Nghiên cứu tạo và ứng dụng kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện sớm ung thư cổ tử cung

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY TNHH CNSH KHOA THƯƠNG BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2013 MỤC LỤC CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI i TÓM TẮT TIẾNG VIỆT iv ABSTRACT v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Các protein virus HPV protein tế bào liên quan đến ung thư cổ tử cung (UTCTC) 1.1.1 Các protein virus, oncoprotein E7 protein cấu trúc L1 1.1.2 Các protein tế bào 1.2 Tổng quan kháng thể đơn dòng 1.2.1 Sản xuất kháng thể đơn dòng kỹ thuật tạo tế bào lai (hybridoma) 1.2.2 Kỹ thuật sản xuất KTĐD từ người cách hóa lympho bào 1.2.3 Dung hợp tế bào lympho người với tế bào u tủy chuột 1.2.4 Tạo kháng thể khảm kháng thể “người hóa” 1.2.5 Phương pháp trình diện phage 1.2.6 Phương pháp tạo chuột chuyển gene biểu Ig người 1.2.7 Sản xuất kháng thể đơn dòng 1.3 Các phương pháp phát E7 p16INK4A PHẦN MỤC TIÊU ĐỀ TÀI PHẦN VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 10 3.1 VẬT LIỆU 10 3.1.1 Tế bào 10 3.1.2 Chủng vi sinh vật 10 3.1.3 Vector 10 3.1.4 Chuột thí nghiệm 11 3.1.5 Bệnh phẩm 11 3.1.6 Hóa chất-Môi trường 11 3.1.6.1 Hóa chất 11 3.1.6.2 Môi trường 15 3.2 PHƯƠNG PHÁP 15 3.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 15 3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA, RNA 16 3.2.2.1 Tách chiết DNA gene 16 3.2.2.2 Tách chiết DNA plasmid 16 3.2.2.3 Tách chiết RNA 17 3.2.3 Phương pháp PCR RT-PCR 17 3.2.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 17 3.2.5 Phương pháp giải trình tự 17 3.2.6 Phương pháp tạo dòng biểu 18 3.2.6.1 Tạo vector tái tổ hợp mang gene mong muốn 18 3.2.6.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli DH5α BL21 (DE3) 19 3.2.6.3 Chọn lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp có mang gene mong muốn 19 3.2.7 Phương pháp thu nhận – tinh protein tái tổ hợp 20 3.2.8 Phương pháp điện di SDS-PAGE 20 3.2.9 Phương pháp Western blot 21 3.2.10 Phương pháp Bradford 21 3.2.11 Phương pháp tạo KTĐD 21 3.2.11.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột 18 3.2.11.2 Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 22 3.2.11.3 Sản xuất tinh KTĐD 23 3.2.12 Phương pháp ELISA 24 3.2.12.1 ELISA trực tiếp 24 3.2.12.2 ELISA “sandwich” 25 3.2.12.3 Phương pháp checkerboard 25 3.2.13 Phương pháp chuyển gene vào tế bào động vật 25 3.2.14 Phương pháp hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry) 26 3.2.14.1.Phương pháp lai hóa miễn dịch tế bào lamelle 26 3.2.14.2 Phương pháp lai hóa tế bào miễn dịch lame kính 27 3.2.15 Phương pháp immunoPCR 27 3.2.15.1 Biotin hóa kháng thể 27 3.2.15.2 Tạo đoạn DNA thị đánh dấu biotin (DNA-biotin) 28 3.2.15.3 ImmunoPCR 28 PHẦN KẾT QUẢ 30 4.1 TẠO PROTEIN TÁI TỔ HỢP E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 VÀ p16INK4A 30 4.1.1 CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU CHO TẠO DÒNG 30 4.1.1.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân gene E7 HPV 6/11/16, L1 HPV 16/18 p16INK4A 30 4.1.1.2 Thu nhận gene cần tạo dòng 31 4.1.2 DỊNG HĨA CÁC GENE TƯƠNG ỨNG VÀO VECTOR pET28a(+), pE-SUMO3, pETM-44, pGATVÀ KIỂM TRA VECTOR TÁI TỔ HỢP BẰNG PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 33 4.1.3 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM TRA CHÚNG BẰNG SDS -PAGE VÀ WESTERN BLOT 36 4.1.3.1 Kết biểu protein E7 HPV 16 38 4.1.3.2 Kết biểu protein p16INK4A 38 4.1.3.3 Kết biểu protein E7 HPV E7 HPV 11 39 4.1.3.4 Kết biểu protein L1 HPV 16 L1 HPV 18 40 4.1.4 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 40 4.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ CHO QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH 41 4.2.1 BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN TÁI TỔ HỢP 41 4.2.1.1 Hệ vector biểu 41 4.2.1.2 Nhiệt độ cảm ứng 42 4.2.1.3 Nồng độ IPTG cảm ứng 43 4.2.1.4 Thời gian cảm ứng 44 4.2.2 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP 46 4.2.2.1 Nồng độ imidazole dùng dung dịch rửa cột 47 4.2.2.2 Dung dịch đệm phản ứng cắt loại bỏ đuôi SUMO 48 4.2.2.3 Ảnh hưởng số chất biến tính lên phản ứng cắt 50 4.2.2.4 Kết tinh protein p16INK4A từ vector pE-SUMO3 tái tổ hợp 51 4.3 TẠO KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16INK4A 52 4.3.1 GÂY ĐÁP ỨNG MIỂN DỊCH CHUỘT VỚI KHÁNG NGUYÊN MỤC TIÊU 52 4.3.1.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên E7 HPV 16 tái tổ hợp 52 4.3.1.2 Gây đáp ứng miễn dịch chuột với kháng nguyên p16INK4A tái tổ hợp 53 4.3.2 CHỌN LỌC DÒNG HYBRIDOMA SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV 16 VÀ p16INK4A 54 4.3.2.1 KTĐD kháng protein E7 HPV16 54 4.3.2.2 KTĐD kháng protein p16INK4A 55 4.3.3 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KTĐD KHÁNG E7 HPV 16 VÀ p16INK4A 55 4.3.3.1 Kết xác định isotype KTĐD kháng E7 HPV 16 p16INK4A 55 4.3.3.2 Kết tinh KTĐD kháng protein E7 HPV 16 p16INK4A 57 4.3.4 KIỂM TRA VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 58 4.3.4.1 Kết xác định lực KTĐD với kháng nguyên tái tổ hợp 58 4.3.4.2 Kết kiểm tra tính đặc hiệu KTĐD 59 4.