PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ALKALINE PHOSPHATASE TRÊN CƠ SỞ BIẾN TÍNH ĐIỆN CỰC BẰNG ỐNG CARBON NANO ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ NẤM MỐC PATULIN

Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học – Tập 20, số 4/2015 PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ALKALINE PHOSPHATASE TRÊN CƠ SỞ BIẾN TÍNH ĐIỆN CỰC BẰNG ỐNG CARBON NANO ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ NẤM MỐC PATULIN Đến tòa soạn 31 - – 2015 Mai Thị Thanh Huyền Trường Đại học Vinh E.P.Medyantseva, R.M Varlamova Đại học Tổng hợp Quốc gia Kazan, Nga SUMMARY DEVELOPMENT OF ALKALINE PHOSPHATASE BIOSENSORS BASED ON ELECTRODES MODIFIED WITH MULTIWALLED CARBON NANOTUBES FOR THE DECTERMINATION OF PATULIN Amperometric biosensors based on platinum screen-printed electrodes modified with multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) and immobilized enzymes alkaline phosphatase developed for the determination of patulin Biosensor used in patulin detection based on the inhibition of enzymatic activities The working concentration range is 110-6 –110-10 mol/l, limit of quantitation is 510-11 mol/l Modification of electrode with MWCNT allows achieving wider range of detectable concentrations, lower detection limits, and more pronounced effect of inhibition Keywords: patulin, alkaline phosphatase, mycotoxins, carbon nanotube, amperometric biosensor MỞ ĐẦU Mycotoxin nhóm độc tố chủng nấm mốc Aspergillus Penicillium, phát nước nguy hiểm gây mối đe dọa với sức khỏe cộng đồng Patulin (PAT) trái cây, rượu táo sản phẩm từ táo Patulin thường xác định độc tố mạnh quan tâm khả gây ung phương pháp sắc ký sắc ký khí, sắc ký lỏng [1,2] với đầu dị khối phổ [3], thư, ức chế hệ miễn dịch, gây sưng viêm loét niêm mạc ruột Patulin hình thành huỳnh quang [4] Các phương pháp có độ nhạy độ chon lọc cao lại tốn 243 địi hỏi tính chun mơn hóa cao khuếch tán qua màng bán thấm người phân tích Công nghệ cảm biến sinh học trường hợp hữu ích vào lớp mỏng vật liệu sinh học gắn bề mặt điện cực, phản ứng phát độc tố nấm mốc nhờ khả đo lường nhanh, độ nhạy cao enzyme hoá diễn bề mặt điện cực Dựa thay đổi dòng điện để xác sử dụng thuận lợi so với phương pháp truyền thống khác Một số cảm biến định hàm lượng chất cần xác định [9] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP sinh học khác sử dụng để phân tích độc tố mấm mốc [5,6] NGHIÊN CỨU nhiên việc phát triển cảm biến sinh học để xác định PAT hạn chế 2.1.1 Hoá chất 1- naphthyl phosphate (Russia), alkaline [7] Rất nhiều loại vật liệu nghiên cứu phosphatase (Sigma), chitosan (Sigma) Dung dich 1% glutaraldehyde (GA) ứng dụng để sử dụng làm tác nhân gắn kết cảm biến sinh học, vật hãng ICN albumin huyết bò (BSA) 5% hãng Rianal (Hungari), nano liệu nano carbon với nhiều tính chất đáng ý khả dẫn điện cao, nhóm carbon đa lớp MWNT có đường kính – nm đến 10 - 15 nm (Sigma) chức –COOH tạo biến tính làm tăng tương