Nghiên cứu quy trình tạo kháng thể đặc hiệu kháng ochratoxin để bước đầu tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch bắt ochratoxin

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 27 tháng 04 năm 2009) NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG OCHRATOXIN ĐỂ BƯỚC ĐẦU TẠO CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH BẮT OCHRATOXIN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: DƯƠNG NGỌC DIỄM CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05 NĂM 2009 BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu qui trình tạo kháng thể đặc hiệu kháng ochratoxin để bước đầu tạo cột sắc kí lực miễn dịch bắt ochratoxin Chủ nhiệm đề tài: DƯƠNG NGỌC DIỄM Cơ quan chủ trì: Trung tâm phát triển khoa học công nghệ trẻ Thời gian thực đề tài: 12 tháng Kinh phí duyệt: 80.000.000 đồng Kinh phí cấp: 72.000.000 đồng theo TB số: 245/TB-SKHCN ngày 22/11/2007 Mục tiêu: Nghiên cứu qui trình tạo kháng thể đặc hiệu kháng ochratoxin để bước đầu tạo cột sắc kí lực miễn dịch bắt ochratoxin Nội dung: Công việc dự kiến Công việc thực Gây miễn dịch thỏ tạo kháng Gây miễn dịch thỏ tạo kháng thể kháng ochratoxin thể kháng ochratoxin có lực cao Tinh chế kháng thể Tinh chế kháng thể ammonium sulfate 45% bão hòa cột sắc kí lực miễn dịch Sepharose 4B-BSA Thu kháng thể kháng ochratoxin không bị nhiễm kháng thể kháng BSA Tạo cột sắc kí lực miễn dịch Cột sắc kí lực miễn dịch có khả bắt ochratoxin Dùng HPLC kiểm tra khả bắt Cột sắc kí lực miễn dịch khơng bị ochratoxin cột lực tạo nên nhiễu bắt đặc hiệu ochratoxin Viết báo cáo Hoàn thành báo cáo MỤC LỤC Trang I TỔNG QUAN I.1 OCHRATOXIN I.1.1 Tính chất lý hóa I.1.2 Sinh tổng hợp ochratoxin I.1.3 Ochratoxin thực phẩm 10 I.1.4 Các đặc tính hóa học liên quan với sinh học 11 I.1.4.1 Quá trình hấp thụ tiết ochratoxin A 11 I.1.4.2 Tác động tế bào vi sinh động vật 12 I.1.4.3 Sự chuyển hóa 13 I.1.5 Tác động ochratoxin an toàn thực phẩm 14 I.1.5.1 Độc tính cấp 14 I.1.5.2 Độc tính mãn 15 I.1.6 Hàm lượng ochratoxin cho phép 17 I.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG OCHRATOXIN 17 I.2.1 Các kỹ thuật định lượng ochratoxin 17 I.2.1.1 Lấy mẫu 17 I.2.1.2 Chiết ochratoxin 18 I.2.1.3 Làm mẫu 18 I.2.1.4 Cô đặc mẫu 19 I.2.1.5 Phát xác định hàm lượng 19 I.2.2 Sắc kí lực miễn dịch 20 II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 II.1 VẬT LIỆU 22 II.1.1 Súc vật 22 II.1.2 Thiết bị, dụng cụ 22 II.1.3 Hóa chất 22 II.1.4 Chất chuẩn 22 II.2 PHƯƠNG PHÁP 23 II.2.1 Phương pháp tạo cộng hợp ochratoxin - BSA 23 II.2.2 Qui trình gây miễn dịch thỏ tạo kháng thể kháng ochratoxin 23 II.2.2.1 Mũi mẫn cảm 23 II.2.2.2 Mũi nhắc lại 23 II.2.2.3 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch kỹ thuật khuếch tán kép agarose 24 II.2.3 Qui trình tinh chế kháng thể kháng ochratoxin 24 II.2.3.1 Tinh chế kháng thể ammonium sulfate 45% bão hòa 24 II.2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết kháng thể sau tủa kỹ thuật điện di SDS-Polyacrylamide gel 10% 24 II.2.3.3 Loại kháng thể