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ CHO QUY TRÌNH TẠO KTĐD 62 4.4.1 SẢN XUÂT KTĐD QUA NUÔI CẤY TĨNH 62 4.4.1.1 Thu nhận tối đa sinh khối tế bào 4H5 dùng để cấy (seeding) 62 4.4.1.2 Xác định số điều kiện nuôi tế bào 4H5 để sản xuất KTĐD 63 4.4.2 QUY TRÌNH SẢN XT KTĐD QUA NI CẤY BIOREACTOR 66 4.4.2.1 Mật độ tế bào cấy 66 4.4.2.2 Nồng độ FBS môi trường nuôi tế bào 67 4.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH IMMUNOPCR 68 4.5.1 TẠO KTĐD 4H5 ĐÁNH DẤU BIOTIN 69 4.5.2 TẠO ĐOẠN DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 71 4.5.3 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 1D5 PHỦ GIẾNG 71 4.5.4 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ 4H5-BIOTIN VÀ STREPTAVIDINALKALINE PHOSPHATASE (STV-AP) 71 4.5.5 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DNA ĐÁNH DẤU BIOTIN 73 4.5.6 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ STREPTAVIDIN (STV) 73 4.5.7 TÁC NHÂN “KHĨA” GIẾNG VÀ SỐ CHU KÌ PCR 74 4.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH HĨA TẾ BÀO MIỄN DỊCH 75 4.6.1 NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TỐI ƯU CHO QUY TRÌNH LAI TRÊN LAMELLE 75 4.6.2 TÁC NHÂN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 79 4.6.3 NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 80 4.6.4 CÁC ĐIỀU KIỆN BỘC LỘ KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 81 4.6.5 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA QUY TRÌNH LAI TRÊN LAME KÍNH 83 4.6.6 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH KTĐD 1C10 85 4.7 QUY TRÌNH ELISA 87 4.7.1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “BẮT GIỮ” (PHỦ GIẾNG) TỐT NHẤT 89 4.7.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “PHÁT HIỆN” TỐT NHẤT 90 4.7.3 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ KHÁNG THỂ “CỘNG HỢP HRP” TỐT NHẤT 90 4.7.4 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TÁC NHÂN KHÓA GIẾNG TỐT NHẤT 91 4.8 KIT IMMUNOPCR - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 95 4.8.1 ĐỘ ĐÚNG 95 4.8.2 ĐỘ CHÍNH XÁC 96 4.8.3 ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 98 4.8.4 ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 99 4.8.5 KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CÁC CƠ SỞ Y TẾ 99 4.9 KIT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (HTBMD) - XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 101 4.9.1 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-16ICC 101 4.9.1.1 Độ 101 4.9.1.2 Độ xác 103 4.9.1.3 Độ đặc hiệu phân tích 104 4.9.1.4 Khả triển khai đại trà kit sở y tế 108 4.9.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTE7-18ICC 108 4.9.2.1 Độ 108 4.9.2.2 Độ xác 110 4.9.2.3 Độ đặc hiệu phân tích 111 4.9.2.4 Khả triển khai đại trà kit sở y tế 113 4.9.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG CỦA KIT KTp16ICC 113 4.9.3.1 Độ 113 4.9.3.2 Độ xác 115 4.9.3.3 Độ đặc hiệu phân tích 118 4.9.3.4 Độ ổn định 119 4.9.3.5 Khả triển khai đại trà kit sở y tế 121 4.10 KIT ELISA – XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG 121 4.10.1 XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ “NGƯỠNG” (CUT-OFF) CỦA KIT 121 4.10.2 ĐỘ ĐÚNG 123 4.10.3 ĐỘ CHÍNH XÁC 124 4.10.4 ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH 126 4.10.5 ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH 126 4.10.6 KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CƠ SỞ Y TẾ 127 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 CÁC THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Tên đề tài : NGHIÊN CỨU TẠO VÀ ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM PHÁT HIỆN SỚM UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Chủ nhiệm : PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cơ quan chủ trì : Cơng ty TNHH CNSH Khoa Thương Thời gian thực : 36 tháng, Báo cáo tiến độ : 6/2011 Thời gian gia hạn : tháng Kinh phí duyệt : 3.050.000.000 đồng Kinh phí cấp : Mục tiêu : Mục tiêu dài hạn đề tài phát triển công nghệ Việt Nam, công nghệ kháng thể đơn dòng (KTĐD) phục vụ cho chẩn đoán điều trị Đối tượng nghiên cứu đề tài HPV (Human Papillomavirus), loại virus có liên quan chặt chẽ với ung thư cổ tử cung Mục tiêu cụ thể bao gồm : (1) Hoàn chỉnh quy trình tạo KTĐD quy mơ nhỏ vừa, áp dụng để tạo KTĐD kháng số protein liên quan đến ung thư cổ tử cung E7 HPV16/18, p16INK4A ; (2) Ứng dụng KTĐD tạo để phát triển phương pháp chẩn đoán dựa kỹ thuật immuno PCR miễn dịch mô/ tế bào ; (3) Xây dựng số kit nhằm phát sớm ung thư cổ tử cung dựa kỹ thuật immuno-PCR hóa miễn dịch mơ, tế bào Nội dung STT Nội dung đăng ký Nội dung thực Báo cáo tổng kết với đầy đủ nội báo cáo tổng kết trình bày đầy đủ nội dung dung quy định Sở nghiên cứu đề tài Khoa học công nghệ Protein tái tổ hợp E7 HPV Protein tái tổ hợp E7 HPV /11/16, 6/11/16, L1 HPV 16/18 p16INK4A – trình tự xác, độ tinh lần p16INK4A – trình tự xác, độ lượt 95,4 %, 93 %, 95,4 % 92,3 %, 10 tinh 95 %, 10 mg cho mg cho loại protein loại protein Gene L1 HPV 16 L1 HPV 18 tạo dịng biểu khơng thành cơng Quy trình tạo protein tái tổ hợp Quy trình tạo protein tái tổ hợp vời vector i Bộ vector với quy trình tạo pET28(a+), pETM-44, pGAT pSUMO3 có dịng tương ứng sử dụng để thể dùng để tạo dịng protein có tính tan tạo dịng nhiều loại protein khác Quy trình tạo KTĐD – thực Quy trình tạo KTĐD – thực Việt Việt Nam, xác định Nam thơng số loại mơi trường, Quy trình thu nhận KTĐD 