Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng cd45 của người hướng đến ứng dụng trong xét nghiệm các bệnh về máu

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NĂM 2015 TÊN ĐỀ TÀI TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG CD45 CỦA NGƯỜI HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM CÁC BỆNH VỀ MÁU Mã số: YD01/13-15 Chủ nhiệm đề tài: ThS Tạ Hương Giang Cán thực hiện: ThS Tạ Hương Giang ThS Nguyễn Thị Phương Thảo TS Nguyễn Đăng Quân TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH TÓM TẮT 10 I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 11 II ĐẶT VẤN ĐỀ 12 III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 III.1 Giới thiệu CD45 13 III.2 Ứng dụng marker CD45 KTĐD chẩn đoán theo dõi điều trị 16 III.3 Tình hình nghiên cứu nước 17 III.4 Giới thiệu chung kỹ thuật tạo kháng thể đơn dòng 17 III.5 Tính cấp thiết đề tài 17 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 IV.1 Vật liệu 19 IV.1.1 DNA 19 IV.1.2 Các cặp mồi dùng phản ứng PCR 19 IV.1.3 Plasmid 19 IV.1.4 Chủng vi sinh vật 19 IV.1.5 Thang chuẩn 20 IV.2 Hóa chất 20 IV.2.1 Hóa chất cho tạo dòng biểu 20 IV.2.2 Hóa chất cho phân tích protein 20 IV.2.2.1 Hóa chất cho SDS-PAGE 20 IV.2.2.2 Hóa chất cho lai Western Blot 21 IV.2.2.3 Hóa chất cho hịa tan protein urea 8M 21 IV.2.3 Hóa chất cho tinh protein cột HisTrap HP 1ml 21 IV.2.4 Hóa chất cho trình gây đáp ứng miễn dịch chuột 21 IV.2.5 Hóa chất cho q trình xử lý dịch mơi trường thu nhận từ q trình nuôi cấy hybridoma 22 IV.2.5.1 Hóa chất cho tủa miễn dịch sử dụng hạt protein A 22 IV.2.5.2 Hóa chất cho trình tinh kháng thể kháng huCD45 từ dịch nuôi cấy hybridoma 22 IV.3 Phương pháp nghiên cứu 22 IV.3.1 Phương pháp tạo plasmid biểu kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRO dòng tế bào E coli BL21 (DE3) 22 IV.3.2 Phương pháp biểu thu nhận kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRO từ hệ thống E coli BL21 (DE3) 24 IV.3.3 Phương pháp tạo plasmid biểu kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRABC dòng tế bào E coli BL21 (DE3) 24 IV.3.4 Phương pháp phân tích protein 26 IV.3.3.1 Phương pháp điện di SDS-PAGE 26 IV.3.3.2 Phương pháp nhuộm bạc 27 IV.3.3.3 Phương pháp lai western blot 27 IV.3.5 Phương pháp hòa tan tinh kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRO từ hệ thống E coli BL21 (DE3) 27 IV.3.4.1 Phương pháp hòa tan thể vùi chứa kháng nguyên huCD45exRO urea 8M 28 IV.3.4.2 Phương pháp tinh kháng nguyên huCD45exRO hệ thống AKTATM purifier 28 IV.3.6 Phương pháp tạo sàng lọc dòng tế bào hybridoma tiết kháng thể kháng huCD45exRO 28 IV.3.5.1 Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột 28 IV.3.5.2 Phương pháp kiểm tra khả đáp ứng miễn dịch chuột 29 IV.3.5.3 Phương pháp dung hợp tế bào tạo hybridoma 29 IV.3.5.4 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào hybridoma 29 IV.3.7 Các phương pháp xử lý với dịch thu nhận từ môi trường nuôi hybridoma 30 IV.3.6.1 Phương pháp tủa miễn dịch sử dụng hạt protein A 30 IV.3.6.2 Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 30 IV.3.6.2 Phương pháp tinh thu nhận kháng thể chuột kháng huCD45 cột protein G HP 5ml 31 IV 3.6.4 Phương pháp xác định số phân ly Kd kháng thể đơn dòng kháng CD45 31 IV.3.7 Phương pháp cộng gộp kháng thể antiCD45 với FITC 32 