tác hóa sinh, có triển vọng để tạo thiết bị cảm biến sinh học với 2.1.2 Thiết bị Hệ điện cực chế tạo từ kỹ thuật in lưới sở cho cảm biến sinh học bao mục đích cải thiện hiệu suất phân tích, làm tăng độ nhạy bề mặt điện cực gồm: điện cực làm việc, điện cực phụ trợ điện cực so sánh (BVT technologies, Brno, loại phân tử khác [8] Trong báo cáo chúng tơi chúng tơi đưa cộng hồ Sec) Điện cực làm việc platin bột nhão Điện cực phụ trợ platin điện cảm biến sinh học dòng điện (amperometric biosensor) sử dụng đầu thu cực so sánh làm bạc Thể tích ống điện hố làm việc 200 µl enzyme alkaline phosphatase (ALP) cố định bề mặt điện cực in lưới Pt Tất phép đo thực thiết bị đo điện hoá đa MEB kết nối với (screen-printed electrode) biến tính nano carbon để xác định PAT máy tính Nguyên lý làm việc cảm biến sinh học điện đơn giản Thành phần xác định 244 2.1 Vật liệu Điện cực làm việc Điện cực so sánh Điện cực phụ trợ 25,5 мм 7,2 мм Hình Thiết bị đo điện hố đa “MEB” điện cực kết hợp 2.2 Biến tính điện cực vật liệu nano carbon MWNT rung siêu âm hỗn hợp mg/ml [10] Dung dịch có chứa nhóm dung dịch axit đậm đặc HNO3: H2SO4 (1:3) -OH nhóm -NH- làm tăng độ phân tán để tiến hành chức hóa - Dung dịch thu đem rửa nước chúng nước đồng thời giúp cho thành phần sinh học enzyme xâm cất nhiều lần đạt pH = rửa lần cuối etanol, sau đem sấy nhập cố định tốt bề mặt ống hay ruột ống Gắn thể tích xác định (0,5 khô 500C- 600C đến khối lượng không đổi hịa tan chitosan (0,5% CH3- µl) dung dịch MWNTs 1mg/l lên bề mặt điện cực làm việc, để khô cho vào tủ lạnh bảo COOH) để thu dung dịch MWNTs quản 40C MWNT Chitosan (CTS) MWNTs tác nhân gắn kết GA Nguyên lý 2.3 Chuẩn bị cảm biến sinh học Để có đầu thu sinh học enzyme ALP, bề mặt điện cực tiến dựa phản ứng phân tử enzyme với hai nhóm carbonyl GA tạo thành hành cố định chế phẩm có chứa enzyme phương pháp liên kết đồng hóa trị với đại phân tử không tan Lớp enzyme cố định làm tăng độ ổn định tín hiệu Chế phẩm chuẩn bị bao gồm dung đệm phosphate (pH = 7,0), dung dich GA dịch enzyme, dung dịch BSA, dung dịch 1% nước cất (GA cho vào cuối 245 cùng) Lấy μl hỗn hợp thu đem gắn bề mặt điện cực làm việc Điện cực chuẩn bị xong để khô, đem bảo quản hộp petri đêm nhịêt độ 40C Sau đem rửa nhẹ nước, để khơ ngồi khơng khí bảo quản tủ lạnh trước đem sử dụng Các cảm biến sinh Sản phẩm phản ứng chất hoạt động điện hóa, bề mặt điện cực platin bị oxi hóa thành 1,4 dihydroxy-naphthalene [11]: học thu sử dụng vòng tuần với sai số phép đo không vượt 5% Điện cực enzyme chế tạo dạng màng mà mặt tiếp xúc với mơi trường chất cịn mặt tiếp xúc với vùng đo Phản ứng chất – enzyme xảy KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN lớp màng Kết thay đổi lượng tự điện cực thu nhận truyền qua 3.1 Sự hình thành tín hiệu phân tích cảm biến sinh học Tiến hành đo điện cực ALP với chất 1- naphthyl phosphate 10-3M điều kiện hệ thống đo dạng đo dòng điện đo điện pH tối ưu khảo sát (pH =7,6) đệm tris-HCl Kết