4H5 gồm thông tốc độ lắc, thời gian nuôi cấy số cụ thể : (1) thu sinh khối làm nguyên liệu trước thu kháng thể cấy : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 2.106 tế bào/ml môi trường, nuôi 48 ; (2) thu nhận KTĐD ni cấy bình Roux: mơi trường RPMI 1640 chứa FBS %, mật độ 2.106 tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 96 ; thu nhận KTĐD với bioreactor : môi trường RPMI 1640 chứa FBS 10 %, mật độ 5.105 tế bào/ml môi trường, thu mẫu sau 168 Kháng thể đơn dòng – loại loại KTĐD : 2C1 kháng E7 HPV 16, hàm KTĐD kháng E7 HPV 16 lượng 7,6 mg/ml độ tinh 95 %, 1C10 p16INK4A, độ tinh  90 %, kháng p16INK4A, hàm lượng 7,3 mg/ml, độ tinh hàm lượng 10 mg/l môi trường 92 % nuôi cấy hybridoma KTĐD 4H5 1D5 kháng E7 HPV 18 tạo từ đề tài trước sản xuất với hàm lượng 8,8 mg/ml 6,7 mg/ml độ tinh 90 % 98 % Quy trình immunoPCR – quy quy trình immunoPCR phát protein E7 trình phát protein E7 HPV HPV 18 16/18 p16INK4A Kit immunoPCR phát protein 01 kit immunoPCR phát protein E7 HPV E7 HPV 16/18 p16INK4A – kit 18 mẫu bệnh, độ nhạy phân tích ng/ml, phát protein E7 HPV 16, khơng có so sánh với kit đối chứng ; 50 phản E7 HPV 189 p16INK4A ứng/kit x kit mẫu bệnh với độ đặc hiệu 95 % so với kit OncoTect (Invirion ii Diagnostics), độ nhạy cao 10100 lần ; 50 phản ứng /kit x loại kit x kit/loại Quy trình hóa miễn dịch tế Quy trình hóa miễn dịch tế bào – quy trình bào/mơ – quy trình hóa miễn phát p16INK4A, E7 HPV 16, E7 HPV 18 dịch tế bào hóa miễn dịch xậy dựng dựa dịng tế bào chứng mơ để phát p16INK4A E7 dương âm phù hợp HPV 16 Kit hóa miễn dịch tế bào/mơ – 02 Kit hóa miễn dịch tế bào – 03 kit phát kit phát p16INK4A E7 HPV p16INK4A, E7 HPV 16 E7 HPV 18 Kit E7 16 với độ đặc hiệu độ nhạy HPV 16 phù hợp 80 % với kit chứng ; kit E7 tương đương (90-100%) với HPV 18 phù hợp 53 % với kit chứng ; kit kit thương mại tương ứng ; 50 p16INK4A phù hợp 85 – 85,7 % với kit chứng ; phản ứng /kit x loại kit x 50 phản ứng /kit x loại kit x kit/loại kit/loại 10 Bài báo quốc tế nước – 03 báo đăng tạp chí chuyên ngành 02 đăng tạp chí khoa học nước công nghệ chuyên ngành 11 Báo cáo khoa học hội thảo 01 báo cáo poster hội nghị quốc tế quốc tế nước chuyên ngành – Quy trình ELISA phát p16INK4A xậy 12 dựng dựa dòng tế bào chứng dương âm phù hợp Kit ELISA phát p16INK4A dịch 13 tế bào cổ tử cung, độ nhạy độ đặc hiệu lâm sàng 91,6 % 88,89 % gía trị “ngưỡng” 0,250 14 Luận văn Thạc sĩ 03 luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền iii 4.9.3.5 Khả triển khai đại trà kit sở y tế Nhuộm miễn dịch với p16INK4A có độ đặc hiệu cao hẳn test DNA HPV việc nhận diện trường hợp ASCUS LSIL diễn tiến thành high-grade CIN (Denton, 2010) Một nghiên cứu khác theo dõi trường hợp CIN dương tính với p16INK4A thấy tất diễn tiến xấu sau đến tháng can thiệp tức thời trường hợp cấp thiết (Di Stefano cs, 2010) Một ưu điểm lớn nhuộm miễn dịch p16INK4A làm tăng tính thống việc đọc kết tế bào học Sự kết hợp thêm việc nhuộm miễn dịch p16INK4A vào nhuộm H&E làm tăng độ xác chẩn đốn, giảm kết âm tính giả tăng cách đáng kể thống người đọc (Bergeron & cs, 2010) Một ưu điểm đặc biệt lớn p16INK4A biểu protein gắn liền thể xác hoạt động virus không phụ thuộc vào týp HPV nhiễm Điều biến p16INK4A thành “chỉ thị sinh học” có giá trị việc phân loại tình trạng bệnh HPV KitKTp16ICC phát triển đề tài cho thấy có hiệu hoạt động chấp nhận được, thực nhiều địa điểm mà không u cầu thiết bị đắt tiền, khơng địi hỏi kỹ thuật phức tạp khó thực Một nhược điểm kit, nhược điểm chung cho kit hóa tế bào/mơ miễn dịch, thời gian kéo dài đến 3-4 tiếng Chúng chuẩn bị thử nghiệm cải tiến kit để sử dụng máy đọc tự động Nhìn chung kit KTp16ICC nên đưa vào thử nghiệm rộng rãi để đánh giá khả hỗ trợ xét nghiệm tế bào học chẩn đoán tiên lượng ung thư cổ tử cung Ngoài ra, p16INK4A cịn xem “chỉ thị sinh học” có giá trị cho ung thư đầu cổ (Lassen & cs, 2009), ung thư dương vật có liên quan đến HPV (Prowse & cs, 2007) Như vậy, KTĐD kháng p16INK4Acịn sử dụng để phát triển kit cho trường hợp vừa nêu 4.10 KIT ELISA – XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG Kit ELISA tạo có tên kit KTp16ELISA phát protein p16INK4A dịch ly giải tế bào cổ tử cung 4.10.1 XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ “NGƯỠNG” (CUT-OFF) CỦA KIT Chúng sử dụng hai phương pháp tính giá trị “ngưỡng” Trong phương pháp truyền thống, giá trị “ngưỡng” trung bình cộng giá trị mật độ quang mẫu âm 121 cộng thêm 2-3 lần giá trị độ lệch chuẩn mẫu âm Phương pháp thứ hai tính giá trị “ngưỡng” thơng qua đồ thị đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic) Các liệu tính tốn xử lý chương trình GraphPad Prism 5.0 Do khơng có “chuẩn vàng” nên mẫu chọn dựa kết xét nghiệm tế bào học (Pap) bình thường hay bất thường định týp HPV (+) hay (-) Mẫu chia làm hai nhóm : 35 mẫu”bình thường” (control) 12 mẫu “bệnh” Chúng tơi tính tốn giá trị “ngưỡng” cho ELISA sử dụng KTĐD 1C10 ELISA sử dụng KTĐD thương mại KTĐD JC8 (Santa Cruz) nhằm làm sở cho việc xác định độ kit Hình 93 Biểu đồ phân bố giá trị mật độ quang mẫu từ người có kết Pap bình thường (control) người có kết Pap bất thường (patient) với hệ thống ELISA kháng thể 1C10 (A), JC8 (B) Theo phương pháp thứ nhất, kết từ hình 95 kết tính tốn với phép tính t-test cho thấy hai kháng thể sử