Nghiên cứu tạo kháng kháng thể cá tra cộng hợp với alkaline phosphatase

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG KHÁNG THỂ CÁ TRA CỢNG HỢP VỚI ALKALINE PHOSPHATASE Đơn vị chủ trì đề tài: Phòng CNSH Động Vật Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Quốc Thắng Cán tham gia: ThS Bùi Quốc Thắng TS Nguyễn Trọng Bình TS Trịnh Như Thùy ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm … MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH iv TÓM TẮT vi PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA CỦA ĐỀ TÀI I Tính cấp thiết đề tài II Tổng quan tài liệu 2.1 Akaline phosphatase 2.2 Đặc điểm miễn dịch cá: 2.3 Kháng thể IgM cá da trơn: 10 2.4 Miễn dịch ở động vật có vú 11 2.5 Cộng hợp Alkaline phosphatase với kháng thể 11 III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Vật liệu 15 3.1.1 Vật liệu nguyên cứu 15 3.1.2 Máy móc – thiết bị dùng nghiên cứu: 15 3.2 Phương pháp 16 3.2.1 Thu nhận, ly trích tinh kháng thể 16 3.2.2 Gây đáp ứng miễn dịch thỏ với kháng thể IgM tinh 190 3.2.3 Đánh giá kháng thể thỏ kháng IgM cá tra: 19 3.2.4 Phương pháp ELISA: 19 3.2.5 Phương pháp Western blot: 20 3.2.6 Phương pháp cộng hợp kháng thể với enzyme Alkaline phosphatase 21 IV KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 23 4.1 Nghiên cứu ly trích tinh kháng thể IgM cá tra 23 4.2 Tạo kháng thể thỏ kháng IgM cá tra: 28 4.3 Kết gắn cộng hợp kháng thể IgG thỏ kháng IgM cá tra với Alkaline phosphatase: 35 V ĐÁNH GIÁ CHUNG 42 5.1 Nhận xét đánh giá kết đạt được so với yêu cầu 42 5.2 Các nợi dung cơng việc chưa hồn thành lý (nếu có) 42 I VI ĐỀ NGHỊ 42 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 42 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 II DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AP bIAP Alkaline Phosphatase Bovine intestinal Alkaline Phosphatase BSA ELISA FBS Bovine serum albumin Enzyme Linked Immunosorbent Assay Fetal bovine serum PAGE PBS Polyacrylamide gel electrophoresis Phosphate buffer saline SDS TBS Sodium dodecyl sulfate Tris buffer saline III DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Bảng thể liều tiêm ngày tiêm thỏ 18 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây phát sinh trình tự Alkaline phosphatase ở đợng vật có vú đến năm 2014 (Jose Luis Millan, 2014) Hình 2: Sơ đồ cấu trúc dạng tetramer IgM ở cá da trơn 11 Hình 3: Chuyển hóa chất nhờ enzyme Alkaline phosphatase.Error! Bookmark not defined Hình Sơ đồ thí nghiệm tủa phân đoạn protein huyết cá tra Amoni sulfate 16 Hình 1: Kết chạy điện di SDS-PAGE kiểm tra sản phẩm tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate 233 Hình 2: Sơ đồ sắc ký lọc gel tinh protein IgM cá tra 244 Hình 3: Kết chạy điện di SDS-PAGE kiểm tra sản phẩm tinh (peak 1) điều kiện có chất khử 266 Hình 4: Kết chạy điện di SDS-PAGE kiểm tra sản phẩm tinh (peak 1) điều kiện không có chất khử 277 Hình 5: Kết Western blot kiểm tra sản phẩm tinh (peak 1) điều kiện không có chất khử 27 Hình 6: Kết Elisa kiểm tra hiệu giá kháng thể thỏ ở độ pha loãng từ 50- 12800 lần 2828 Hình 7: Kết Elisa kiểm tra hiệu giá kháng thể thỏ ở đợ pha lỗng từ 500 - 1024000 lần 28 Hình 8: Kết SDS-PAGE kiểm tra sản phẩm tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 300 Hình 9: Kết Western kiểm tra sản phẩm tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 300 Hình 10: Sắc kí đồ tinh kháng thể thỏ từ huyết cột protein A 311 Hình 11: Hình chụp SDS-PAGE sản phẩm tinh IgG thỏ từ huyết cột protein A 322 Hình 12: Kết ELISA kiểm tra giới hạn phát kháng thể thỏ kháng IgM cá tra 333 Hình 13: Hình ảnh Western blot tương tác IgG thỏ với huyết cá tra