thu được Phản ứng enzyme hóa với tác nhân phản mơ tả hình ứng 1- naphthyl phosphate : I, 1.5 0.5 300 500 700 900 Е, Hình 2: Đường von - ampe dung dịch 1- naphthyl phosphate 10-3M đệm tris - HCl (pH = 7,6) điện cực ALP Cường độ dòng cao đo điện áp ALP giảm xuống Điều chứng tỏ PAT +0,6V nghiên cứu sử dụng điện áp cho cảm biến chất kìm hãm hoạt tính enzyme cảm biến sinh ALP sử dụng cảm sinh học ALP Nghiên cứu ảnh hưởng PAT đến biến sinh học để định lượng PAT Sử dụng cảm biến sinh học enzyme cố định cảm biến sinh học biến tính điện cực MWNTs cho thấy dịng điện cho thấy: với có mặt PAT cường độ dịng cảm biến sinh học có tăng tín hiệu phân tích so với điện cực khơng biến tính Điều 246 giải thích gia tăng bề mặt điện enzyme vào màng điện cực làm cực, làm tăng khả bám dính tăng độ dẫn điện chúng (а) (b) (c) (d) Hình 3: Ảnh SEM bề mặt điện cực Pt trước sau gắn enzyme (a), (b) điện cực biến tính MWNTs trước sau gắn enzyme (c), (d) 3.2 Xác định số thông số động học ALP Lập hệ phương trình Michaelis – Menten tính tốn cho thấy với chất 1- naphthyl biến tính MWNTs với chất 1naphthyl phosphate 10-3M trước sau phosphate khơng có mặt chất kìm hãm enzyme PAT có Km = (18,7±0,4).10-5 M, logarit nồng độ PAT với tỷ lệ ức chế I (% ức chế I = [(Io-Iр)/Io]×100 - Io, Iр – giá trị Vmax = (0,74±0,05).10-6 mol/l.s Khi có mặt chất kìm hãm PAT 10-7M Km = cường độ dịng khơng có có PAT) Kết thu cho bảng cho thấy việc (2,1±0,1).10-5 M; Vmax = (0,31±0,02).10-6 mol/l.s, điều cho thấy PAT chất kìm sử dụng vật liệu carbon nano để biến tính điện cực làm tăng khoảng tuyến tính nồng hãm phi cạnh tranh độ PAT, đồng thời làm giảm giới hạn định lượng LOQ tăng độ nhạy phương 3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn Tiến hành đo cường độ dịng điện điện cực ALP biến tính chưa thêm vào nồng độ khác PAT Xây dựng đồ thị mối liên hệ phụ thuộc pháp 247 Bảng Các đặc trưng phân tích cảm biến để xác định PAT (n = 5, P = 0,95) Phương trình đường chuẩn Cảm biến sinh học Khoảng nồng độ tuyến tính I= (a± δ)+ (b± δ)×(-lg с), r LOQ, Mol/l Mức độ kìm (mol/l) a± δ b± δ R2 ALP 1×10-6-1×10-9 693 -4.80.4 0.9870 4×10-10 76±1 ALP – MWNTs 1×10-6-1×10-10 78±5 -6.9± 0.5 0.9942 5×10-11 90±2 Để đánh giá độ phương pháp chúng tơi tiến hành phân tích mẫu nhân tạo với nồng độ khác PAT, kết thu được biểu diễn bảng Bảng Kết xác định PAT mẫu giả cảm biến sinh học ALP – MWNTs (n=5, P=0.95) Nồng độ thật Nồng độ xác định (Mol/l) RSD 5×10-7 (5,10,2)×10-7 0,039 4×10-8 (3,90,2)×10-8 0,049 (Mol/l) Từ kết thu nhận xét sử dụng cảm biến sinh học dòng điện đầu thu ALP để xác đinh PAT lương thực, thực phẩm 3.4 Định lượng PAT số mẫu thực phẩm Để tiến hành định lượng PAT số loại nước táo táo nhập thị trường, mẫu phân tích đem chiết hai lần với ethyl axetat, dịch chiết thu cho thêm 2ml dung dịch Na2CO3 (14g/l) giọt axit axetic, lắc kỹ sau đem cất quay chân khơng Cặn thu đem hịa tan 1ml nước đem phân tích Hiệu suất thu hồi phương pháp đạt 85 – 90% 248 