dụng, giá trị trung bình mẫu “bệnh” giá trị trung bình mẫu “bình thường” có khác biệt có ý nghĩa thống kê (phụ lục 31 A, B) Đối với phản ứng ELISA sử dụng KTĐD 1C10, nhóm mẫu “bình thường” có giá trị trung bình 0,15 độ lệch chuẩn 0,05708 (phụ lục 28) Như vậy, giá trị “ngưỡng” tính 0,32164 So sánh với bảng phân phối độ nhạy độ đặc hiệu (phụ lục 32) giá trị “ngưỡng” độ nhạy lâm sàng đạt 50 % độ đặc hiệu lâm sàng đạt 100 % Đối với phản ứng ELISA kháng thể JC8, nhóm mẫu “bình thường” có giá trị trung bình 0,16 độ lệch chuẩn 0,08312 (phụ lục 30) Giá trị “ngưỡng” tính 0,409 Ở giá trị “ngưỡng” này, độ nhạy lâm sàng  12 % 122 Hình 94 Đồ thị đường cong ROC kit KT p16ELISA với KTĐD 1C10 (A) JC8 (B) Đối với phương pháp thứ hai sử dụng đường cong ROC, dựa bảng phân phối độ nhạy, độ đặc hiệu giá trị “ngưỡng” thể hình 94 phụ lục 33, giá trị “ngưỡng” xác định ELISA sử dụng kháng thể 1C10 0,250 với độ nhạy đạt 91,6 %, độ đặc hiệu đạt 88,89 % với mức tin cậy 95% Đối với ELISA sử dụng kháng thể JC8, giá trị “ngưỡng” xác định 0,205 Tại giá trị “ngưỡng: này, độ nhạy lâm sàng đạt 75 %, độ đặc hiệu lâm sàng đạt 90 % với mức tin cậy 95 % Ngồi cịn giá trị phản ánh mối tương quan độ nhạy độ đặc hiệu, có tên AUC (area under the curve) Theo đó, AUC nằm khoảng 90 % - 100 % thử nghiệm có độ nhạy độ đặc hiệu cao, AUC 50 % xem thử nghiệm có tính xác thấp (Nguyễn Văn Tuấn., 2010) Trong đề tài này, phân tích đường cong ROC cho thấy giá trị AUC thử nghiệm ELISA với kháng thể 1C10 đạt 93 % (phụ lục 34) ELISA với kháng thể JC8 đạt 73 % (phụ lục 35) Chúng chọn giá trị “ngưỡng” tính từ phương pháp sử dụng đường cong ROC cho nghiên cứu 4.10.2 ĐỘ ĐÚNG : Trong đề tài này, độ kit KTp16ELISA xác định thông qua việc so sánh với kết ELISA sử dụng KTĐD thương mại JC8 (Santa Cruz) KTĐD JC8 được chọn dựa hiệu sử dụng cơng bố từ nhiều cơng trình (Lassen & cs, 2009 ; Sawicka & cs, 2013) Đánh giá Tổ chức NordiQC (Nordic Immunohistochemical Quality Control) tiến hành 153 phịng thí nghiệm với 960 lam tế bào học, sử dụng KTĐD thương mại gồm JC8 (Santa Cruz), G175-405 (Ventana), 16P07 (Leica), 16P04 (Ventana), E6H4 (mtm) cho thấy KTĐD JC8 cho tỉ lệ kết nhuộm tối ưu cao số KTĐD khảo sát 123 Thí nghiệm tiến hành PTNcơng ty Khoa Thương 36 mẫu dịch tế bào cổ tử cung Kết (bảng 27, phụ lục 26) cho thấy mức độ phù hợp hai phương pháp 92 % Bảng 27 Kết ELISA mẫu dịch tế bào cổ tử cung với kit KTp16ELISA JC8 JC8 KTp16ELISA (+) (-) (+) (-) 27 Như vậy, độ kit KTp16ELISA tốt 4.10.3 ĐỘ CHÍNH XÁC Để khảo sát độ xác kit KTp16ELISA, chúng tơi tiến hành hai loạt thí nghiệm Loạt thí nghiệm I, nhằm xác định độ lặp lại nội phản ứng, tiến hành PTN công ty Khoa Thương Mẫu sử dụng dịch tế bào HeLa protein p16INK4Apha loãng nhiều bậc để tạo 16 hỗn hợp Bậc pha loãng cao tế bào HeLa 1,8 x 106 tế bào/ml bậc pha loãng thấp 1,8 x 102tế bào/ml Đối với protein p16INK4A, bậc pha lỗng cao 10 µg/mlvà thấp 100 pg/ml, nằm giới hạn phát test ELISA p16INK4A Kết xác định độ lặp lại nội phản ứng (bảng 28) cho thấy hệ số biến thiên nội phản ứng tính theo cơng thức : CV nội phản ứng = trung bình % CV = 4,16 % Giá trị < 10 % giá trị chấp nhận cho độ lặp lại nội phản ứng Bảng 28 Độ lặp lại nội phản ứng kit ELISA p16INK4Atrên dich tế bào HeLa protein p16INK4Atái tổ hợp Mật độ tế bào/nồng độ Độ lệch chuẩn (SD - standard deviation) % hệ số biến thiên (CV – coefficient of variation) Giá trị Ct lần Giá trị Ct lần Ct trung bình 1,8 x 106 tế bào/ml 0,94 0,84 0,89 0,074 8,29% 1,8 x 105 tế bào/ml 0,80 0,79 0,80 0,011 1,33% 1,8 x 104 tế bào/ml 0,50 0,57 0,53 0,047 8,81% tế bào/ml 0,49 0,46 0,48 0,025 5,21% 1,8 x 102 tế bào/ml 0,22 0,23 0,23 0,007 2,97% protein p16INK4A tái tổ hợp Dịch tế bào HeLa 1,8 x 103 124 tế bào/ml 0,10 0,10 0,10 0,001 0,70% Protein p16INK4A tái tổ hợp 10 µg/ml 2,40 2,43 2,41 0,018 0,75% µg/ml 2,39 2,42 2,40 0,025 1,03% 100 ng/ml 1,84 1,83 1,83 0,013 0,69% 10 ng/ml 1,56 1,60 1,58 0,024 1,50% ng/ml 0,67 0,80 0,74 0,095 12,89% 100 pg/ml 0,28 0,25 0,26 0,015 5,74% Loạt thí nghiệm II nhằm xác định độ lặp lại liên phản ứng tiến hành hai địa điểm : Trung tâm Quatest PTN công ty Khoa Thương Mẫu sử dụng tương tự Kết tính tốn (bảng 29, phụ lục 27) cho thấy hệ số biến thiên phản ứng % < 15 % giá trị tối đa chấp nhận cho độ biến thiên liên phản ứng Bảng 29 Độ lặp lại liên phản ứng kit KTp16ELISA dich tế bào HeLa protein p16INK4Atái tổ hợp Trung tâm Quatest CT Khoa Thương Bộ mơn Sinh hố Kết Kết Kết Kết Kết Kết 0,79 0,84 0,94 0,84 0,89 0,89 tế bào/ml 0,70 0,80 0,80 0,79 0,70 0,85 1,8 x 104 tế bào/ml 0,64 0,55 0,50 0,57 0,60 0,51 1,8 x 103 tế bào/ml 0,44 0,49 0,49 0,46 0,48 0,52 1,8 x 102 tế bào/ml 0,23 0,26 0,22 0,23 0,27 0,25 tế bào/ml 0,11 INK4A Protein p16 tái tổ hợp 10 µg/ml 2,32 µg/ml 2,43 100 ng/ml 1,93 10 ng/ml 1,53 ng/ml 0,77 100 pg/ml 0,26 pg/ml 0,11 0,12 0,10 0,10 0,10 0,10 2,41 2,48 2,09 1,52 0,67 0,23 0,10 2,40 2,39 1,84 1,56 0,67 0,28 0,10 2,43 2,42 1,83 1,60 0,80 0,25 0,10 2,35 2,46 1,95 1,56 0,73 0,28 0,11 2,45 2,44 2,09 1,53 0,59 0,23 0,10 Mẫu Dịch tế bào HeLa 1,8 x 106 tế bào/ml 1,8 x 105 Như vậy, độ xác kit KTp16ELISA bao gồm lặp lại nội phản ứng liên phản ứng tốt 125 4.10.4 ĐỘ ĐẶC HIỆU PHÂN TÍCH Trong đề tài này, độ đặc hiệu phân tích kit ELISA p16INK4A xác định cách sử dụng dòng tế bào HeLa có biểu