ở nồng độ khác với kháng nguyên khác loài Error! Bookmark not defined.4 IV Hình 14: Ảnh chụp kết điện di non-reduced SDS-PAGE kiểm tra sản phẩm cộng hợp Error! Bookmark not defined.5 Hình 15: Kiểm tra tương tác giữa cộng hợp với IgM cá tra ELISA Error! Bookmark not defined.6 Hình 16: Ảnh chụp kết Western blot kiểm tra hiệu giá cộng hợp……………… 37 Hình 17: ELISA kiểm tra đợ đặc hiệu cộng hợp với kháng nguyên 38 Hình 18: Ảnh chụp kết Western blot phát kháng thể IgM huyết cá tra Error! Bookmark not defined.0 Hình 19: Kết kiểm tra giới hạn phát cộng hợp phản ứng ELISA……………………………………………………………………………………41 Hình 20: Kết kiểm tra giới hạn phát cộng hợp ở điều kiện bảo quản khác phản ứng ELISA 411 V TÓM TẮT Trong nghiên cứu vaccine phòng bệnh cá tra, chúng tơi gặp khơng khó khăn việc đánh giá khả đáp ứng miễn dịch ở cá Chính chúng tơi thực nghiên cứu nhằm tạo kháng thể gắn enzyme Alkaline phosphatase kháng IgM cá tra với mục tiêu tạo sản phẩm phục vụ công tác nghiên cứu vaccine hướng tới nghiên cứu miễn dịch cá sau IgM cá tra được ly trích thu nhận từ cá tra phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate tinh sắc ký lọc gel IgM cá tra đạt độ tinh 90% với nồng độ đạt khoảng 1mg/ml được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch thỏ Kháng thể IgG thỏ kháng IgM cá tra sau thu nhận tinh sắc kí lực cợt protein A được gắn cộng hợp với enzyme Alkaline phosphatase Sản phẩm cộng hợp được kiểm tra Western blot ELISA cho tương tác đặc hiệu với IgM cá tra không tương tác với kháng nguyên khác Cộng hợp thành công sở để sử dụng cho nghiên cứu miễn dịch vaccine cá tra tương lai VI PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Nghiên cứu tạo kháng kháng thể cá tra cộng hợp với enzyme Alkaline phosphatase (Mã số: DV02/16-17) Đơn vị chủ trì: Phòng CNSH Đợng vật Cơ quan phối hợp chính: (nếu có) Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Quốc Thắng- Phòng CNSH Động vật Cán bộ/Nhóm thực hiện: TS Nguyễn Trọng Bình- Phòng CNSH Đợng vật TS Trịnh Như Thùy- Phòng CNSH Động vật ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên- Phòng CNSH Động vật Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 01/2016 đến 12/2017) Kinh phí: 592.346.800 VNĐ Kinh phí phân bổ theo năm: - Năm 2016: 292.435.600 VNĐ - Năm 2017: 299.911.200 VNĐ Mục tiêu đề tài: Tạo kháng thể kháng lại IgM cá tra gắn với enzyme Alkaline phosphatase có tiềm ứng dụng cao trung tâm Các nội dung công việc thực so với đăng ký (Ghi rõ nội dung triển khai từ bắt đầu thực đề tài thời điểm báo cáo) STT Nội dung đăng ký Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Thực Đánh giá Đạt hay không đạt - Đã thu nhận huyết Đạt cá tra tiến hành ly trích, tinh IgM với đợ tinh đạt 90% Nghiên cứu ly trích 02/2016và tinh kháng thể 07/2016 IgM cá tra Gây đáp ứng miễn 08//2016dịch động vật tạo 12/2016 kháng thể kháng IgM cá - Đã gây đáp ứng miễn Đạt dịch thỏ, kết hiệu giá huyết cao, thỏ đáp ứng miễn dịch mạnh với kháng nguyên tiêm vào Tạo kháng thể đơn 01/2017dòng kháng IgM 04/2017 - Chưa thực Chưa đạt thiếu nguồn chuột Balb/c - Theo góp ý hội đồng, xin chuyển đổi nội dung từ kháng thể đơn dòng sang đa dòng -Đã tạo thu được kháng thể IgG thỏ tinh sạch, đặc hiệu với kháng nguyên IgM Nghiên cứu gắn cộng 05/2017hợp kháng thể với 12/2017 Alkaline phosphatase -Đã gắn cộng hợp IgG Đạt thỏ với bIAP glutaraldehyde -Cộng hợp tạo thành giữ tính đặc hiệu với IgM cá hoạt tính enzyme -Cộng hợp có độ nhạy phản ứng Elisa tương đương với sản phẩm thương mại PHẦN NỢI DUNG KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI I Tính cấp thiết đề tài Ở Việt Nam ngành thủy sản chiếm một vị hàng đầu được