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 V.1 Tạo dòng, biểu hiện, tinh protein tái tổ hợp huCD45exRO huCD45exRABC 34 V.1.1 Tạo dòng, biểu hiện, tinh huCD45exRO 34 V.1.1.1 Tạo dòng gene mã hóa cho protein huCD45exRO 34 V.1.1.2 Kiểm tra biểu vùng ngoại bào protein huCD45exRO E.coli BL21(DE3) 35 V.1.1.3 Khảo sát điều kiện biểu protein tái tổ hợp huCD45exRO 36 V.1.1.4 Khảo sát điều kiện hòa tan thể vùi huCD45exRO urea 8M 37 V.1.1.5 Khảo sát điều kiện tinh protein tái tổ hợp huCD45exRO cột HisTrap HP 1ml 38 V.1.2 Tạo dòng, biểu hiện, tinh huCD45exRABC 40 V.2 Tạo sàng lọc dòng tế bào hybridoma tiết kháng thể kháng huCD45exRO 42 V.2.1 Gây đáp ứng chuột Balb/c với kháng nguyên tái tổ hợp huCD45exRO 42 V.2.2 Chọn lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng huCD45exRO 43 V.3 Kiểm tra đặc tính kháng thể kháng huCD45exRO thu từ tế bào lai (hybridoma) 45 V.3.1 Kiểm tra khả tương tác với huCD45exRO western blot 45 V.3.2 Xác định isotype 46 V.3.3 Kiểm tra cấu trúc kháng thể western blot 47 V.3.4 Xác định dòng hybridoma tiết kháng thể tốt ELISA 48 V.3.5 Kiểm tra khả tương tác kháng thể thu nhận với kháng nguyên bề mặt tế bào 50 V.3.6 Kiểm tra khả tương tác kháng thể thu nhận dòng 16E8-F2 với isoform khác cuả CD45 50 V.3.7 Xác định số phân ly Kd kháng thể đơn dòng kháng CD45 dòng 16E8-F2 52 V.4 Bước đầu tinh kháng thể thu nhận qua cột protein G HP 5ml 53 V.5 Đánh dấu kháng thể với FITC kiểm tra nhuộm miễn dịch huỳnh quang với tế bào Jurkat CD45+ 54 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 VI.1 Kết luận 56 VI.2 Đề nghị 56 VIII.TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 59 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT aa Amp DTT E coli FACS HIV huCD45 IL IPTG Kana kb kDa KTĐD NK NST PBS PCR PMSF ptprc SDS-PAGE SSC WB Amino acid Ampicillin Dithiothreitol Escherichia coli Flourescence-activated cell sorting Human Immunodeficiency Virus human CD45 Interleukin Isopropyl β-D-1 thyogalactopyranoside Kanamycin kilobase kilodalton Kháng Thể Đơn Dòng Natural Killer cell Nhiễm Sắc Thể Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction Phenylmethylsulfonyl fluoride protein tyrosine phosphatase receptor type C Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis side scatter Western Blot DANH SÁCH BẢNG Bảng Thông tin cặp mồi 19 Bảng Thành phần phản ứng PCR .22 Bảng Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng Phản ứng cắt enzyme cắt giới hạn 370C, 23 Bảng Thành phần phản ứng nối 220C, 23 Bảng PCR 1: Thu nhận đoạn exon 3, 4, 5, 6, 20 Nu exon 24 Bảng PCR 2: Thu nhận đoạn exon 7-15 25 Bảng PCR 3: PCR overlap sản phẩm PCR PCR .25 Bảng PCR 4: Khuếch đại đoạn gene thu nhận từ PCR overlap 26 Bảng 10 Công thức đổ gel phân tách gel gom điện di SDS - PAGE .26 DANH SÁCH HÌNH Hình Cấu trúc protein CD45 13 Hình Vị trí gene ptprc NST số 13 Hình Gene cấu trúc CD45 14 Hình Các quần thể tế bào máu xác định CD45 SSC 16 Hình Thang DNA 1kb (ThermoScientific); Thang protein từ bio basic 20 Hình Sản phẩm PCR thu nhận đoạn gene huCD45exRO 34 Hình Kiểm tra plasmid pET28a+_huCD45exRO phương pháp PCR khuẩn lạc phản ứng cắt giới hạn (XhoI, BamHI) 35 Hình Kết SDS-PAGE, Western Blot kiểm tra biểu protein huCD45exRO BL21 (DE3) 36 Hình Kết SDS-PAGE khảo sát biểu protein huCD45exRO BL21 (DE3) điều kiện nuôi cấy khác 37 Hình 10 