p16INK4A dịng MCF-7 khơng biểu protein với hai mật độ tế bào cao thấp x 106 tế bào/ml x 102 tế bào/ml Địa điểm tiến hành PTN công ty Khoa Thương Bảng 30 Kết ELISA p16INK4Atrên dịch tế bào HeLa MCF-7 Tế bào HeLa MCF-7 Mật độ tế bào OD450 Cao Thấp Cao Thấp 0,81 ± 0,005 0,22 ± 0,021 0,17 ± 0,009 0,12 ± 0,008 So sánh kết (bảng 30) với giá trị “ngưỡng” kit xác định (0,250) mẫu tế bào HeLa mật độ cao dương tính với thử nghiệm ELISA, mẫu có mật độ tế bào thấp xấp xỉ giá trị “ngưỡng” hai mẫu tế bào MCF-7 âm tính với thử nghiệm Như vậy, thử nghiệm ELISA mà xây dựng có độ đặc hiệu phân tích tốt 4.10.5 ĐỘ NHẠY PHÂN TÍCH Nguyên liệu sử dụng cho nội dung kháng nguyên p16INK4A tái tổ hợp pha loãng theo bậc 10 từ 10 µg/ml đến 10 pg/ml tế bào HeLa pha loãng từ 1,8 x 106 tế bào/ml đến 1,8 x 101 tế bào/ml HELA 3.0 1.00 2.5 0.80 2.0 P16 TAI TO HOP OD A450 OD A450 1.20 0.60 1.5 1.0 0.40 0.5 0.20 0.0 0.00 10^6 10^5 10^4 10^3 10^2 10^1 10^0 Mật độ tế bào HeLa (x1,8 tế bào/ml) Nồng độ protein p16INK4A tái tổ hợp (µg/ml) Hình 95 Kết xác định độ nhạy kit KTp16ELISA với kháng nguyên ELISA p16INK4Apha lỗng bậc 10 từ 10 µg/ml đến 10 pg/ml;tế bào HeLa pha loãng từ 1,8 x 106 tế bào/ml đến 1,8 x 101 tế bào/ml 126 Giới hạn phát ELISA giá trị nồng độ kháng nguyên/mật độ tế bào cho tín hiệu OD450 cao dương tính Giá trị OD450 xem dương tính khi: Giá trị OD mẫu>ODtrung bình mẫu âm + 3*STD mẫu âm Như vậy, giới hạn phát kit KTp16ELISA mà xây dựng protein p16INK4Atái tổ hợp tế bào HeLalần lượt 100 pg/ml, 1,8 x 102 tế bào/ml (phụ lục 36) 4.10.6 KHẢ NĂNG TRIỂN KHAI ĐẠI TRÀ KIT TẠI CƠ SỞ Y TẾ Kit ELISA phát p16INK4Ađược phát triển sử dụng cho nhiều cơng trình cho thấy nhiều ưu điểm : test có độ nhạy cao phát tiền UTCTC (Wentzsen & cs, 2006), 319 phụ nữ có kết Pap bất thường, độ nhạy (90 %) độ đặc hiệu (46,9 %) test ELISA p16 cao test HC2 (Mao & cs, 2007), test có độ nhạy độ đặc hiệu cao ThinPrep Pap 1356 mẫu thu trước sinh thiết (Ding & cs, 2008), test cho thấy có giá trị sàng lọc tốt 1781 phụ nữ khám phụ khoa (Balasubramanian & cs, 2009) Kết từ đề tài cho thấy mức độ phù hợp cao với kết Pap định týp HPV phù hợp cao với kết hóa tế bào miễn dịch với kit CINtec Sự phân định kết (+) (-) thử nghiệm ELISA dựa giá trị “ngưỡng” Do giá trị “ngưỡng” tính dựa mẫu âm quần thể nên số lượng mẫu âm sử dụng nhiều giá trị “ngưỡng” tính gần với thực tế phân định tốt mẫu “bình thường”/”bất thường” Khi xác định giá trị “ngưỡng” test ELISA có ưu điểm khơng phụ thuộc vào thao tác chuẩn bị mẫu tế bào đánh giá chủ quan người đọc (Wentzensen & cs, 2006) Như vậy, kit KTp16ELISA xây dựng đề tài nên hoàn thiện, với số lượng mẫu âm lớn để có gía trị “ngưỡng” đúng, nhằm ứng dụng công cụ bổ sung cho test tế bào học khẳng định hay thay cho test hóa miễn dịch p16INK4A 127 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Đối với mục tiêu dài hạn đề tài phát triển công nghệ kháng thể đơn dịng Việt Nam, chúng tơi xây dựng tồn quy trình thành phần cơng nghệ bao gồm quy trình tạo protein tái tổ hợp, tạo KTĐD quy trình ứng dụng KTĐD để phát kháng nguyên mục tiêu mẫu bệnh dựa kỹ thuật immunoPCR, hóa tế bào miễn dịch ELISA Cơng nghệ KTĐD xây dựng hồn tồn triển khai điều kiện chỗ Đối với mục tiêu cụ thể : Chúng xây dựng hồn chỉnh quy trình tạo KTĐD quy mơ ni cấy bình Roux bioreactor áp dụng quy trình để thu nhận KTĐD kháng E7 HPV 16/18 p16INK4A, đặc hiệu cho kháng nguyên tương ứng, với hàm lượng từ 6,7 mg/ml đến 8,8 mg/ml độ tinh khoảng 90,32 – 98,73 % Chúng thu nhận biểu phần protein L1-HPV16 Nguyên nhân việc trình tự mồi, plasmid chủng Sau kiểm tra trình tự plasmid tái tổ hợp, chúng tơi nhận thấy trình tự plasmid gene mục tiêu phù hợp với chúng tơi dự đốn Do đó, vần đề chủng vi khuẩn E coli DH5α sử dụng xuất đột biến tạo enzyme phân cắt vị trí đặc biệt Do vậy, gene L1 bị phân cắt phần enzyme Chúng ứng dụng KTĐD kháng E7 HPV 16/18 p16INK4A để phát triển quy trình immunoPCR, hóa tế bào miễn dịch ELISA Chúng tơi xây dựng kit KTImmunoPCR E7/18, KTE7-16ICC, KTE7-18ICC, KTp16ICC, KTp16ELISA để phát kháng nguyên mục tiêu tế bào dịch ly giải tế bào cổ tử cung  Kit KTImmunoPCR E7/18 : độ thấp, độ xác tốt, độ đặc hiệu phân tích thấp, độ nhạy phân tích khơng cao, khả triển khai thực tế : khơng có  Kit KTE7-16ICC : độ tốt, phù hợp 80 % với kit đối chứng, độ xác tốt, độ đặc hiệu phân tích tốt, khả triển khai thực tế : dùng cho nghiên cứu  Kit KTE7-18ICC : độ thấp, độ xác tốt, độ đặc hiệu phân tích thấp, khả triển khai thực tế : khơng có 128  Kit KTp16ICC : độ tốt, phù hợp với kit đối chứng 85 % - 85,7 %, độ xác tốt, độ đặc hiệu phân tích tốt, khả triển khai thực tế : nên tiếp tục hoàn chỉnh cho triển khai thực tế  Kit KTp16ELISA : độ tốt, phù hợp 92 %, độ xác tốt, độ đặc hiệu phân tích tốt, độ nhạy phân tích tốt, giá trị “ngưỡng” 0,250 độ đặc hiệu kit 91,6 % độ đặc hiệu 88,9 %, khả triển khai thực tế : nên tiếp tục hoàn chỉnh cho triển khai thực tế KIẾN NGHỊ Các quy trình xây dựng đề tài chuyển giao cho đơn vị nghiên cứu ứng dụng có nhu cầu Chúng tơi hy vọng nhận hỗ trợ từ Sở KH&CN Tp HCM để tiếp tục: Hồn chỉnh kit KTp16ICC cỡ mẫu lớn, nhiều đơn vị y tế, với tham gia chặt chẽ nhà giải phẫu bệnh học Hoàn chỉnh kit KTp16ELISA với cỡ mẫu lớn để xác định giá trị “ngưỡng” gần với thực tế thử nghiệm nhiều đo8n vị