nhà nước đầu tư đóng góp không nhỏ kim ngạch xuất Bên cạnh ngành nuôi tôm, việc nuôi trồng thủy sản nước cá da trơn đặc biệt cá tra (Pangasinodon hypophthalmus) một những loài thủy sản xuất chiến lược Việt Nam Sản phẩm từ cá tra có thể tìm thấy ở Mỹ, Châu Âu Tuy nhiên với việc mở rộng diện tích ni trồng với mức đợ thâm canh cao, mật độ dày đặc, ô nhiễm môi trường biến động nguồn nước, nhiệt độ, với thay đổi không ngừng vi trùng gây bệnh tạo điều kiện cho bệnh truyền nhiễm bùng phát Những vấn đề làm thiệt hại khơng sản lượng chất lượng loại thủy sản mũi nhọn này, làm thiệt hại không nhỏ kinh tế ảnh hưởng đến đầu sản phẩm Việc sản xuất vaccine cho cá tra còn gặp nhiều khó khăn, việc điều trị bệnh cá chưa thực hiệu Việc phát sớm dịch bệnh giúp cho người nuôi có phương pháp xử lý kịp thời tránh lây lan hạn chế thiệt hại tiền công sức Với phát triển không ngừng công nghệ sinh học, có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh cá tra phương pháp mô bệnh học, phương pháp vi sinh (đối với bệnh vi khuẩn gây gan thận mủ, xuất huyết cá tra), phương pháp soi tươi (bệnh gạo), PCR, ELISA, kit chẩn đoán… Hướng nghiên cứu vaccine thủy hải sản, đặc biệt cá tra một hướng nghiên cứu được Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh theo đuổi từ lâu có một số thành tựu định (Nguyễn Trọng Bình 2009, Nguyễn Trọng Bình 2011, Vũ Thị Thanh Hương 2011) Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh tiến hành nghiên cứu chủng E ictaluri đột biến nhược độc kháng bệnh gan thận mủ từ năm 2008 phát chủng E ictaluri đột biến gen wzz (O- antigen chain length determinant gene) nhược đợc an tồn cho cá có hiệu bảo vệ cao ở quy mơ phòng thí nghiệm (> 60%) Đây chủng E ictaluri nhược độc tiềm làm vaccine, cung cấp ở dạng ngâm cho cá Đã có nhiều nghiên cứu vaccine bất hoạt vaccine nhược độc ngăn ngừa bệnh cá tra được công bố giới Tại Việt Nam, công ty Pharmaq (Na Uy) thương mại M Serum Pellet W E1 E2 E3 E4 E5 55 kDa kDAkDa 25 kDa kDakDak Da Hình 3: Hình chụp SDS-PAGE sản phẩm tinh IgG thỏ từ huyết cột protein A Serum: protein huyết thỏ, pellet: protein huyết được tủa bởi muối, W: dịch rửa cột, E1-E5: fraction dung giải 1-5 Kháng thể IgG thỏ sau tủa muối, được hòa lại PBS để tái cấu trúc tiến hành thẩm tích để loại muối sau đó được tinh sắc ký lực với protein A (GE healthcare) Phần kháng thể gắn cột sau dung giải được thu nhận vào eppendoft bảo quản ở -200C đến sử dụng Kết tinh được kiểm tra SDS-PAGE (hình 11) Sau tinh sạch, chúng tơi thu được phân đoạn chứa nhiều IgG (E1 E2), phần lớn protein tạp được loại bỏ, chúng tiến hành phân tích ImageJ để xác định đợ tinh IgG thỏ thu được Kết phân tích cho thấy ở mẫu E1 E2, độ tinh đạt 90% Nồng độ IgG ở E2 cao E1 sau được xác định braford (số liệu không được mô tả ở đây), đó chúng lựa chọn mẫu tinh E2 để thực thí nghiệm Kháng thể đa dòng thỏ sau được tinh được tiến hành đánh giá sơ bợ tiêu tính đặc hiệu khả tương tác kháng thể với kháng nguyên Chúng tiến hành ELISA với kháng nguyên phủ bảng IgM tinh được pha loãng đến nồng đợ 1000ng/ml tiến hành pha lỗng bậc đến 0,01 ng/ml Ở đợ pha lỗng 5000 lần, huyết thỏ tương tác tốt với kháng nguyên ở nồng đợ khoảng 0,4 ng/ml (tính hiệu OD450 cao lần chứng âm) (hình 12) Điều cho thấy kháng thể đa dòng thỏ chúng thu được có tương tác tốt với kháng nguyên đặc hiệu (IgM cá tra) 32 Để xác định tính đặc hiệu kháng thể, chúng tiến hành Western blot để kiểm tra phản ứng kháng thể đa dòng thỏ kháng IgM cá với lần lượt protein huyết cá, IgM cá tinh sạch, protein huyết khác lồi: cḥt, bò Kết cho thấy kháng thể đa dòng thỏ phản ứng tốt với IgM cá tra huyết thanh, không phản ứng với thành