, chưa có phương pháp thích hợp để tạo chủng chuyển gen với plasmid thiết kế Tuy nhiên, sau đánh giá khả lây nhiễm cá phương pháp ngâm với chủng vi khuẩn A hydrophila có độc lực cao cho kết làm thay đổi hoàn toàn giả thuyết A hydrophila tác nhân gây bệnh hội Những thí nghiệm cho thấy đa dạng kiểu gen A hydrophila, đa dạng khả gây bệnh vật chủ khác Do vây, không tiếp tục nghiên cứu theo hướng A hydrophila tác nhân gây bệnh hội mà phát triển theo hướng chứng minh tác nhân gây bệnh khởi phát Các chủng A hydrophila gây bệnh cá tra tỉnh đồng song Cửu Long phân lập phân tích kiểu gen Hầu hết chủng thuộc hai nhóm có kiểu gen chung nhóm I có kiểu gen tương đồng với chủng vi khuẩn gây dịch bệnh cá chép Trung Quốc (có ký hiệu genebank J1) nhóm II, nhóm gây đại dịch cá da trơn Mỹ (có ký hiệu ML 09-119) Hai nhóm vi khuẩn có kiểu gen hồn toàn khác với vi chủng chuẩn A hydrophila (ATCC1966) vùng O-antigen cluster Hai nhóm vi khuẩn có khả gây chết cá với phương pháp ngâm với LD50 vào khoảng 105-106 cfu/ml có khả xâm nhiễm trực tiếp vào cá tra mà không cần tác động môi trường chủng vi khuẩn khác Các thí nghiệm đồng cảm nhiễm A hydrophila với chủng gây bệnh E ictaluri, cho thấy diện vi khuẩn E ictaluri không làm tăng thêm khả xâm nhiễm A hydrophila Mặt khác kết mô học cho thấy vi khuẩn A hydrophila xâm nhiễm thơng qua mang mơ vịm họng Tuy nhiên để chứng minh cách thuyết phục cần thêm số thí nghiệm bổ sung ix Độ đặc hiệu mồi kiểm tra ứng dụng Primer-BLAST, kết cho thấy, cặp mồi bắt cặp với gen hemolysin (hay gọi aerolysin) Aeromonas hydrophila cho sản phẩm dài 191 bp Tổng cộng 55 trình tự mà cặp mồi bắt cặp, có dịng A hydrophila giải trình tự genome, gồm có: ATCC 7966, AH10, JBN 2301, NJ-35, J-1, AL09-71, pc104A, ML09-119, AL06-06 Dựa danh sách dòng giải trình tự tồn genome dòng bao gồm tất dòng gây bệnh cá công bố Cặp mồi thiết kế từ năm 2013 dùng để phát A hydrophila đợt phân lập mà nhóm nghiên cứu thực đề tài Trung tâm từ năm 2013 đến Tiếp theo, để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho dòng nhóm dịng A hydrophila gây bệnh cho cá, cần tìm trình tự đặc trưng cho dịng nhóm Dựa sâu phân tích thơng tin di truyền dịng, chúng tơi nhận thấy gen wzz, hay cịn gọi gen mã hố protein tyrosin-protein kinase quy định độ dài chuỗi O-antigen bề mặt tế bào, có đặc trưng cho nhóm Cụ thể chúng tơi xác định dạng protein mã hoá gen wzz nhóm sau: - Nhóm gồm dịng: ATCC7966, J1 NJ35 Trong đó, ATCC dịng xác nhận dùng trình tự đối chiếu cho dịng A hydrophila giải trình tự , J1, NJ35 Hình 4.18 Cấu trúc protein mã hoá gen wzz nhóm - Nhóm gồm dịng: ML09-119, AL09-71 pc104A Trong pc104A khơng phân lập từ cá bệnh phân lập từ bùn ao cá địa điểm với dòng lại (Janda et al 2014; Pridgeon et al 2014; Tekedar et al 2013) Genome dịng gần khơng có khác biệt lớn 29 Hình 4.19 Cấu trúc protein mã hố gen wzz nhóm - Nhóm dịng AH10 Hình 4.20 Cấu trúc protein mã hố gen wzz nhóm - Nhóm dịng AL06-06 Hình 4.21 Cấu trúc protein mã hố gen wzz