kháng BSA kỹ thuật sắc kí lực miễn dịch qua cột Sepharose 4B-BSA 24 II.2.4 Qui trình gắn kháng thể kháng ochratoxin lên gel tạo cột sắc kí lực miễn dịch bắt ochratoxin 25 II.2.4.1 Gắn kháng thể lên gel 25 II.2.4.2 Tạo cột sắc kí lực miễn dịch 25 II.2.4.3 Đánh giá khả tóm bắt gel sau cộng hợp 25 II.2.5 Pha định lượng ochratoxin chuẩn 26 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 III.1 Qui trình gây miễn dịch thỏ tạo kháng thể kháng ochratoxin 27 III.2 Qui trình tinh chế kháng thể kháng ochratoxin 27 III.2.1 Tinh chế kháng thể ammonium sulfate 45% bão hòa 27 III.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết kháng thể sau tủa kỹ thuật điện di SDS-Polyacrylamide gel 10% 28 III.2.3 Loại kháng thể kháng BSA kỹ thuật sắc kí lực miễn dịch qua cột Sepharose 4B-BSA 28 III.3 Qui trình gắn kháng thể kháng ochratoxin lên gel tạo cột sắc kí lực miễn dịch bắt ochratoxin 29 III.3.1 Đánh giá khả tóm bắt gel sau cộng hợp 29 III.3.2 Xác định dung lượng cột IAC 31 III.4 Thử ứng dụng mẫu cà phê nhân so sánh với cột OchraStar Fit COIAC2001 (Romer Labs-Austria) 31 III.4.1 Thử ứng dụng mẫu cà phê nhân 31 III.4.2 So sánh với cột OchraStar Fit COIAC2001 32 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 39 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A AOAC BSA DTT ELISA Aspergillus Association of Official Analytical Chemists Bovine Serum Albumin Dithiothreitol Enzyme-linked immunosorbent assay HPTLC High-performance thin layer chromatography HPLC High-performance liquid chromatography IAC Immuno-affinity chromatography IARC International Agency for Research on Cancer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry IgG Immunoglobulin JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives LD50 Lethal dose 50% OTA OTB OTC P PBS ppb ppm SDS SPE TLC USDA Ochratoxin A Ochratoxin B Ochratoxin C Penicillium Phosphate buffer saline Part per billion Part per million Sodium dodecyl sulfate Solid phase extraction Thin layer chrmatography United State Department of Agriculture Hiệp hội quốc tế chuyên gia hóa phân tích Albumin huyết bị Thử nghiệm miễn dịch liên kết men Sắc kí lớp mỏng hiệu cao Sắc kí lỏng hiệu cao Sắc kí lực miễn dịch Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế Liên đồn quốc tế hóa học ứng dụng IgG miễn Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm Đệm muối phosphate Một phần tỉ Một phần triệu Chiết pha rắn Sắc kí lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1: Hệ số hấp phụ phân tử (ε) ochratoxin dung môi khác Bảng 2: Ochratoxin nhiễm tự nhiên số nông sản 10 Bảng 3: Nhiễm ochratoxin huyết người khỏe mạnh 10 Bảng 4: Chu kì bán rã OTA huyết số loài 11 Bảng 5: Giá trị LD50 ochratoxin A số loài 14 Bảng 6: Tóm tắt tác động ochratoxin A đến loài khác sau cho uống OTA 16 Bảng 7: Kết dung lượng cột IAC 31 Bảng 8: Kết ứng dụng 30 mẫu cà phê nhân 32 Bảng 9: Kết so sánh cột IAC-OTAPAS với cột OchraStar Fit COIAC2001 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Sơ đồ sinh tổng hợp ochratoxin