phần protein diện máu thỏ máu cḥt (hình 4.13) Điều cho thấy kháng thể đa dòng thỏ tạo được có tính đặc hiệu với kháng nguyên (IgM cá tra) Kiểm tra giới hạn phát Kháng thể IgG thỏ 1.8000 1.6000 1.4000 OD450 1.2000 1.0000 0.8000 0.6000 0.4000 0.2000 0.0000 100 25 6.25 1.5625 0.391 0.098 0.024 Nồng đợ kháng ngun IgM (ng) Hình 42: Kết ELISA kiểm tra độ nhạy kháng thể thỏ kháng IgM cá tra Giếng được phủ kháng nguyên IgM cá tinh nồng độ ban đầu 100ng/giếng, tiến hành pha loãng bậc đến 0.01 ng/giếng blocking buffer 100 μl mỗi nồng độ kháng nguyên được phủ giếng Cơ chất màu TMB sau kết thúc phản ứng với kháng thể được phát máy đo quang học ở bước sóng 450nm 33 (a) M S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Ms Bov 70 kDa 25 kDa (b) M S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 Ms Bov 70 kDa 25 kDa Hình 13: Hình ảnh Western blot tương tác IgG thỏ với huyết cá tra ở nồng độ khác với kháng nguyên khác loài (a): ảnh chụp SDS-PAGE , (b): ảnh chụp Westernblot, M: Thang, S1-S7: Huyết cá ở nồng độ khác nhau: 5μ-2,5μ-1,25μ -0,625μ-0,375μ-0,1875μ, Ms: huyết chuột, Bov: huyết bò 34 4.3 Kết gắn cộng hợp kháng thể IgG thỏ kháng IgM cá với enzyme Alkaline phosphatase: Kháng thể sau tinh được hịa trợn với enzyme Alkaline phosphatase (Sigma) tiến gắn cộng hợp Glutaraldehyde (Immunochemical Protocols- 4.1.9) Hỡn hợp enzyme kháng thể khơng có diện Glutaraldehyde được sử dụng đối chứng Sau q trình gắn cợng hợp, sản phẩm tạo thành được kiểm tra SDSPAGE (hình 4.14) M AP IgG dIgG mix (-) (+) 180 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 45 kDa 35 kDa 25 kDa Hình 14: Ảnh chụp kết điện di non-reduced SDS-PAGE kiểm tra sản phẩm cộng hợp M: Thang protein, AP: Enzyme Alkaline Phosphatase, IgG: IgG thỏ kháng IgM, dIgG: IgG thỏ kháng IgM sau thẩm tích, mix: hỡn hợp enzyme + IgG trước gắn cộng hợp, (-): hỗn hợp enzyme + IgG sau gắn cộng hợp (không bổ sung glutaraldehyde), 6: hỗn hợp enzyme + IgG (có bổ sung glutaraldehyde) Nồng độ protein mỗi giếng: μg Kết điện di cho thấy, q trình gắn cợng hợp, thiếu chất xúc tác Glutaraldehyde, kháng thể IgG enzyme Alkaline phosphatase không tương tác với đó IgG Alkaline phosphatase được giữ nguyên lúc ban đầu Ngược lại, dưới diện Glutaraldehyde, hỗn hợp IgG Alkaline phosphatase có tương tác 35 sau q trình gắn cợng hợp, còn lại một lượng dư Alkaline phosphatase chưa tương tác hỗn hợp, xuất vạch lớn nằm ở phần đầu gel phân tách, điều có thể giải thích cợng hợp tạo thành có kích thước lớn gắn tạo nên mợt phức hợp nhiều thành phần được liên kết với đó xa bảng gel điện di, tượng được nhiều tác giả báo cáo trước (Wisdom, 2005) Từ kết trên, trình cợng hợp thành cơng, lượng dư ngun liệu còn lại cho thấy việc gắn cợng hợp có hiệu suất gắn tốt Để xác định khả hoạt động cộng hợp, chúng tiến hành ELISA với kháng nguyên gắn bảng IgM tinh sạch, cộng hợp enzyme -kháng thể tạo được sử dụng để bắt IgM gắn bảng, sau trình rửa phức hợp IgM- cộng hợp còn lại giếng được phát chất NPP Sau kết thúc phản ứng, chuyển hóa chất NPP enzyme được phát máy đo quang học ở bước sóng 405nm Hỡn hợp enzyme kháng thể khơng có diện Glutaraldehyde được sử dụng đối chứng Kết cho thấy sản phẩm có gắn cợng hợp có tương tác với kháng nguyên bị giữ lại giếng có khả chuyển hóa chất NPP Ngược lại, ở mẫu đối chứng, có kháng thể kháng IgM được giữ lại, enzyme hỗn hợp bị rửa trơi sau bước rửa khơng có khả chuyển hóa chất (Hình 4.15) Điều cho thấy, sản phẩm cộng hợp thành công, IgG Alkaline phosphatase sau được gắn cộng hợp giữ được khả tương tác kháng nguyên kháng thể (IgG) hoạt tính enzyme Alkaline ELISA kiểm tra tương tác cộng hợp với IgM cá tra 2.5 OD405 