nhóm 30 Dịng cịn lại nhóm gây bệnh cá JBN2301 chúng tơi chưa tìm thấy thơng tin gen wzz chủng nên tạm thời phân tích nhóm kể Dựa trình tự gen wzz nhóm trên, chúng tơi thiết kế mồi đặc hiệu cho nhóm Các cặp mồi có trình tự sau: Nhóm 1: NJ35WF1: 5’- AATATGCCCTTGATCGAGAC -3’ NJ35WR1: 5’- CCACTATTCCCTATTCCAGC -3’ Độ dài sản phẩm 679 bp NJ35WF2: 5’- GACAACAGCAAGGTGACATC- 3’ NJ35WR2: 5’- TGGACGTTGGTGGATTGTAA-3’ Độ dài sản phẩm 483bp Nhóm 2: AL09-71WF1: 5’- ACAATCGTAACCCCCAACAT-3’ AL09-71WR1: 5’- GCGGGTTGGATATAGTTTGC-3’ Độ dài sản phẩm 345 bp AL09-71WF2: 5’- AATCCCAGCAACAGCAAATG-3’ AL09-71WR2: 5’- GTTATTCCTAACCAGTGGGC-3’ Độ dài sản phẩm 129 bp Nhóm 3: AH10WF1: 5’-TGAGCGTCTGATCACTGTTG-3’ AH10WR1: 5’-TGGAACAGCAGAAGAGCAAG-3’ Độ dài sản phẩm: 522 bp AH10WF2: 5’-TCCCTTGTTCAGGAGGTTGA-3’ AH10WR2: 5’-GTTTACGAGAGCCGTACCAC-3’ Độ dài sản phẩm: 351 bp Nhóm 4: AL0606WF1: 5’- CGGATTTCAGCAAGGTCAGT- 3’ AL0606WR1: 5’- AGCAACAGTTGACGAGAAGG- 3’ Độ dài sản phẩm 255 bp 31 AL0606WF2: 5’- CCTTCCAAAGAGACACGCTT- 3’ AL0606WR2: 5’- CGATAAGAAGGGGGAGGAGT- 3’ Độ dài sản phẩm 444 bp Các cặp mồi có độ đặc hiệu cao cho nhóm 4.3.3 Thiết kế mồi dùng cho giải trình tự định danh dịng A hydrophila Cặp mồi dùng để giải trình tự định danh dịng A hydrophila cặp mồi cần phải thoả mãn yêu cầu: - Bắt cặp với tất dòng cần giải trình tự Vùng gen khuếch đại cặp mồi có trình tự khác biệt dịng khác Trong q trình phân tích so sánh trình tự genome dịng A hydrophila trên, chúng tơi nhận thấy vùng gen mã hố O-antigen vùng gen có tính bảo tồn cao lồi, từ thiết kế mồi cho hầu hết dòng A hydrophila Mặt khác, vùng gen có trình tự có phân hóa cao dịng Nếu giải trình tự vùng gen định danh nhóm dịng Từ đó, thiết kế cặp mồi Aho-F/R giúp khuếch đại vùng gen Aho-F: 5’ TGGTTATCCAGATACCACTG 3’ Aho-R: 5’ CTCGACAAACTCACCTATGC 3’ Khi so sánh đoạn trình tự khuếch đại cặp mồi Aho-F/R dòng A hydrophila có kết hình 4.22 Cặp mồi với cặp mồi thiết kế nội dung 4.3.2 dùng cho trình nhận diện dòng A hydrophila phân lập từ cá bệnh Đồng Sơng Cửu Long 32 Hình 4.22 Kết so sánh đoạn trình tự từ sản phẩm 923bp khuếch đại cặp mồi Aho-F/R dịng A hydrophila cơng bố ngân hàng gen 33 4.3.4 Phân nhóm định danh chủng A hydrophila gây bệnh cho cá tra Đồng Sơng Cửu Long Các dịng A hydrophila từ đợt phân lập năm 2013 Gồm có dịng phân lập An Giang 10 dòng phân lập Đồng Tháp Tiến hành PCR multiplex với cặp mồi sau: Mồi nhóm 1: NJ35WF1/R1, kích thước sản phẩm 679 bp Mồi nhóm 2: AL0971F1/R1, kích thước sản phẩm 354 bp AL0971F2/R2, kích thước sản phẩm 129 bp Kết chủng cho băng kích thước khoảng 679 bp chủng thuộc nhóm chủng cho băng 354 bp 129 bp chủng thuộc nhóm Hình 4.23 Hình điện di kết PCR multiplex chủng A hydrophila phân lập An Giang Đồng Tháp năm 2013 Kết qủa cho thấy đợt phân lập có 17/18 chủng thuộc hai nhóm 2, có chủng thuộc nhóm (cho băng kích thước khoảng 679 bp) chủng thuộc nhóm (cho băng khoảng 129 354 bp) Các chủng Aeromonas hydrophila đợt phân lập năm 2015 34 Gồm có 21 chủng phân lập