Kết SDS-PAGE khảo sát hiệu hòa tan pellet dung dịch urea 8M 38 Hình 11 Kết dung ly protein huCD45exRO phương pháp gradient sử dụng cột HisTrap HP 1ml 39 Hình 12 (A) Kết sắc ký đồ trình tinh protein huCD45exRO phương pháp sắc ký lực (B) Kết nhuộm bạc nitrat fraction thu tương ứng sắc ký đồ 40 Hình 13 PCR overlap thu nhận đoạn gene mã hóa cho protein huCD45exRABC 41 Hình 14 Kiểm tra pJET phản ứng cắt với enzyme XhoI BamHI 41 Hình 15 Kiểm tra sản phẩm tạo dịng gene mã hóa RABC pET28a+ enzyme cắt giới hạn XhoI BamHI 42 Hình 16 Kết kiểm tra ELISA huyết chuột trước sau gây đáp ứng miễn dịch với protein tái tổ hợp huCD45exRO 43 Hình 17 Biểu đồ thể kết sàng lọc phương pháp ELISA trực tiếp 196 giếng có xuất tế bào lai 44 Hình 18 Hình chụp ba dịng tế bào hybridoma có khả tiết kháng thể kháng huCD45 kính hiển vi (độ phóng đại x40) 45 Hình 19 Kết kiểm tra Western Blot protein huCD45exRO với ba loại kháng thể sơ cấp 46 Hình 20 Kết xác định chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể thu nhận 47 Hình 21 Kết kiểm tra western blot mẫu kháng thể sau tinh sơ với hạt protein A 48 Hình 22 Kiểm tra khả tương tác kháng thể thu nhận với kháng nguyên huCD45exRO qua ngày nuôi cấy 49 Hình 23 Kiểm tra khả tương tác kháng thể thu nhận từ hybridoma với kháng nguyên huCD45 bề mặt tế bào 50 Hình 24 Hình kiểm tra khả tương tác KTĐD kháng CD45 với dịch ly giải tế bào Jurkat HEK phương pháp westenn blot 51 Hình 25 Đường biểu diễn giá trị OD 450 kháng thể kháng huCD45exRO tương ứng với nồng độ kháng nguyên khác 52 Hình 26 Kết dung ly kháng thể kháng huCD45 từ dịch nuôi cấy hybridoma sử dụng cột protein G HP 5ml 53 Hình 27 Kiểm tra cấu trúc kháng thể chuột kháng huCD45 thu nhận sau tinh qua cột protein G HP 5ml 54 Hình 28 Kiểm tra khả tương tác kháng thể cộng gộp antiCD45-FITC với tế bào Jurkat 55 TĨM TẮT Kháng thể đơn dịng ứng dụng rộng rãi chẩn đoán điều trị nhiều bệnh khác đặc biệt ung thư chúng có khả tương tác đặc hiệu với phân tử đích – Kháng thể đơn dịng kháng CD45 – marker tế bào bạch cầu- sử dụng phổ biến xét nghiệm chẩn đoán theo dõi điều trị bệnh bạch huyết ung thư máu, suy tủy, theo dõi ca ghép tủy… kỹ thuật flow cytometry Đề tài nghiên cứu thực nhằm mục đích tạo kháng thể đơn dòng kháng CD45 đáp ứng nhu cầu sử dụng nước Để đạt mục tiêu nghiên cứu, vùng ngoại bào protein CD45RO người (huCD45exRO) tạo dòng biểu hệ thống E.coli BL21 (DE3) Quy trình tinh protein huCD45exRO từ tế bào vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) sắc ký lực thiết lập với hiệu suất tinh đạt 40% độ tinh protein đạt 90% Protein tái tổ hợp huCD45exRO tinh sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch chuột Balb/c Quá trình gây đáp ứng miễn dịch chuột đạt hiệu cao với hiệu giá kháng thể kháng huCD45exRO đạt mức 1/25.600 đến 1/51.200 độ pha lỗng huyết Tế bào lách chuột có hiệu giá kháng thể cao thu nhận dung hợp với tế bào myeloma để tạo dòng tế bào lai (hybridoma) Kết chọn lọc ni cấy trì dịng tế bào lai có khả sản xuất kháng thể kháng huCD45exRO Kháng thể tiết từ dòng tế bào lai có khả nhận diện kháng nguyên kiểm tra phương pháp ELISA, western blot, nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng nguyên bề mặt tế bào JurkatCD45+ Chúng tơi xác định dịng tế bào cho hiệu sản xuất kháng thể tốt thông qua phương pháp ELISA Bước đầu tinh