y tế Xây dựng quy trình phát triển kit hóa mơ miễn dịch phát p16INK4A mô Tạo KTĐD kháng ki-67, “chỉ thị sinh học” khuyến cáo sử dụng chung với p16INK4A để tăng hiệu chẩn đoán tiên lượng UTCTC Chúng mong muốn nhận hỗ trợ mặt thủ tục để xin giấy phép lưu hành sản phẩm kit sau thử nghiệm quy mô lớn thành công 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO Adler M, Wacker R, Niemeyer CM Sensitivity by combinations: immune-PCR and related technologies Analyst 2008, 133:702-718 Andersson E, Karrberg C, Radberg T, Blomqvist L, Zetterqvist BM, Ryd W, Lingh M, Horal P Type-dependent E6/E7 mRNA expression of single and multiple highrisk human papillomavirus infections in cervical neoplasia J Clin Virol 2012, 54:61-65 Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K, Current Protocol in Molecular Biology 2001, Wiley & Son Balasubramanian A, Hughes J, Mao C, Ridder R, Herkert M, Kiviat NB, Koutsky LA Evaluation of an ELISA for p16INK4A as a screening test for cervical cancer Cancer Epidemiol Biomarkers 2009, 18:OF1-10 Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay J Immunol Methods 1987, 100:173179 Bergeron C, Ordi J, Schmidt D, Trunk MJ, Keller T, Ridder R Conjunctive p16INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial neoplasia Am J Clin Pathol 2010, 133:395-406 Carmen S, Jermutus L, Concepts in antibody phage display Briefings in functional genomics and proteomics 2002, 1(2): 189-203 CDRH – Center for Devices and Radiological Health Food and Drug Administration US Department of Health and Human Services Guidance for submission of immunohistochemistry applications to the FDA 1998 Chambers SP & Swalley SE Designing experiments for high-throughput protein expression Methods in molecular biology : high-throughput protein expression and purification 2009 Vol 498 Humana Press 10 Chomczynski P, Sacchi N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem 1987, 162:156-159 11 Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies, Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council Monoclonal antibody production, 1999, National Academic Press 12 Costa AR, Rodrigues ME, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production Eur J Pharm Biopharm 2010, 74:127-138 13 Crowther JR The ELISA guidebook, 2nd ed Methods in molecular biology Humana Press 2009 14 Crowther JR, Unger H & Viljoen GJ Aspects of kit validation for tests used for the diagnosis and surveillance of livestock diseases : producer and end-used responsibilities Rev Sci Tech Off Int Epiz 2006, 25:913-935 15 Davis C G., Gallo M L., Corvalan R F (1999), Transgenic mouse as a source of fully human antibodies for the treatment of cancer, Cancer and Metastasis Revews, 18: 421-425 16 de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H Classification of papillomaviruses Virology 2004, 324:17-27 130 17 Deo Y.M., Mahadevan M.D., Fuchs R Practical considerations in operation and scale-up of spin-filter based bioreactors for monoclonal antibody production Biotechnol Prog 1996, 12:57 – 64 18 Dreier K, Scheiden R, Lener B, Ehehalt D, Pircher H et al Subcellular localization of the human papillomavirus 16 E7 oncoprotein in CaSki cells and its detection in cervical adenocarcinoma and adenocarcinoma in situ Virology 2011, 409:54-68 19 Denton KJ, Bergeron C, Klement P, Trunk MJ, Keller T, Ridder R The sensitivity and specificity of p16INK4a Cytology vs HPV testing for detecting high-grade cervical disease in the triage of ASC-US and LSIL Pap cytology results Am J Clin Pathol 2010, 134:12-21 20 Di Stefano L, Accurti V, Coletti G, D’Alfonso A, Carta G p16INK4a and low-grade cervical intraepithelial neoplasia Diagnostic and therapeutic implications Eur J Gynaecol Oncol 2010, 31:411-414 21 Ding L, Zou XJ, Ao JE, Yao AX, Cai L ELISA test to detect CDKN2 (p16INK4A) expression in exfoliative cells : a new screening tool for cervical cancer Mol Diagn Ther 2008, 12:395-400 22 Ehehalt D, Lener B, Pircher H, Dreier K, Pfister H, Kaufmann AM et al Detection of 23 human papillomavirus type 18 E7 oncoprotein in cervical smears : a feasibility study J Clin Microbiol 2011, doi:10.1128/JCM.01108-11 24 Else EA, Swoyer R, Zhang Y, Taddeo FJ, Bryan JT, Lawson J, Van Hyfte I, Roberts CC.Comparison of real-time multiplex human papillomavirus (HPV) PCR assays with INNO-LiPA HPV genotyping extra assay J ClinMicrobiol 2010; 49:1907-12 25 European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening 2nd ed HPV typing methods International Agency for Research in Cancer 26 Fiedler M, Muller-Holzner E, Viertler HP, Widschwendter A, Laich A et al High level HPV-16 E7 oncoprotein expression correlates with reduced pRb-levels in cervical biopsies The FASEB J 2004, 10.1096/fj.03-1332fje 27 Frey A, Di Canzio J, Zurakowski D A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays J Immunol Methods 1998, 221:35-41 28 Gillio-Tos A,De Marco L, Ghisetti V, Snijders PJF, Segnan N, Ronco G, Merletti F Human papillomavirus typing with GP5+/6+ polymerase chain reaction reverse line blotting and with commercial type-specific PCR kits J Clin Virol 2006, 36:126-132 29 Jacobson RH Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases Manual of standards for diagnostic tests