An Giang năm 2015 Tiến hành PCR multiplex với cặp mồi sau: Mồi nhóm 1: NJ35WF1/R1, kích thước sản phẩm 679 bp Mồi nhóm 2: AL0971F1/R1, kích thước sản phẩm 354 bp Hình 4.24 Hình điện di kết PCR multiplex chủng A hydrophila phân lập An Giang năm 2015 Kết đợt phân lập có 16/21 chủng thuộc nhóm 2, có chủng thuộc nhóm chủng thuộc nhóm 35 Các chủng âm tính với cặp mồi nhóm nhóm đợt phân lập (6/39 chủng) tiếp tục kiểm tra PCR với cặp mồi nhóm 3, nhóm mồi giải trình tự Aho-F/R cho kết âm tính Có thể kết luận, chủng khơng thuộc dịng gây bệnh cho cá mà q trình thiết kế mồi chúng tơi nhắm đến 4.3.5 Giải trình tự định danh số chủng thuộc nhóm Tiến hành giải trình tự dòng A hydrophila bao gồm: WT2-2014, WT1-2015, WT2-2015 Kết giải trình tự lần khẳng định tương đồng chủng phân lập Việt Nam với nhóm: + Nhóm 1: chủng WT1-2015 cho kết blast tương đồng 99% với nhóm A hydrophila NJ- 35, A hydrophila J-1 + Nhóm 2: chủng WT2-2015, WT2-2014 cho kết blast tương đồng 100% với nhóm A hydrophila ML09-119, A hydrophila pc104A, A hydrophila AL09-71 Cặp mồi Aho-F/R sử dụng nội dung định danh đề tài cấp thành phố “Tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến thử nghiệm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch cá tra giống” ThS Vũ Thị Thanh Hương làm chủ nhiệm Đề tài giải trình tự chủng A hydrophila phân lập từ mẫu cá bệnh Cần Thơ, Tiền Giang, Bến Tre An Giang năm 2014, kết chủng thuộc vào nhóm kể Từ kết cho thấy, vùng nuôi cá tra tỉnh ĐB SCL có diện nhóm A hydrophila gây bệnh cho cá có genome tương đồng với nhóm gây trận dịch bệnh lớn Trung Quốc (nhóm 1) Mỹ (nhóm 2) Hai nhóm chiếm đa số số dòng A hydrophila phân lập cho thấy nhóm gây bệnh quan trọng cho cá tra Việt Nam 4.4 Nội dung Đánh giá độc lực khả gây bệnh số chủng A hydrophila phương pháp ngâm Với kết có nội dung 3, tiến hành thử nghiệm khả xâm nhiễm (gây chết cá) chủng A hydrophila WT1-2015 WT2-2015 đại diện cho nhóm A hydrophila gây bệnh cho cá tra Việt Nam Ngoài ra, chúng tơi cịn bố trí thêm nghiệm thức thử nghiệm chủng WT2-2014 chủng sử dụng nội dung vào năm 2014 36 100% 90% 74.7% 80% 70% 60.0% 60% 50% 40% 33.3% 33.3% 30% 20% 12.0% 10% 13.3% 9.3% 8.0% 1.3% 0% WT2-2014 Control 0% WT1-2015 WT2-2015 10^4 10^5 10^6 Biểu đồ 4.3 Biểu đồ tỉ lệ cá chết thử nghiệm khảo sát khả xâm nhiễm chủng A hydrophila hoang dại phương pháp ngâm Theo biểu đồ 4.3 cho thấy với nồng độ vi khuẩn từ 104 cfu/ml trở đi, hai chủng vi khuẩn gây chết cá tỷ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn sử dụng để ngâm :12%, 33,3% 74,7% cho chủng vi khuẩn nhóm I (WT1-2015) 8% 33,3% 60% cho nhóm II Với LD50 chủng thí nghiệm tính 5,43*105 cfu/ml 4,25*105 cfu/ml, kết luận hai chủng có độc lực tương đương Tuy nhiên chủng WT2-2014 chủng sử dụng nội dung sau thời gian lưu trữ năm, độc lực có thay đồi Nếu thời điểm phân lập, chủng có độc tính tương đương với chủng WT1-2015 WT2-2015 sau năm, độc lực giảm mạnh Tuy thử nghiệm thí nghiệm khác nhau, dựa kết phần thấy giảm sút