A Hình 2: Cấu trúc hóa học ochratoxin Hình 3: Sơ đồ ức chế tổng hợp protein OTA 13 Hình 4: Chuyển hóa ochratoxin A thành ochratoxin B, 4-hydroxyochratoxin A, 10-hydroxyochratoxin A ochratoxin α 14 Hình 5: Các bước tách chiết định lượng ochratoxin 17 Hình 6: Qui trình chiết tách ochratoxin cột IAC 21 Hình 7: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch 27 Hình 8: Điện di SDS-Polyacrylamide gel 10% 28 Hình 9: Khuếch tán kép thạch 29 Hình 10: Sắc kí đồ 30 Hình 11: Biểu đồ biểu thị dung lượng cột IAC 31 I TỔNG QUAN: I.1 OCHRATOXIN: Ochratoxin độc tố vi nấm sản sinh số loài nấm thuộc giống Aspergillus Penicillium, đặc biệt A.ochraceus Wilhelm Loài có sắc tố màu vàng nâu, đại diện thông thường hệ nấm thối rửa Người ta phân lập từ hạt gạo, hạt lạc bị mốc hay thức ăn chế biến từ thành phần Thậm chí người ta cịn phát đất, nhiễm làm hư hỏng hạt bơng Lồi phát triển nhanh 20-250C hàm lượng nước hạt 10% Ngoài cịn số lồi nấm khác sản sinh ochratoxin: A.sulphureus Thom Church, A.ostinaus Wehmer, A.alliaceus Thom Church, A.mellus Yukawa, P.viridicatum Westling Giống Penicillium thường gặp vùng có khí hậu lạnh sản sinh ochratoxin nhiệt độ từ 5-100C [19] I.1.1 Tính chất lý hóa: Ochratoxin amide L-phenylalanine acid 7-carboxyl-5-chloro-8-hydroxy3,4-dihyro-3R-methylisocoumarine Dạng tinh thể khơng có màu, bền với nhiệt, tan dung mơi hữu phân cực methanol, ethanol, chloroform, đệm bicarbonate hịa lỗng tan nước Hệ số hấp phụ phân tử (ε) khác dung môi xác định Theo AOAC, thường sử dụng benzen-acetic acid để tránh tính độc gây nhiễm benzen nên người ta thường pha toluen-acetic acid Bảng 1: Hệ số hấp phụ phân tử (ε) ochratoxin dung môi khác Dung môi λ (nm) ε (M-1.cm-1) Tài liệu Benzen - acetic acid (99:1 v/v) 333 5550 [34] Toluen - acetic acid (99:1 v/v) 333 5440 [46] Methanol 333 6400 [6] Methanol 332 6336 [35] Methanol 332 6330 [36] Methanol 333 6640 [5] Ethanol 333 6100 [31] Ethanol 333 5500 [47] 0.04M Tris-H2SO4, pH=7.5 380 5680 [19] a Không xác định I.1.2 Sinh tổng hợp ochratoxin: Ochratoxin sinh tổng hợp từ khung pentaketide, isocoumarine tạo thành từ acetate malonate thông qua đường polyketide [48] CH2 - COOH CH3COOH COOH CH2 - CH - NH2 O C1 COOH COOH O O O CH3 Cl Cl Cl CH3 CH - CH - NH - C O O COOH CH3 O OH HOOC O OH O Hình 1: Sơ đồ sinh tổng hợp ochratoxin A Hiện nay, có loại ochratoxin biết song song với độc tính chúng: OTA > OTC > OTB > ochratoxin α [16] Độc tính ochratoxin khác liên quan đến nhóm phenylalanine tách dễ hay khó Cl Cl H N 8a OH H CH3 COOH O 4a N O C=O O OH 8a O O Ochratoxin A C2H5 Ochratoxin C H H N Cl 4a CH3 8a CH3 O O HOOC COOH O OH O OH O Ochratoxin alpha Ochratoxin B Hình 2: Cấu trúc hóa học ochratoxin CH3 O 4a O I.1.3 Ochratoxin thực phẩm: Ochratoxin biết gây độc thận, gan, hệ miễn nhiễm số loài động vật gây ung thư thận, gan chuột Ochratoxin tìm thấy nhiều loại nơng sản thực phẩm ngũ cốc, loại thảo dược, bia, cà phê [1], … sản phẩm có nguồn gốc từ động vật chúng ăn thức ăn nhiễm ochratoxin Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer) xếp