and vaccines P 8-15 OIE 1996 30 Jordan RC, Lingen MW, Perez-Ordonez B, He X, Pickard R, Koluder M, Jiang B, Wakely P, Xiao W, Gillison ML Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US Cooperative Group trilas Am J Surg Pathol 2012, 36:945-954 31 Karpas A., Dremucheva, Czepulkowski B H A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies, Protocol- PNAS (2001), 98(4):1799-1804 32 Klaes R, Benner A, Friedrich T, Ridder R, Herrington S, Jenkins D, Kurman RJ, Schmidt D, Stoler M, von Knebel Doeberitz M p16INK4A immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia Am J Surg Pathol 2003, 27:1284 131 33 Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, Ridder R, Rudy W, Petry U, DallenbachHellweg G, Schmidt D, von Knebel Doeberitz M Overexpression of p16INK4A as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri Int J Cancer 2001, 92:276-284 34 Kohler G, Milstein C Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 1975, 256:495-497 35 Kurshumliu F, Thorns C, Gashi-Luci L p16INK4A in routine practice as a marker of cervical epithelial neoplasia Gynecologic Oncology 2009, 115:127-131 36 Lassen P, Eriksen JG, Hamilton-Dutoit S, Tramm T, Alsner J, Overgaard J Effect of HPV-associated p16INK4A expression on response to radiotherapy and survival in squamous cell carcinoma of the head and neck J Clin Oncol 2009, 27:1992-1998 37 Lee S, Kim H, Kim H, Kim C, Kim I The utility of p16INK4a and Ki-67 as a conjunctive tool in uterine cervical lesions The Korean J Pathol 2012, 46:253260 38 Lee KA, Shim JH, Kho CW, Park SG, Park BC, Kim JW, Lim JS, Choe YK, Paik SG, Yoon DY Protein profiling and identification of modulators regulated by the E7 oncogene in the C-33 A cell line by proteomics and genomics Proteomics 2004, 4:839-48 39 Lanzavecchia A., Corti D., Sallusto F Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells, Current Opinion in Biotechnogy 2007, 18:523-528 40 Little M, Recombinant Antibodies for Immunotherapy 2009, Cambridge University Press 41 Malou N., Raoult D., Immuno-PCR: a promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens and antibodies, Trends in microbiology, 2011, 19: 295-302 42 Mao C, Balasubramanian A, Yu M, Kiviat N, Ridder R et al Evaluation of a new p16INK4A ELISA test and a high-risk HPV DNA test for cervical cancer screening: results from proof-of-concept study Int J Cancer 2007, 120:2435-2438 43 McNicol AM & Richmond JA Optimizing immunohistochemistry: antigen retrieval and signal amplification Histopathology 1998, 32:97-103 44 Moro A, Hernandez P Bacterial expression and immunological detection of human papillomavirus type 16 E7 protein Biochem Biophys Res Commun 1996, 226:895-899 45 Munger K, Basile JR, Duensing S, Eichten A, Gonzalez SL, Grace M, Zacny VL Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein Oncogene 2001, 20:7888-7898 46 Munger K & Halpern AL HPV 16 E7 : primary structure and biological properties Ncv.unl.edu/Angelettilab/HPV/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf 47 Murphy N, Ring M, Heffron CCBB, King B, Killalea AG, Hughes C, Martin CM, McGuinness E, Sheils O, O’Leary JJ p16INK4A, CDC6, and MCM5 : Predictive biomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer J Clin Pathol 2005, 58:525-534 48 Niemeyer CM ImmunoPCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification, Trends in Biotechnology 2005, 23:208-216 49 Niemeyer CM, Adler M and Wacker R.Detecting antigens by quantitative immuno-PCR Nature Protocols, 2007, 2:1918 – 1930 132 50 Nguyễn Văn Tuấn Diễn giải nghiên cứu tiên lượng : ROC (Receiver Operating Characteristic 2010 51 NordiQC (Nordic Immunohistochemical Quality Control – www.nordiqc.org) Assessment Run 26 2009 p16ink4a (p16) 52 Norman I, Brismar S, Zhu J, Gaberi V, Hagmar B, Hjerpe A, Andersson S p16INK4A immunocytochemistry in liquid-based cervical cytology : Is it feasible for clinical use ? Int J Oncol 2007, 31:1339-1343 53 Oh KJ, Kalinina A, Wang J, Nakayama K, Nakayama KI, Bagchi S The papillomavirus E7 oncoprotein is ubiquitinated by UbcH7 and Cullin-1 and Skp2containing E3 ligase J Virol 2004, 78:5338-5346 54 Ohlson S, Strandh M, Nilshans H Detection and characterization of weak affinity antibody antigen recognition with biomolecular interaction analysis Journal of Molecular Recognition 1997, 10:135–138 55 Ozturk SS & Palsson B Effect of initial cell density on hybridoma growth, metabolism, and monoclonal antibody production J Biotechnol 1990, 16:259-279 56 Ozturk SS & Palsson B Growth, metabolic, and antibody production kinetics of hybridoma cell culture : Effects of serum concentration, dissolved oxygen concentration, and medium pH in a batch reactor Biotechnol Prog 1991, 7:481494 57 Peck RB, Scheizer J, Weigl BH, Somoza C, Siver J, Sellors JW, Lu PS A magnetic immunochromatographic strip test for detection of Human Papillomavirus 16 E6 Clinical Chemistry 2006, 52:2170-2172 58 Prowse DM, Ktori EN, Chandrasekaran D, Prapa A, Baithun S Human papillomavirus-associated increase in p16INK4A expression in penile lichen sclerosus and squamous cell carcinoma Clin Lab Invest 2008, 158:261-265 59 Ramos-Vara JA, Kiupel M, Baszler T, Bliven L, Brodersen B, CHeLack B, Czub S, Del Piero F, Dial S, Ehrhart