độc lực A hydrophila trữ lâu phịng thí nghiệm Điều nguyên nhân dẫn tới A hydrophila cho loại vi khuẩn gây bệnh thứ yếu 37 4.5 Nội dung Quan sát xâm nhập A.hydrophila vào mô phương pháp mô học E Hình 4.25 Hình ảnh hiển vi mẫu mơ cá nhiễm A hydrophila nhuộm Giemsa (A)(B) (C): mang (D), (E) :vịm họng với chụp kính hiển vi 10X100, kèm theo độ phóng đại khác hình ảnh 38 B Hình 4.26 Mẫu mơ cá khơng cảm nhiễm với A hydrophila nhuộm giemsa quan sát vật kính 100x A Mẫu vịm họng B Mẫu mang Quan sát hình 4.25, mẫu mang cá vòm họng say cảm nhiễm với A hydrophila cho thấy diện vi khuẩn có dạng tương đồng với vi khuẩn A hydrophila bên mơ cá Hơn nữa, lớp cắt phía mang cá (hình 4.25 B) cịn cho thấy diện vi khuẩn phía tế bào Trong đó, mơ khơng gây nhiễm khơng tìm thấy diện vi khuẩn (hình 4.26) Sự khác rõ rệt mẫu cá có cảm nhiễm khơng cảm nhiễm với A hydrophila cho phép kết luận bước đầu khả xâm nhập A hydrophila vào mơ cá Bên cạnh đó, vịm họng mang cá quan tiềm mà thông qua A hydrophila xâm nhiễm vào cá Tuy nhiên, kết bước khởi đầu cần kiểm chứng phương pháp khác Ban đầu đề tài dự kiến sử dụng phương pháp real-time PCR để khẳng định diện A hydrophila mô cá tiến hành gặp phải số khó khăn sau: - Sự diện phổ biến A hydrophila môi trường nước làm sai lệch kết - Số lượng vi khuẩn xâm nhập vào mô giai đoạn đầu thấp, khó phát - Chưa hồn thiện phương pháp ly trính DNA vi khuẩn mô cá, đặc biệt số lượng vi khuẩn q Vì vậy, để ứng dụng real-time PCR cho nội dung cần có điều chỉnh định thời điểm thu mẫu, phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu tối ưu hố quy trình real-time Hoặc đề xuất phương pháp khác để hoàn thiện nội dung 39 V KẾT LUẬN 1- 2- 3- 4- Đề tài thiết kế xây dựng vector biểu protein phát huỳnh quang cho vi khuẩn, đồng thời tạo vi khuẩn E ictaluri phát sáng huỳnh quang màu lục lam Tuy sản phẩm chưa ứng dụng trực tiếp cho đề tài, nhiên có tiềm phục vụ cho nghiên cứu khác cần sử dụng marker đánh dấu vi khuẩn tương lai Đề tài thu nhận, đánh giá kiểu gen, độc lực chủng vi khuẩn A hydrophila gây bệnh cá tra vùng đồng sơng Cửu Long Hầu hết chủng A hydrophila thuộc hai nhóm có kiểu gen hồn tồn khác vùng O-antigen cluster Hai nhóm có độc lực cao tương đương Đây kết quan trọng hỗ trợ cho nghiên cứu thử nghiệm đánh giá khả bảo hộ vaccine A hydrophila dòng gây bệnh khác Kết quan trọng đề tài chứng minh khả gây bệnh khởi phát A hydrophila cá tra Kết giúp đánh giá mức tác hại A hydrophila hết định hướng phát triển phương pháp chủng ngừa cho vaccine sống nhược độc kháng bệnh xuất huyết cho cá tra Con đường lây nhiễm tiềm A hydrophila vào cá tra mang vòm họng cá Tuy nhiên cần làm thêm số thí nghiệm bổ sung khác Real-Time PCR VI ĐỀ NGHỊ 1- 2- Dựa kết phát triển vaccine dạng ngâm phịng bệnh xuất huyết cho cá tra Bên cạnh đó, cần có nghiên cứu phát triển vaccine bảo hộ cho cá trước dòng A hydrophila đa dạng mặt di truyền Cần có thêm chứng để chứng minh xâm nhiễm A hydrophila qua mang vòm họng cá 