ochratoxin vào nhóm tác nhân gây ung thư cho người (nhóm 2B) [21] Các độc tố khó loại trừ hoàn toàn khỏi thức ăn cho người súc vật trình chế biến, chúng xem chất nhiễm tránh khỏi Bảng 2: Ochratoxin nhiễm tự nhiên số nơng sản Sản phẩm Quốc gia Số mẫu phân tích % nhiễm Nồng độ Tài liệu (μg/kg) Mầm lúa mạch Đan Mạch 50 6.0 9-189 [20] Bắp Pháp 463 2.6 15-200 [25] Lúa mì, yến mạch Yugoslavia 47 12.8 5-90 [24] Thức ăn hỗn hợp Ba Lan 203 4.9 10-50 [22] Hạt cà phê Mỹ 267 7.1 20-360 [29] Bắp Mỹ 283 0.4 110-150 [44] Lúa mạch Mỹ 127 14.2 10-40 [31] Cách 10 năm, có chứng cho thấy ochratoxin cịn tìm thấy huyết người khỏe mạnh người ăn thực phẩm nhiễm ochratoxin Nồng độ OTA huyết trung bình từ 0.068 – 0.88 ng/ml [48] Ở số quốc gia nồng độ cao nhận thấy Bảng 3: Nhiễm ochratoxin huyết người khỏe mạnh Quốc gia Thời gian thu mẫu Số mẫu + / phân tích % nhiễm Nồng độ (ng/ml) trung bình vùng Canada 1994 144/144 100 0.88 0.29-2.4 Croatia 1997 148/249 59 0.39 0.2-1.6 Đức 1988 142/208 68 0.75 0.1-8.4 Ý 1992 65/65 100 0.53 0.1-2 Tokyo, Nhật 1992-1996 156/184 85 0.068 0.004-0.28 Tây Ban Nha 1996-1998 40/75 53 0.71 0.5-40 10 II.2.5 Pha định lượng ochratoxin chuẩn: Ochratoxin A, 1mg (O1877, Sigma) Pha thành dung dịch ochratoxin chuẩn benzen-acetic acid (99:1 v/v) xác định nồng độ phương pháp đo quang phổ bước sóng 333nm (dung dịch mẹ) OD333 x MW x 1000 µg ochratoxin / ml = ε MW: trọng lượng phân tử OTA (403) ε : hệ số hấp phụ phân tử ochratoxin λ=333nm (5550) Từ dung dịch mẹ pha thành dung dịch làm việc có nồng độ 0.25ng/µl methanol dùng 26 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: III.1 Qui trình gây miễn dịch thỏ tạo kháng thể kháng ochratoxin: Do ochratoxin hapten, dạng tự không tạo đáp ứng miễn dịch nên cần gắn với protein giá (Bovine Serum Albumin, BSA) Nhóm –COOH ochratoxin A hoạt hóa tạo dạng NHS ester cộng hợp vào nhóm –NH2 phân tử BSA Trong giai đoạn đầu trình gây miễn dịch, lực kháng thể yếu nên theo dõi đáp ứng kháng thể nhóm hapten (ochratoxin A) phức tạp nhiều so với theo dõi xuất kháng thể protein giá BSA Vì vậy, bước đầu để chọn lọc thỏ có đáp ứng miễn dịch với cộng hợp OTA-BSA, kiểm tra kháng thể kháng BSA kỹ thuật khuếch tán kép agarose Tiến hành gây miễn dịch thỏ cộng hợp OTA-BSA (theo qui trình mơ tả phần phương pháp II.2.2), 14 ngày sau mũi tiêm nhắc lại 1, thỏ lấy máu để kiểm tra đáp ứng miễn dịch BSA Bố trí xét nghiệm huyết hình - Giếng 1: huyết trước gây miễn dịch - Giếng 2, 3, 4, 5, 6: huyết sau mũi tiêm thứ hai pha loãng: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 tương ứng với giếng - Giếng 7: kháng nguyên BSA Hình 7: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch Nhận xét: sau gây miễn dịch thỏ có đáp ứng miễn dịch protein giá BSA III.2 Qui trình tinh chế kháng thể kháng ochratoxin: III.2.1 Tinh chế kháng thể ammonium sulfate 45% bão hòa: Sau mũi nhắc lại 3, 4, lấy máu thỏ tách huyết Sử dụng ammonium sulfate 100%S bão hòa để tinh chế IgG từ huyết (phụ lục 1) 27 III.