kháng thể từ dòng tế bào lai (hybridoma) phương pháp sắc kí lực sử dụng cột protein G Đồng thời, tiến hành đánh dấu FITC lên kháng thể tinh thu nhận 10 Áp dụng công thức mục IV 3.6.4 xác định số Kd tương ứng Từ đó, xác định giá trị Kd trung bình kháng thể kháng huCD45exRO: Kd= 7,13 ±1,01 ×10-10 (M) Thơng thường, giá trị kháng thể đơn dòng chuột có Kd nằm khoảng micromolar (10-6) nanomolar (10-7-10-9) Những kháng thể coi có lực mạnh Kd thấp mức độ nanomolar (10-9) (theo Hãng abcam) Như vậy, với kết Kd= 7,13 ±1,01 ×10-10, kháng thể kháng CD45 thu nhận từ tế bào lai dịng 16E8-F2 chúng tơi kháng thể đơn dịng chuột có lực lớn với kháng nguyên huCD45exRO với Kd đạt mức picomolar V.4 Bước đầu tinh kháng thể thu nhận qua cột protein G HP 5ml Ni cấy dịng tế bào hybridoma 16E8-F2 điều kiện 370C, 5% CO2 để thu nhận dịch nuôi cấy để sử dụng cho tinh kháng thể kháng huCD45 cột protein G HP 5ml (Hình 26) Dịch ni cấy nạp vào cột, cột cân loại bỏ protein khơng có lực với protein G 20mM sodium phosphate pH 7.4 Sau cột đạt trạng thái cân bằng, protein có tương tác với protein G giải khỏi cột dịch giải glycine 0.1M pH 2.7 Thu nhận fraction tương ứng với thể tích 1ml/fraction Độ tinh kháng thể thu fraction giải kiểm tra phương pháp điện di SDS-PAGE (Hình 26) B A Hình 26 Kết dung ly kháng thể kháng huCD45 từ dịch nuôi cấy hybridoma sử dụng cột protein G HP 5ml (A): Sắc kí đồ; (B): Kết nhuộm comassie blue fraction thu tương ứng sắc ký đồ In: mẫu protein trước tinh sạch; Out: mẫu protein không gắn cột; 6-12: fraction giải từ cột Kết cho thấy, trình tinh kháng thể cột protein G loại bỏ phần lớn protein dịch nuôi cấy giữ lại kháng thể IgG (Hình 26) Tuy nhiên độ tinh kháng thể thu fraction 8, 9, 10 chưa cao Độ tinh kháng thể đạt cao fraction Kháng thể fraction kiểm tra cấu trúc phương pháp điện di SDSPAGE khơng bổ sung ß-mercaptoethanol buffer biến tính mẫu; Kết cho thấy, khơng bổ sung ß-mercaptoethanol, protein chủ yếu xuất dạng kích thước 53 khoảng 170kDa (Hình 27.A) Trong đó, điều kiện có ß-mercaptoethanol, protein thu nhận sau tinh chủ yếu xuất hai vạch có kích thước khoảng 50kDa 25kDa tương ứng với chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể Điều cho thấy, kháng thể sau tinh giữ cấu trúc Kháng thể thu nhận sau tinh qua cột protein G kiểm tra phương pháp western blot với kháng thể đặc hiệu kháng chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể chuột (anti IgG mouse (H+L) -62-6520 thermofisher) Kết cho thấy, vị trí tương ứng với chuỗi nặng (50kDa), chuỗi nhẹ (25kDa) điện di biến tính có sử dụng ß-mercaptoethanol vị trí tương ứng với cấu trúc tự nhiên kháng thể (150kDa) điện di khơng biến tính khơng sử dụng ß-mercaptoethanol xuất vạch dương tính tương ứng (Hình 27.B) Như vậy, kháng thể thu nhận sau tinh qua cột protein G kháng thể chuột có cấu trúc Hình 27 Kiểm tra cấu trúc kháng thể chuột kháng huCD45 thu nhận sau tinh qua cột protein G HP 5ml (A): Điện di gel SDS-PAGE; (B): Kiểm tra western blot với kháng thể đặc hiệu kháng kháng thể chuột (anti IgG mouse (H+L) (62-6520 thermofisher) V.5 Đánh dấu kháng thể với FITC kiểm tra nhuộm miễn dịch huỳnh quang với tế bào Jurkat CD45+ Kháng thể kháng CD45 tạo đề tài với mục tiêu ứng dụng chẩn đoán bệnh máu phương pháp FACS Do đó, việc cộng gộp kháng thể với chất phát huỳnh quang điều cần