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Allan, Brenda J and Roselynn M W Stevenson 1981 “Extracellular Virulence Factors of Aeromonas Hydrophila in Fish Infections.” Canadian Journal of Microbiology 27(10):1114–22 Retrieved January 7, 2014 Altarriba, M., S Merino, and R Gavı́n 2003 “A Polar Flagella Operon (flg) of Aeromonas Hydrophila Contains Genes Required for Lateral Flagella Expression.” Microbial … Retrieved December 15, 2015 Austin, B and D A Austin 2007 Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish Springer Science & Business Media Retrieved December 15, 2015 Burke, V., M Cooper, and J Robinson 1984 “Hemagglutination Patterns of Aeromonas Spp in Relation to Biotype and Source.” Journal of clinical … Retrieved December 15, 2015 Callister, SM and WA Agger 1987 “Enumeration and Characterization of Aeromonas Hydrophila and Aeromonas Caviae Isolated from Grocery Store Produce.” Applied and Environmental … Retrieved December 15, 2015 Crumlish, M., P C Thanh, J Koesling, V T Tung, and K Gravningen 2010 “Experimental Challenge Studies in Vietnamese Catfish, Pangasianodon Hypophthalmus (Sauvage), Exposed to Edwardsiella Ictaluri and Aeromonas Hydrophila.” Journal of Fish Diseases 33(9):717–22 Daskalov, H 2006 “The Importance of Aeromonas Hydrophila in Food Safety.” Food Control Retrieved December 15, 2015 Esteve, C., EG Biosca, and C Amaro 1993 “Virulence of Aeromonas Hydrophila and Some Other Bacteria Isolated from European Eels Anguilla Anguilla Reared in Fresh Water.” Diseases of aquatic organisms Retrieved December 15, 2015 Fengqing, Hu and You Song 2005 “Electroporation-Mediated Transformation of Aeromonas Hydrophila.” Plasmid 54(3):283–87 Retrieved April 10, 2013 10 Gao, Xue et al 2013 “Genomic Study of Polyhydroxyalkanoates Producing Aeromonas Hydrophila 4AK4.” Applied microbiology and biotechnology 97(20):9099–9109 Retrieved January 13, 2016 11 Guimarães, MS 2002 “Aeromonas Hydrophila Vacuolating Activity in the Caco2 Human Enterocyte Cell Line as a Putative Virulence Factor.” FEMS … Retrieved December 15, 2015 12 Huizinga, HW, GW Esch, and TC Hazen 1979 “Histopathology of Red-sore Disease (Aeromonas Hydrophila) in Naturally and Experimentally Infected Largemouth Bass Micropterus Salmoides (Lacepede).” Journal of Fish Diseases Retrieved December 15, 2015 13 Inglis, V., R J Roberts, and N R Bromage 1993 “Bacterial Diseases of Fish.” Retrieved December 15, 2015 14 Janda, J Michael et al 2014 “Complete Genome Sequence of the Highly Virulent Aeromonas Hydrophila AL09-71 Isolated from Diseased Channel Catfish in West Alabama.” Genome announcements 5(3):1–2 Retrieved May 15, 2015 41 15 Janda, JM and PS Duffey 1988 “Mesophilic Aeromonads in Human Disease: Current Taxonomy, Laboratory Identification, and Infectious Disease Spectrum.” Review of Infectious Diseases Retrieved December 15, 2015 16 Lio-Po, GD, LJ Albright, and EM Leaño 1996 “Experiments on Virulence Dose and Portals of Entry for