1.5 0.5 Nồng độ IgM cá (ng/giếng) ng/ giếng conjugate Blank 0.007 0.013 0.025 0.049 0.098 0.196 0.391 0.782 1.563 3.125 6.25 12.5 25 50 100 non-conjugate Hình 15: Kiểm tra tương tác giữa cợng hợp với IgM cá ELISA Conjugate: Cộng hợp được pha lỗng đến μg/ml blocking buffer, non-conjugate: hỡn hợp enzyme- IgG thỏ không có chất xúc tác Mỗi nghiệm thức được lập lại lần 36 Chúng tiến hành đánh giá khả hoạt động cộng hợp Western blot Kháng nguyên IgM được pha loãng tiến hành điện di gel Polyacrylamide (hình 4.16 F, mỡi giếng 500 ng IgM), sau đó chuyển lên màng PVDF ủ với 3ml cộng hợp được pha lỗng blocking buffer với đợ pha loãng khác nhau: 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000 1/10000 (tương ứng với μg; 2,5 μg; 1,25; 0,5 μg 0,25 μg) Cơ chất BCIP/NBT được sử dụng để phát tương tác cộng hợp kháng nguyên (IgM cá tra) màng Kết cho thấy, vạch chất rõ màng ở đợ pha lỗng 1/500 (500 lần) đến 1/5000 (5000 lần) cho thấy cộng hợp tương tác tốt với kháng nguyên IgM cá ở đợ pha lỗng (hình 4.16) Ở đợ pha lỗng 1/10000, vạch chất khơng quan sát thấy rõ ràng đó được xem âm tính Điều cho thấy cộng hợp chúng tạo được có thể phát tốt IgM phản ứng Western blot với nồng đợ sử dụng thấp (ở đợ pha lỗng 5000 lần tương ứng với nồng độ cộng hợp sử dụng 0.5 μg), chứng minh cộng hợp tạo thành tương tác tốt với kháng nguyên Hình 16: Ảnh chụp kết Western blot kiểm tra hiệu giá cợng hợp (A): cợng hợp pha lỗng 500 lần, (B): cợng hợp pha lỗng 1000 lần, (C): cợng hợp pha lỗng 2000 lần, (D): cợng hợp pha lỗng 5000 lần, (E): cợng hợp pha lỗng 10000 lần, (F): SDS-PAGE 37 Nhằm kiểm tra độ đặc hiệu cộng hợp tạo được, protein huyết khác lồi (cḥt, thỏ), IgM cá vaccine cá tra M14 được sử dụng kháng nguyên gắn bảng phản ứng ELISA, sau đó được ủ với cộng hợp (100 ng/giếng) Cơ chất màu NPP (1μg/ml) được sử dụng để phát tương tác cộng hợp với kháng nguyên gắn bảng, sản phẩm chuyển hóa được xác định máy đo quang học ở bước sóng 405nm Kết cho thấy, tính hiệu OD405 từ chuyển hóa chất NPP cao quan sát thấy ở mẫu IgM, tính hiệu âm tính (OD405 thấp, khơng có khác biệt với blank) quan sát thấy ở tất mẫu còn lại, qua đó chứng minh cộng hợp phản ứng tốt với IgM cá không phản ứng với thành phần protein diện huyết khác loài protein khác vaccine M14 (hình 17) Điều cho thấy cộng hợp enzyme-kháng thể tạo được có tính đặc hiệu với IgM cá tra (giữ được đặc tính kháng thể IgG) ELISA kiểm tra đợ đặc hiệu cộng hợp 4.5 3.5 OD405 2.5 1.5 0.5 Loại kháng nguyên gắn bảng IgM Cḥt Bị M14 pellet M14 Blank Hình 175: ELISA kiểm tra độ đặc hiệu cộng hợp với kháng nguyên Giếng được phủ kháng nguyên IgM cá khác nguyên khác ở nồng độ 100 ng/giếng Cợng hợp được pha lỗng đến 1μg/ml blocking buffer Cơ chất màu NPP (1μg/ml) sau kết thúc phản ứng với enzyme được phát máy đo quang học ở bước sóng 405nm Mỗi nghiệm thức được lập lại lần 38 (a) (b) M IgM Bov Ms S1 S2 S3 S4 S5 S6 M IgM Bov Ms S1 S2 S3 S4 S5 S6 180 kDa 180 kDa 70 kDa 70 kDa 45 kDa 45 kDa 25 kDa 25 kDa (c) (d) 180 kDa 70 kDa 100 kDa 70 kDa 45 kDa 55 kDa 25 kDa 25 kDa Hình 186: Ảnh chụp kết Western blot phát kháng thể IgM huyết cá M: thang protein, IgM: IgM cá tinh sạch, Bov: huyết bò, Ms: huyết chuột, S1-S5: Huyết cá ở nồng độ khác (a): SDS_PAGE, (b): Nhuộm với kháng thể- enzyme không gắn cộng hợp, (c): Nhuộm với cộng hợp Enzyme- kháng thể, (d): đối chứng với kháng thể sơ cấp kháng IgM cá cộng hợp thương mại gắn HRP làm kháng thể thứ cấp Tính đặc hiệu cộng hợp sử dụng phản ứng Western blot được xác định, huyết cá vơi nồng độ khác nhau, protein từ huyết thỏ chuột sau chạy điện di gel polyacrylamide được chuyển lên màng lai Màng được ủ với cộng hợp, sau