EJ, Graham T, Manning L, Paulsen D, Valli VE, West K Suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories J Vet Diagn Invest 2008, 20:393-413 60 Reuschenbach M, Clad A, von Knebel Doeberitz C, Wentzensen N, Rahmsdorf J, Schaffrath F, Griesser H, Freudenberg N, von Knebel Doeberitz M Performance of p16INK4A-cytology, HPV mRNA, and HPV DNA testing to identify high grade cervical dysplasia in women with abnormal screening results Gynecologic Oncology 2010, 119:98-105 61 Rosales R, Lopez-Contreras M, Cortes RR Antibodies against human papillomavirus (HPV) type 16 and 18 E2, E6 and E7 proteins in sera : correlation with presence of papillomavirus DNA J Med Virol 2001, 65:736-744 62 Sano T, Smith CL, and Cantor CR Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjungates Science, 1992, 258: 120-122 63 Sawicka M, Pawlikowski J, Wilson S, Ferdinando D, Wu H, Adamo PD, Gunn DA, Parish W The specificity and patterns of staining in human cells and tissues of p16INK4a antibodies demonstrate variant antigen binding PLoS ONE 2013, 8(1):e53313, doi:10.1371/journal.pone.0053313 64 Schledermann D, Andersen BT, Bisgaard K, Dohse M, Ejersbo D, Hoelund B, Horal P, Lindh M, Ryd W Are adjunctive markers useful in routine cervical cancer screening application of p16INK4a and HPV-PCR on ThinPrep samples with histological follow-up Diagn Cytopathol 2008, 36:453-459 133 65 Sehr P, Mueller M, Hoepfl R, Widschwendter A, Pawlita M, HPV antibody detection by ELISA with capsid protein L1 fused to glutathione S transferase J Virol Methods 2002, 106:61-70 66 Selvey LA, Dunn LA, Tindle RW, Park DS, Frazer IH Human papillomavirus (HPV) type 18 E7 protein is a short-lived steroid-inducible phosphoprotein in HPV-transformed cell lines J Gen Virol 1994, 75:1647-1653 67 Singh, V Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation Cytotechnology 1999, 30: 149-158, 68 Smotkin D & Wettstein FO Transcription of human papillomavirus type 16 early genes in a cervical cancer and a cancer-derived cell line and identification of the E7 protein Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83:4680-4684 69 Sugimoto M., Tahara H., Ide T., Furuichi Y Review Steps Involved in Immortalization and Tumorigenesis in Human B-Lymphoblastoid Cell Lines Transformed by Epstein-Barr Virus, Camcer Research 2004, 64: 3361-3364 70 Swalley SE, Fulghum JR, Chambers SP Screening factor effecting a response in soluble protein expression : formalized approach using design of experiments Anal Biochem 2006, 352:122-127 71 Tang YJ, Ohashi R, Hamel JFP Perfusion culture of hybridoma cells for hyperproduction of IgG2a monoclonal antibody in a wave bioreactor-perfusion culture system Biotechnol Prog 2007, 23:255-264 72 Tarleton R., Beyer A Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein free medium BioTechniques 1991, 11:590-593 73 Tindle RW, Smith JA, Geysen HM, Selvey LA, Frazer IH Identification of B epitopes in human papillomavirus type 16 E7 open reading frame protein J Gen Virol 1990, 71:1347-1354 74 Torlakovic EE, Riddell R, Banerjee D, El-Zimaity H, Pilavdzic D, Dawe P, Magliocco A, Barnes P, Berendt R, Cook D, Gilks B, Williams G, Prez-Ordonez B, Wehrli B, Ewanson PE, Otis CN, Nielsen S, Vyberg M, Butany J Canadian Association of Pathologists National Standards Committee/Immunohistochemistry Best practice recommendations for standardization of immunohistochemistry tests Am J Clin Pathol 2010, 133:354-365 75 U.S department of Health and Human Services – Food and Drug Administration – Center for Devices and radiological Health Guidance for submission of immunohistochemistry applications to the FDA 76 Voisard, D, Meuwly F, Ruffieux P A, Baer, G, Kadouri, A Potential of cell retention techniques for large-scale high-density perfusion culture of suspended mammalian cells Biotechnol Bioeng 2003, 82, 751-765 77 Walts AE, Bose S p16, Ki-67, and BD ProEx TMC immunostaining : a practical approach for diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia Hum Pathol 2009, 40:957-964 78 Wentzensen N, Bergeron C, Cas F, Eschenbach D, Vinokurova S, von Knebel Doeberitz M Evaluation of a nuclear score for p16INK4A-stained cervical squamous cells in liquid-based cytology samples Cancer Cytopathol 2005, 105:461-467 79 Wentzensen N, Hampl M, Herkert M, Reichert A, Trunk MJ, Poremba C, Ridder R, von Knebel Doeberitz Identification of high-grade cervical dysplasia by the detection of p16INK4A in cell lysates obtained from cervical samples Cancer 2007, 107:2307-2313 134 80 Wentzensen N & von Knebel Doeberitz Biomarkers in cervical cancer screening Disease Markers 2007, 23:315-330 81 White EA, Sowa ME, Tan MJA, Jeudy S, Hayes SD, Santha S, Munger K, Haeper JW, Howley PM Systematic identification of interactions between host cell proteins and E7 oncoproteins from diverse human papillomaviruses Proc Natl Acad Sci USA 2011, doi:10.1073/pnas.1116776109/./DCSupplemental 82 Wu H., Dall’Acqua W F Humanized antibodies and their applications, Methods 2005, 36(1):1-2 83 zur Hausen H Papillomaviruses and cancer : from basic studies to clinical application Nature Reviews 2002, 2:342-350 84 Zwerschke WP, Jansen-Duerr P, Fiedler M, Laich A, Fitzky B patentscope.wipo.int /wo2005026731 135