thiết để ứng dụng phương pháp Trong phạm vi đề tài, chọn FITC chất phát huỳnh quang để tiến hành cộng gộp với kháng thể thu nhận Quá trình đánh dấu thực theo kit thương mại FlouroTag FITC conjugation kit (FITC1-1KT- Sigma) Mẫu kháng thể sau ủ với chất phát huỳnh quang tinh qua cột lọc gel để loại FITC dư khỏi phân đoạn chứa kháng thể cộng gộp (antiCD45-FITC) AntiCD45-FITC thu nhận kiểm tra khả 54 tương tác với kháng nguyên thông qua phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang với tế bào Jurkat CD45+ Dựa vào cơng thức tính tỉ lệ molar F/P (mục IV.3.8), đánh giá hiệu đánh dấu FITC lên protein mục tiêu sản phẩm sau cộng gộp: 2.77 × 𝐴495 𝑀𝑜𝑙𝑎𝑟 𝐹/𝑃 = 𝐴280−(0.35 × 𝐴495 ) Với A280= 0.487; A495= 0.387  Molar F/P = 3,05 Tỉ lệ molar F/P nằm khoảng [3;6] tối ưu cho hầu hết trình cộng gộp kháng thể (Sigma) Tỉ lệ F/P cao tín hiệu thu nhận phân tích cao Tuy nhiên, molar F/P > 6, tín hiệu (background) tăng lên tương ứng Thông thường, kháng thể thương mại đánh dấu huỳnh quang có tỉ lệ molar F/P nằm khoảng [4.5; 6] (abcam) CD45+Jurkat +IgGFBS CD45+Jurkat +antiCD45-FITC CD45+Jurkat +MEM-28 Hình 28 Kiểm tra khả tương tác kháng thể cộng gộp antiCD45-FITC với tế bào Jurkat Trên: kính hiển vi thường; Dưới: kính hiển vi huỳnh quang Kết kiểm tra cho thấy, mẫu chứng dương (sử dụng kháng thể sơ cấp MEM-28; kháng thể thứ cấp: goat anti-mouse IgG-FITC (sc-2010) mẫu sử dụng sản phẩm cộng gộp antiCD45-FITC cho tín hiệu dương tính Trong đó, mẫu chứng âm nhuộm tế bào JurkatCD45+ IgG có huyết khơng cho tín hiệu (Hình 28) Như vậy, trình cộng gộp kháng thể với chất đánh dấu huỳnh quang FITC kit thương mại FlouroTag FITC conjugation kit (FITC1-1KT- Sigma) có hiệu Tuy nhiên, tín hiệu thu nhận từ mẫu cộng gộp antiCD45-FITC cho tín hiệu thấp so với kháng thể thương mại dòng MEM-28 Nguyên nhân: Chưa tối ưu quy trình cộng gộp kháng thể với chất đánh dấu huỳnh quang; Mẫu antiC45-FITC dùng để nhuộm trực tiếp tế bào Jurkat CD45+ không dùng kháng thể thứ cấp; đó, nhuộm tế bào mẫu kháng thể thương mại MEM-28 chúng tơi có sử dụng kháng thể 55 thứ cấp goat anti-mouse IgG-FITC (sc-2010) vốn khuếch đại tín hiệu huỳnh quang nhiều phân tử kháng thể thứ cấp gắn lên phân tử kháng thể sơ cấp VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ VI.1 Kết luận Dựa vào kết đạt đối chiếu với mục tiêu đề đề tài, đến kết luận sau: - - - - - - Tạo dịng thành cơng plasmid biểu pET28a+_huCD45exRO pET28a+_huCD45exRABC mang gene mã hóa cho vùng ngoại bào protein CD45-RO Biểu tinh thành công protein tái tổ hợp huCD45exRO thu nhận từ thể vùi chủng biểu BL21 (DE3) mang plasmid mục tiêu với hiệu suất tinh 40% độ tinh 90% Gây đáp ứng miễn dịch thành công chuột Balb/c với kháng nguyên huCD45exRO tinh Sàng lọc bước đầu thu nhận dòng tế bào lai hybridoma có khả sản xuất kháng thể kháng protein huCD45exRO mục tiêu Kháng thể biểu từ dịng tế bào lai có khả tương tác với protein huCD45exRO thử nghiệm ELISA, western blot, nhuộm miễn dịch huỳnh quang; xác định dạng isotype kháng thể Xác định lựa chọn dòng tế bào hybridoma tốt thông qua phương pháp ELISA, xác định số phân ly Kd kháng thể đạt Kd= 7,13 ±1,01 ×10-10 (M) Xác định khả tương tác kháng thể kháng CD45 thu nhận với dạng isoform khác CD45 trog dịch ly giải tế bào Jurkat CD45+ (isoform RA RO), không tương tác chéo với CD khác (CD18, CD28) Bước đầu tinh kháng thể thu nhận từ dịch ni cấy dịng tế bào lai 16E8-F2 Kháng thể đơn dòng anti-huCD45 đề tài đánh dấu FITC kháng thể cộng gộp hoạt động phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang với tế bào Jurkat VI.2 Đề nghị - - - Tối ưu hóa quy trình tinh kháng thể kháng CD45, nuôi cấy tế bào môi trường khơng huyết để xác định xác mức độ tinh phương pháp sắc kí lực sử dụng cột protein G Tối ưu hóa quy trình cộng gộp kháng thể thu nhận với FITC (nâng cao tỉ lệ F/P) nhằm gia tăng tín hiệu kháng thể kiểm tra FACS nhuộm miễn dịch huỳnh quang Thử nghiệm kháng thể antiCD45-FITC phân tích flow cytometry để xác định hiệu ứng dụng kháng thể phân tích bệnh máu 56 VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) Elma Z Tchilian, Peter C.L Beverley.(2006) Altered CD45 expression and disease trends in Immunology.Vol.27 No.3 Mach (2) Diaz Del Pozo E., beverley P C and Timon M (2000) Genomic structure and sequence of the leukocyte common antigen ( CD45) from the fish Fugu rubripes and comparison with its mammalian homologue Immunogenetics, 51, 838-846 (3) M Timón & P C L Beverley.(2001) Structural and funtional analysis of the human CD45 gene (PTPRC) upstream region: evidence for a functional promoter within the first intron of the gene Immunology, 102 180-189 (4) Elma Z Tchilian and Peter C L Beverley.(2002) CD45 in Memory and Disease Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 50, 85-93 (5) Akbar A N., Terry L., Timms A., Beverey P C and Janosy G (1988) Loss of CD45R and gain of UCHL1 reactivity is feature of primed T cells J Immunol., 140, 2171-2178 (6) Mackay C R., marston W L and Dudler L (1990) Naïve and memory T cells show distinct pathways of lymphocyte recirculation J Exp Med., 171, 801-817 (7) Junko Irie-Sasaki, Takehiko Sasaki, Wataru Matsumoto, Anne Opavsky, Mary Cheng, Grant Welstead, Emily Griffiths, Connie Krawczyk, Christopher D Richarson, karen Aitken, Norman Iscove, Gary Koretzky, Pauline Johnson, Peter Liu, David M Rothstein & Josef M Penninger.(2001) CD45 is a JAK phosphatase and negative regulates cytokine receptor signalling Nature, 409, 349-354 (8) Ogilvy, S et al (2003) Either of the CD45RB and CD45RO isoforms are effective in restoring T cell, but not B cell, development and function in CD45-null mice J Immunol 171, 1792-1800 (9) Tchilian, E Z et al (2004) Altered CD45 isoform expression affects lymphocyte funtion in CD45 Tg mice Int Immunol 16, 1323-1332 (10) Penniger, J.M.et al (2001) CD45: new jobs for an old acquaintance Nat Immunol 2, 389-396 (11) Gregori, S et al (2005) An anti-CD45RO/RB momoclonal antibody modulates T cell responses via indution of apoptosis and generation of regulatory T cells J Exp Med 201, 1293-1305 (12) Kohler, G and Milstein, C (1975) Continuous cultures of fused cells producing antibodies of predefined specificity Nature 256, 495-497 (13) Ritter, M.A and Ladyman, H M (eds) (1995) Monoclonal Antibodies: Producttion, Engineering and Clinical Application Cambridge University Press, Cambridge, UK (14) Xiaocong Yu, Patricia A McGraw, Frances S House, James E Crowe Jr (2008) An optimized electrofusion – based protocol for generating virus – specific human monoclonal antibodies Journal of Immunological Methods, 336, 142-151 (15) Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Khánh, Lê Trần Bình.