đó kiểm tra tương tác cộng hợp với protein màng lai chất BCIP/NBT Kết cho thấy, mẫu đối chứng (hỗn hợp IgG thỏ- enzyme) không tương tác với kháng nguyên, đó không xuất vạch lai màng Trong đó, cộng 39 hợp tương tác với kháng nguyên IgM mẫu tinh mẫu huyết cá, tín hiệu lai xuất ở vạch tương ứng cho chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgM cá tra Khơng xuất tín hiệu lai giữa cợng hợp với kháng ngun khác lồi (cḥt, bò), điều cho thấy cộng hợp có tương tác đặc hiệu với IgM cá tra phản ứng Western blot (hình 18) Kết tương đồng sử dụng kháng thể thương mại mẫu so sánh Từ những kết đánh giá ELISA Western blot trên, chứng minh cộng hợp chúng tạo có tính đặc hiệu với IgM cá tra Giới hạn phát cộng hợp phản ứng ELISA được đánh giá Kháng nguyên IgM được pha loãng gắn lên giếng ELISA sẽ được bắt bởi cộng hợp phát bởi chuyển hóa chất Giá trị OD trung bình mỡi giếng lớn lần so với trung bình cợng giếng chứng âm (blank) được xem dương tính Đợ pha lỗng lớn cho kết dương tính được xác định giới hạn phát phản ứng Kết thu được cho thấy, với nồng độ sử dụng μg/ml (tương đương 100ng/giếng) cộng hợp sử dụng cho kết cho giới hạn phát phản ứng ELISA đạt 12.5 ng (Hình 19) 1.8 (A) ELISA kiểm tra giới hạn phát cộng hợp 1.6 OD405 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 Nờng độ kháng ngun (ng/giếng) Hình 197: Kiểm tra giới hạn phát cộng hợp với IgM cá tra ELISA Giếng được phủ kháng nguyên IgM cá tinh nồng độ ban đầu 100ng/ giếng sau đó pha lỗng bậc đến 0.1ng/giếng (A): Cợng hợp được pha loãng đến μg/ml blocking buffer, Cơ chất màu NPP (μg/ml) sau kết thúc phản ứng với enzyme được phát máy đo quang học ở bước sóng 405nm (B): Kháng thể kháng IgM cá được sử dụng kháng thể sơ cấp, sau bổ sung kháng ` cấp gắn HRP, chất TMB được sử dụng phát máy đo quang học ở bước sóng thể thứ 450nm Mỗi nghiệm thức được lập lại lần 40 Một đặc điểm quan trọng cho việc ứng dụng kháng thể thứ cấp cợng hợp kháng thể-enzyme phải giữ được tính ổn định thời gian bảo quản dài Vì chúng tiến hành xác định giới hạn phát cộng hợp ở điều kiện bảo quản khác nhau, qua đó đánh giá độ ổn định cộng hợp Cộng hợp được bảo quản ở điều kiện: 40C có bổ sung 0,1% sodium azide ở -200C Sau tháng bảo quản, cộng hợp được lấy tiến hành xác định giới hạn phát ELISA ở đợ pha lỗng đến μg/ml nhằm xác định độ bền cộng hợp điều kiện bảo quản tương ứng (Hình 20) Giá trị OD trung bình mỡi giếng lớn lần so với trung bình cợng giếng chứng âm (blank) được xem dương tính Kết cho thấy, sau tháng bảo quản, cộng hợp giữ độ ổn định ở điều kiện 40C có bổ sung 0,1% sodium azide ở -200C, không có khác biệt mặt thống kê ở mẫu được trữ tháng ở điều kiện so với mẫu ban đầu Điều cho thấy cộng hợp được tạo thành có độ ổn định cao Giới hạn phát (ng/ giếng) Giới hạn phát cộng hợp điều kiện bảo quản khác phản ứng ELISA 30 25 20 15 10 Mẫu cộng hợp mẫu ban đầu Bảo quản độ C Bảo quản -20 độ C Hình 20: Kết kiểm tra giới hạn phát cộng hợp ở điều kiện bảo quản khác phản ứng ELISA Giếng được phủ kháng nguyên IgM cá tinh nồng đợ ban đầu 100ng/ giếng sau đó pha lỗng bậc đến 0.1 ng/giếng Cợng hợp được pha lỗng đến μg/ml blocking buffer, Cơ chất màu NPP (μg/ml) sau kết thúc phản ứng với enzyme được phát máy đo quang học ở bước sóng 405nm 41 V ĐÁNH GIÁ CHUNG 5.1 Nhận xét đánh giá kết đạt được so với yêu cầu Đã ly trích tinh thành cơng kháng thể IgM cá dùng làm kháng nguyên tạo kháng kháng thể cá tra với độ tinh cao 90% nồng độ đạt khoảng mg/mL lần Đã gây đáp ứng miễn dịch tốt thỏ với hiệu giá huyết đạt một triệu Đã thu được kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu với IgM cá, không tương tác với tác nhân khác diện