Mẫu Hàm lượng Mol/l hãm % RSD Nước táo trẻ em “Сады (2.4±0.1)× 10-10 0.042 Придонья” (Nga) Nước ép táo-đào “Красная цена” (Nga) (8.0 ±0.3)× 10-9 0.038 Quả táo (Balan) (4.4±0.2)× 10-7 0.045 KẾT LUẬN Đã phát triển cảm biến sinh học dòng điện sử dụng đầu thu enzyme alkaline phosphatase với điện cực Pt biến tính MWNTs để xác định patulin Đã xác định số thông số động học ALP sử dụng chất 1- naphthyl phosphate cho thấy PAT chất kìm hãm phi cạnh tranh phản ứng enzyme hóa Đã xây dựng phương trình đường chuẩn phương pháp xác định PAT điện cực biến tính chưa biến tính MWNTs Đã tiến hành định lượng patulin số mẫu táo nước táo nhập thị trường với hiệu suất thu hồi phương pháp đạt 85-90 % Bằng phương pháp cảm biến sinh học dòng điện sử dụng đầu thu ALP cố định bề mặt điện cực in lưới Pt biến tính nano carbon xác định độc tố patulin lương thực, thực phẩm, cho phép kiểm soát chất lượng thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Athanasios M., Vasiliki P., Panagiota M (2008) Determination of patulin in fruit juices using HPLC-DAD and GC-MSD techniques Food Chem 109-860-867 Maria J.B., Paula C.A., Cristina M.M (2010) Almeida Occurrence of patulin in apple-based-foods in Portugal Food Chem 121-653-658 Michael R., Florian K., Volker S., Florian L (2004) Absorption of the mycotoxin patulin from the rat stomach Food and Chem Toxicol 42-729–735 De Champdoré M., Bazzicalupo P., De Napoli L., Montesarchio D., Di Fabio G., Cocozza I., Parracino A., Rossi M., D'Auria S (2007) A new competitive fluorescence assay for the detection of patulin toxin Anal Chem 79 (2) 751-757 Shephard G.S., Berthiller F., Burdaspal P.A., Crews C., Jonker M.A., Krska R., MacDonald S., Malone R.J., Maragos C., Sabino M., Solfrizzo M., Van Egmond H.P., Whitaker T.B (2012) Developments in mycotoxin analysis: an update for 20102011, World Myco J - 3–30 Asunción Alonso-Lomillo M., Domínguez-Renedo O., del Torno-de Roman L., Arcos-Martínez M J.- Horseradish (2011) peroxidase-screen printed biosensors for dectermination of Ochratoxin A, Analyt Chim Acta 688-49–53 Starodub N.F., Pilipenko I.V., Pilipenko L.N., Katsev A.M (2010) Express Control of Toxicity and Content of Patulin by Optical Biosensors NSTI-Nanotech, - 137–140 Mai Thi Thanh H., Medyantseva E.P., Varlamova R.M., Sahapova G.R., Nikolaeva O.V (2012) The determination of zearalenone by amperometric biosensors based on modified with carbon nanotubes electrode Journal "Vestnik of Kazan State Agrarian University" - 149–153 Budnikov G.K, Maystrenko V.N., Vyaselev M.R (2003) Fundamentals of modern electrochemical analysis, World, Bean LZ, Moscow, P 592 10 Ajeet K., Solanki P.R., Pandey M.K., Kaneto K., Ahmad S., Bansi M.D (2010) Carbon nanotubes — chitosan nanobiocomposite for immunosensor Thin Solid Films 519 - 1160-1166 11 Yoshida К (1998) Electrooxidation in Organic Chemistry: The Role of Cation Radicals as Synthetic Intermediates: New York : Wiley, P.324 249