( 2007) Tạo dịng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6, 203-208 57 (16) Ferenc Orosz, Judit Ovadi.(2002) A simple method for the determination of dissociation constants by displacement ELISA Journal of Immunological Methods, 270, 155– 162 (17) Beatty, J D., Beatty, B G., & Vlahos, W G (1987) Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay J Immunol Methods, 100(12), 173-179 (18) Lynch, K W., & Weiss, A (2000) A model system for activation-induced alternative splicing of CD45 pre-mRNA in T cells implicates protein kinase C and Ras Mol Cell Biol, 20(1), 70-80 (19 ) Roose, J P., Diehn, M., Tomlinson, M G., Lin, J., Alizadeh, A A., Botstein, D., Weiss, A (2003) T Cell Receptor-Independent Basal Signaling via Erk and Abl Kinases Suppresses Gene Expression PLoS Biol, 1(2), e53 doi: 10.1371/journal.pbio.0000053 TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm PGĐ CHUN MƠN KT TRƯỞNG PHỊNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PHĨ TRƯỞNG PHỊNG TS Nguyễn Đăng Qn ThS Nguyễn Văn Nguyên GIÁM ĐỐC TS Dương Hoa Xô 58 ThS Tạ Hương Giang PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết giài trình tự nucleotide đoạn gene mã hóa vùng ngoại bào huCD45exRO mồi T7 promoter thực Macrogen 59 60 Phụ lục 2: Kết so sánh trình tự đoạn gene mã hóa phần ngoại bào huCD45exRO kết giải trình tự mồi T7 promoter trình tự NM_080921.3 (NCBI) 61 Phụ lục 3: Kết giài trình tự nucleotide đoạn gene mã hóa vùng ngoại bào huCD45exRO mồi T7 terminal thực Macrogen 62 63 Phụ lục 4: Kết so sánh trình tự đoạn gene mã hóa phần ngoại bào huCD45exRO kết giải trình tự mồi T7 terminal trình tự NM_080921.3 (NCBI) 64 Phụ lục 5: Kết so sánh phần trăm độ tinh huCD45exRO (%) hiệu suất tinh riêng phần huCD45exRO (%) phần mềm ImageJ dựa kết nhuộm bạc Hình: Kết nhuộm bạc nitrat fraction sau tinh Bản gel chuyển sang định dạng 32-bit để phù hợp với yêu cầu phần mềm JmageJ (*) Dịch protein chứa huCD45exRO trước tinh Bảng: Hiệu suất tinh riêng phần huCD45exRO (%) Hàm lượng Phần trăm protein độ tinh huCD45exRO (%) (ug) 100 92.10 313,63 100 100 Hàm lượng protein tổng (ug) 10,82 % Fraction 14,78 214,24 62,62 38,92 Dung dịch protein trước tinh 1609,96 40,03 Hiệu suất tinh riêng phần (%) 48,66% 644,46 Phụ lục 6: Kết kiểm tra ELISA trực tiếp huyết chuột Balb/c trước sau gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên huCD45exRO Chuột Chuột Chuột Huyết trước gây đáp ứng 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 2.874 3.293 3.245 3.375 3.608 3.555 3.520 3.353 2.927 2.349 1.630 3.206 3.280 3.411 3.596 3.670 3.430 3.624 3.208 2.793 2.017 1.391 2.488 3.166 3.126 3.368 3.298 3.329 3.374 2.879 2.512 1.925 1.305 0.208 0.154 0.108 0.094 0.062 65 0.042 0.041 0.028 0.015 0.010 0.005 Phụ lục 7: Kết sàng lọc phương pháp ELISA trực tiếp 196 giếng có xuất tế bào lai (hybridoma) STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm 1B5 0.739 11 E10 0.785 21 E11 3.08 31 E7 0.864 41 10F9 0.756 51 14D10 0.883 61 19C8 1.079 71 21B11 0.94 81 3G8 0.796 91 17 E7 1.142 101 5G5 0.526 111 14G4 0.734 121 21H2 0.814 131 4B12 1.264 141 5B9 1.737 2B8 0.957 12 4F7 0.889 22 7C9 0.796 32 E8 0.717 42 10G6 1.291 52 16D12 0.831 62 19G3 0.84 72 21C8 0.522 82 4B5 1.721 92 18 E3 0.738 102 5G11 0.989 112 15B4 1.35 122 