huyết khác lồi (bò, cḥt) Đã gắn cợng hợp thành công IgG kháng IgM cá với enymze Alkaline Phosphatase - Cộng hợp tạo thành có độ đặc hiệu cao với IgM cá không tương tác với kháng ngun khác lồi Cợng hợp có đợ ổn định cao, hoạt tính khơng thay đổi ở điền kiện bảo quản sau tháng 5.2 Các nội dung công việc chưa hồn thành lý (nếu có) Nợi dung đăng kí ban đầu, chúng tơi dự định tạo kháng thể đơn dòng kháng IgM cá, nhiên trình thực vướng phải khó khăn việc tìm nguồn cḥt Balb/c để tạo kháng thể đơn dòng với số lượng lớn Dưới góp ý hội đồng khoa học trung tâm, chúng chủ động chuyển hướng sang sử dụng kháng thể đa dòng thỏ để thay VI ĐỀ NGHỊ Cộng hợp kháng thể kháng IgM cá gắn alkaline phosphatase sản phẩm có thể ứng dụng cho nghiên cứu phát bán định lượng kháng thể IgM cá tra Cộng hợp nguồn sinh phẩm có thể phục vụ cho nghiên cứu miễn dịch vaccine cá tra PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Chưa tạo được kháng thể đơn Dòng tế bào hybridoma 2-3 dòng Đã tạo được kháng thể IgG thỏ Kháng thể kháng IgM cá 5mg kháng IgM có độ nhạy độ đặc hiệu cao Cộng hợp giữ được hoạt Cộng hợp kháng thể 1-3 mg tính enzyme khả IgG-bIAP gắn đặc hiệu kháng thể 42 Chưa đạt Đạt Đạt PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Nguyễn Trọng Bình, Nguyễn Quốc Bình 2009 “Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gene 551-850 purA phương pháp tái tổ hợp gene sử dụng làm vaccine ngừa bệnh đốm trắng cho cá tra (Pangasius hypophthalmus)” Tuyển tập Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc khu vực phía nam, 49-54 Ngũn Trọng Bình, Trần Hạnh Triết, Trần Thị Thanh Thanh, Nguyễn Quốc Bình 2011 “Loại bỏ gen purA, aroA, wzz ch để tạo chủng Edwardsiella ictaluri nhược đợc có khả làm vaccine” Tạp chí Công nghệ Sinh học (4A): 643-650 Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh, Lê Văn Hậu, Văn Xuân Thành, Nguyễn Quốc Bình 2011 “Sàng lọc dòng Edwardsiella ictaluri kháng Rifampicin nồng độ cao giảm độc lực có thể làm vaccine nhược đợc tiềm năng” Tạp chí Công nghệ Sinh học (4A): 611-618 Nguyễn Ngọc Lanh 2006 “Miễn Dịch Học.” ĐH Y Hà Nội, NXB Y Học Trương Ngọc Thùy Liên, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc Bình 2014 “Tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhược độc phương pháp knock out gen aroA” Tạp chí Sinh học 36 (1se):15-21 Đào Huy Mạnh 2011 “Hồn thiện quy trình tinh chế kháng thể đơn dòng sản xuất cộng hợp 6b6c gắn enzyme dùng bộ kit MAC ELISA xét nghiệm sốt xuất huyết Denge.” Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đinh Thương Vân 2010 “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclono antibody) để chẩn đốn nhanh bệnh virus tơm ni.” Trần Quốc Vũ 2013 “Tạo kháng khể đơn dòng kháng protein E7 Human Papillomavirus Type 16.” Trường Đại học Khoa học tự nhiên II TIẾNG ANH Abubakar, M., Wasagu, R., & Umar, M (2013) "Kinetic Studies of Alkaline Phosphatase from the Liver of Agama agama Lizard" Nigerian Journal of Basic and Applied Science, 21(2), 122–126 10 Acton, R T., Weinheimer, P F., Hall, S J., Niedermeier, W., Shelton, E., & Bennett, 43 J C (1971) "Tetrameric immune macroglobulins in three orders of bony fishes" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 68(1), 107–11 11 Bieniarz, C., Young, D F., & Cornwell, M J (1998) "Thermally stabilized immunoconjugates: conjugation of antibodies to alkaline phosphatase stabilized with polymeric cross-linkers" Bioconjugate Chemistry, 9(3), 399–402 12 Biosciences, I (2013) "Quality – Consistency – Expertise Applications and advantages of alkaline phosphatase in immunoassays Dr Andy Lane" 13 Chou, J., Morse, J., Omeis, S., & Venos, E S (2005) "Escherichia coli C29 Alkaline Phosphatase Enzyme Activity and Protein Level in Exponential and Stationary Phases", 7(April), 1–6 14 Col, M., Colak, A., Ertunga, N S., Yildirim, M., & Özel, A (2010) "Cloning , Expression and Characterization of Alkaline Phosphatase from a Thermophilic Bacterium Geobacillus caldoxylosilyticus TK4" Turkish Journal of Biochemistry, 35(March), 208–214 15 Fischer, U., Utke, K., Somamoto, T., Köllner, B., Ototake, M., & Nakanishi, T (2006) "Cytotoxic activities of fish leucocytes" Fish & Shellfish Immunology, 20(2), 209–26 16 Huong Giang, D T., Van Driessche, E., & Beeckmans, S (2012) "Serum carbohydrate-binding IgM are present in Vietnamese striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) but not in North African catfish (Clarias gariepinus)" Developmental and Comparative Immunology, 36(2), 418–432 17 John B Alexander, G A I (1992) "Noncellular nonspecific defence mechanisms of fish" 18 Jose Luis Millan (2014) Mammalian Alkaline phosphatases Wiley-VCH 19 Liddell, J (2003) "Production of Polyclonal Antibodies in Rabbits" Encyclopedia of Life Sciences, 295, 27–39 20 Lieschke, G J., & Trede, N S (2009) "Fish immunology" Current Biology, 19(16), 678–682 44 21 Magnadottir, B (2010) "Immunological control of fish diseases" Marine Biotechnology (New York, N.Y.), 12(4), 361–79 22 Magnadóttir, B (2006) "Innate immunity of fish (overview)" Fish & Shellfish Immunology, 20(2), 137–51 23 Manes, T., Hoylaerts, M F., Muller, R., Lottspeich, F., Holke, W., & Millan, J L (1998) "Genetic complexity, structure, and characterization of highly active bovine intestinal alkaline phosphatases" J Biol Chem, 273(36), 23353–23360 24 MILNE, E M (1985) "The diagnostic value of alkaline phosphatase in canine medicine : a review", 267–278 25 O, F O., B, A O., O, O O., N, O S., G, R O., A, E O., & O, E B (2013) "Characterization of Alkaline Phosphatase ( E C ) From The Seeds of Dacryodes Edulis ( African Pear ) A Likely Industrial Source For Enzyme Production" The International Journal of Engineering and Sciencie, 2(4), 31–36 26 Sciences, L (2001) Selecting the Detection System - Colorimetric , Fluorescent , Luminescent Methods 27 Swain, T., Mohanty, J., Sahu, A K., Sahoo, P K., & Garnayak, S K (2014) "Comparative analysis of immunoglobulin molecules from catfish , Clarias batrachus , Clarias gariepinus and C batrachus ♀ x C gariepinus ♂ hybrid", 61(3), 88–92 28 Tucker, craid S (2004) "Biology and cultrure of channel catfish" Developments in Aquaculture and Fisheries Science (Vol 1) 29 Uribe, C., Folch, H., Enriquez, R., & Moran, G (2011)."Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review" Veterinární Medicína, 56(10), 486–503 30 Weissig, H., Schildge, a, Hoylaerts, M F., Iqbal, M., & Millán, J L (1993) "Cloning and expression of the bovine intestinal alkaline phosphatase gene: biochemical characterization of the recombinant enzyme" The Biochemical Journal, 290 ( Pt 2, 503–8 31 Winston, S E., Fuller, S a, Evelegh, M J., & Hurrell, J G (2001) "Conjugation of enzymes to antibodies" Current Protocols in Molecular Biology / Edited by Frederick M Ausubel [et Al.], Chapter 11(3), Unit11.1 45 32 Wisdom, G B (1988) "Antibody-Enzyme Conjugate Formation" Methods in Molecular Biology, Volume 3, 373–382 33 Wisdom, G B (2005) "Conjugation of antibodies to alkaline phosphatase" Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 295, 123–126 ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phòng CNSH Động Vật Chủ nhiệm đề tài ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách Phịng QLKH-HTQT ………, ngày tháng năm 20 Giám đốc 46