Aeromonas Hydrophila in Walking Catfish.” Journal of Aquatic Animal … Retrieved December 15, 2015 17 Nusbaum, K E and E E Morrison 2002 “Edwardsiella Ictaluri Bacteraemia Elicits Shedding of Aeromonas Hydrophila Complex in Latently Infected Channel Catfish, Ictalurus Punctatus (Rafinesque).” Journal of Fish Diseases 25(6):343–50 Retrieved January 8, 2014 18 Pang, Maoda et al 2015 “Novel Insights into the Pathogenicity of Epidemic Aeromonas Hydrophila ST251 Clones from Comparative Genomics.” Scientific Reports 5(May):9833 Retrieved 19 Pathiratne, A 1994 “Association of Aeromonas Hydrophila with Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) of Freshwater Fish in Sri Lanka.” Journal of applied … Retrieved December 15, 2015 20 Pridgeon, Julia W., Dunhua Zhang, and Lee Zhang 2014 “Complete Genome Sequence of the Highly Virulent Aeromonas Hydrophila AL09-71 Isolated from Diseased Channel Catfish in West Alabama.” Genome announcements 2(3):9–10 Retrieved 21 Sautour, Marc, P Mary, N E Chihib, and J P Hornez 2003 “The Effects of Temperature, Water Activity and pH on the Growth of Aeromonas Hydrophila and on Its Subsequent Survival in Microcosm Water.” Journal of Applied Microbiology 95(4):807–13 22 Seshadri, Rekha et al 2006 “Genome Sequence of Aeromonas Hydrophila ATCC 7966T: Jack of All Trades.” Journal of Bacteriology 188(23):8272–82 23 Tatusova, Tatiana, Stacy Ciufo, Boris Fedorov, Kathleen O’Neill, and Igor Tolstoy 2014 “RefSeq Microbial Genomes Database: New Representation and Annotation Strategy.” Nucleic acids research 42(Database issue):D553–59 Retrieved November 28, 2014 24 Tekedar, Hasan C et al 2013 “Complete Genome Sequence of a Channel Catfish Epidemic Isolate, Aeromonas Hydrophila Strain ML09-119.” Genome announcements 1(5):1–2 Retrieved 25 Tekedar, Hasan C et al 2015 “Complete Genome Sequence of Fish Pathogen Aeromonas Hydrophila AL06-06.” Genome announcements 3(2):1–2 26 Ventura, M T and J M Grizzle 1988 “Lesions Associated with Natural and Experimental Infections of Aeromonas Hydrophila in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus (Rafinesque).” Journal of Fish Diseases 11(5):397–407 Retrieved 27 Vivas, J and B Carracedo 2004 “Behavior of an Aeromonas Hydrophila aroA Live Vaccine in Water Microcosms.” Applied and … Retrieved December 15, 2015 28 Yadav, M., G Indira, and A Ansary 1992 “Cytotoxin Elaboration by Aeromonas Hydrophila Isolated from Fish with Epizootic Ulcerative Syndrome.” Journal of Fish Diseases Retrieved December 15, 2015 29 Yucel, N., B Erdem, and D Kaya 2005 “Some Virulence Properties and 42 Characterization of Motile Aeromonas Species from Milk and White Cheese.” International journal of dairy … Retrieved December 15, 2015 TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm PGĐ CHUYÊN MÔN TS Nguyễn Đăng Quân PHỤ TRÁCH PHÒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Võ Nguyễn Thanh Thảo ThS Trương Ngọc Thuỳ Liên GIÁM ĐỐC TS Dương Hoa Xô 43