18C11 0.929 132 4C5 1.36 142 5F6 1.332 E9 0.771 13 4F9 1.181 23 E2 1.445 33 9F3 0.98 43 11F9 0.966 53 16 E8 3.361 63 20B3 0.836 73 21D3 0.654 83 4B10 0.995 93 20F2 1.407 103 6D9 0.673 113 15B10 3.285 123 18 E2 0.598 133 4C6 1.048 143 5G6 0.969 2F5 0.829 14 4G2 0.863 24 7F1 1.026 34 9G11 0.749 44 11F10 3.265 54 16F5 0.784 64 20C4 0.77 74 21 E7 0.479 84 E1 3.08 94 21B11 1.167 104 7C7 0.955 114 15C2 0.592 124 18F3 0.822 134 4C8 1.105 144 10B6 0.932 2H5 1.126 15 H7 1.148 25 7G2 2.364 35 10A9 1.253 45 11G4 1.127 55 16G7 0.514 65 20 E2 0.968 75 21 E10 0.488 85 5F9 0.883 95 21 E2 1.511 105 7C8 0.556 115 18A9 1.077 125 18G9 0.564 135 E6 1.136 145 10F1 1.197 66 3B3 0.744 16 E6 0.66 26 E6 0.774 36 10D3 0.809 46 12B1 1.015 56 17A10 0.779 66 20F2 1.111 76 21G4 0.761 86 7G10 1.129 96 21G8 2.507 106 7G10 0.703 116 18G6 0.559 126 1H6 2.909 136 E7 0.665 146 9B2 1.076 3D1 1.248 17 E9 1.439 27 E7 0.772 37 10 E2 0.599 47 12B11 0.809 57 17C6 2.126 67 20F6 0.671 77 1F6 0.927 87 E8 0.779 97 2H12 1.102 107 E8 0.505 117 19F6 0.908 127 2D12 1.048 137 H3 1.353 147 9D3 1.254 4C3 0.832 18 5F3 1.006 28 E11 0.605 38 10 E3 0.91 48 12G8 0.844 58 17 E10 3.001 68 20F7 0.811 78 1G6 0.612 88 14G9 0.766 98 1F10 0.73 108 9G4 0.801 118 19G5 1.07 128 E6 1.127 138 H11 1.187 148 9G11 1.417 4D5 1.241 19 5F5 0.971 29 8F5 0.789 39 10F4 1.245 49 12H6 1.12 59 17F4 0.812 69 20F8 0.911 79 3A10 0.811 89 15F6 0.785 99 E10 0.874 109 11B10 3.271 119 21C2 3.173 129 E11 1.257 139 5B3 1.005 149 7C10 1.555 10 4D10 0.824 20 5F11 0.723 30 8H4 1.98 40 10F5 0.65 50 14B2 0.845 60 19C1 1.455 70 20G5 0.861 80 3C11 0.758 90 16B7 0.613 100 E11 0.964 110 13G5 0.673 120 21F2 1.551 130 4A3 1.384 140 5B7 1.062 150 6C6 1.01 STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm STT Vị trí giếng OD 405nm 151 6D10 0.963 161 15H5 1.212 171 18A9 1.5 181 21B2 1.343 191 3G12 1.454 152 6H5 0.967 162 16C7 1.217 172 18D3 0.97 182 21G2 1.759 192 5B3 0.746 153 11F8 1.48 163 16G8 1.286 173 18D10 1.224 183 21C8 1.113 193 5G9 2.135 154 12B9 0.785 164 17G4 1.191 174 18 E9 1.808 184 1F3 1.686 194 5G10 0.674 155 12 E8 1.168 165 17B4 1.721 175 18G4 1.138 185 2D12 0.812 195 7C8 1.113 156 13F12 1.743 166 17C10 0.844 176 18G10 0.964 186 E6 0.802 196 10C7 0.92 157 13H4 1.472 167 17 E6 0.697 177 19C3 1.005 187 3B5 2.054 158 15A2 1.197 168 17F3 0.928 178 20A4 1.002 188 3C1 2.016 159 15C11 1.108 169 17F8 0.929 179 20C2 1.382 189 E2 1.903 160 15D11 0.966 170 18A5 1.265 180 20H11 1.187 190 E3 1.966 Phụ lục 8: Kết xác định mật độ ba dòng hybridoma qua ngày nuôi cấy Ngày 450000 920000 920000 810000 680000 15B10-E5 460000 880000 940000 840000 620000 480000 660000 840000 820000 620000 350000 640000 740000 800000 650000 16E8-E2 320000 610000 880000 680000 750000 350000 560000 710000 850000 630000 610000 770000 1050000 780000 710000 16E8-F2 470000 710000 1080000 710000 730000 460000 710000 1020000 780000 610000 Phụ lục 9: Kết ELISA kiểm tra khả tiết kháng thể ba dịng hybridoma qua ngày ni cấy Ngày 0.1410 0.1720 0.1765 0.2615 0.1835 15B10-E5 0.1505 0.1780 0.1805 0.1375 0.1850 0.1465 0.1720 0.1900 0.1400 0.1825 0.1960 0.1615 0.2385 0.2165 0.1765 16E8-E2 0.2035 0.1585 0.2565 0.2340 0.1810 67 0.201 0.156 0.262 0.253 0.204 0.2540 0.2160 0.3535 0.2640 0.2990 16E8-F2 0.2585 0.2155 0.3925 0.2735 0.3205 0.2705 0.2255 0.4195 0.3295 0.3775