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết kháng thể sau tủa kỹ thuật điện di SDSPolyacrylamide gel 10%: Phân tử kháng thể có trọng lượng 150.000 daltons, gồm hai chuỗi nặng hai chuỗi nhẹ liên kết qua cầu –S-S– nội phân tử Khi xử lý dung dịch kháng thể dithiothreitol (DTT) để khử cầu nối –S-S– nội phân tử chạy điện di ta thấy hai băng chuỗi nặng chuỗi nhẹ với trọng lượng phân tử tương ứng 50.000 daltons 25.000 daltons Kết trình bày hình Giếng 1: Huyết sau gây miễn dịch (không xử lý với DTT) Giếng 2+3: Kháng thể sau tinh chế (không xử lý DTT) hai hàm lượng 5, 10µg Giếng 5+6: Kháng thể sau tinh chế (có xử lý DTT) hai hàm lượng 5, 10µg Giếng 7: Huyết sau gây miễn dịch (có xử lý với DTT) Giếng DTT Ỉ - - + + + IgG Albumin (xử lý với DTT) Chuỗi nặng Albumin (không xử lý với DTT) Chuỗi nhẹ Hình 8: Điện di SDS-Polyacrylamide gel 10% Nhận xét: sau tinh chế, kháng thể có độ tinh khiết cao III.2.3 Loại kháng thể kháng BSA kỹ thuật sắc kí lực miễn dịch qua cột Sepharose 4B-BSA: Cho dung dịch kháng thể qua cột Sepharose 4B-BSA IgG kháng BSA bị giữ lại cột Dung dịch qua cột (dung dịch 1) chứa kháng thể kháng ochratoxin Kiểm tra kháng thể kháng BSA dung dịch hay không kỹ thuật khuếch tán kép agarose Nếu khơng có đường tủa với kháng ngun BSA dung dịch hết kháng thể kháng BSA Bố trí xét nghiệm hình 28 (1) - Kháng nguyên BSA (2) - Dung dịch kháng thể trước qua cột Sepharose 4B-BSA (3) - Dung dịch (IgG đặc hiệu với ochratoxin, khơng cịn IgG kháng BSA) Hình 9: Khuếch tán kép thạch Nhận xét: IgG kháng BSA loại khỏi dung dịch sau qua cột Sepharose 4B-BSA III.3 Qui trình gắn kháng thể kháng ochratoxin lên gel tạo cột sắc kí lực miễn dịch bắt ochratoxin: Kháng thể kháng ochratoxin: kháng thể thu sau loại kháng thể kháng BSA (cùng với nhiều IgGs khác có mặt huyết thỏ, không gây ảnh hưởng đến kỹ thuật làm cột sắc kí Các IgGs khơng đặc hiệu với ochratoxin đóng vai trị để pha lỗng IgG đặc hiệu giá rắn) Nồng độ kháng thể: 6.92 mg/ml Thể tích: 10 ml Gắn IgG lên Sepharose 4B: 10 mg/ml, thể tích cột: 0.1 ml Số cột: 50 cột III.3.1 Đánh giá khả tóm bắt gel sau cộng hợp: Để đánh giá khả bắt ochratoxin kháng thể sau tinh chế, tiến hành sau: - Pha dung dịch ochratoxin A chuẩn methanol nồng độ 0.25 ng/µl - Tạo cột IAC: 10mg kháng thể / ml gel - Cho 2ppb ochratoxin A chuẩn qua cột vừa tạo, chiết mẫu theo qui trình (phụ lục 2) thực lặp lại cột - Đo dịch chiết máy HPLC với đầu dị huỳnh quang bước sóng kích thích: Ex = 333nm bước sóng phát xạ: Em = 460nm - Thực song song cột IAC khác khơng có OTA chuẩn để xem có nhiễu cột hay không Peak thu sau qua cột có thời gian lưu trùng với thời gian lưu peak ochratoxin A chuẩn (tR = 4,7 phút) Vì peak peak ochratoxin 29 a) b) c) Hình 10: Sắc kí đồ a) Chuẩn OTA 2ppb b) Nền cột IAC c) Mẫu trắng + chuẩn OTA 2ppb Nhận xét: Kháng thể sau tinh chế có khả bắt ochratoxin A cột sắc kí khơng bị nhiễm tạp 30 III.3.2 Xác định dung lượng cột IAC: Cho hàm lượng OTA chuẩn 2, 5, 10, 20, 50, 100ng qua cột IAC chiết theo qui trình (phụ lục 2.1) Thực lặp lại cột hàm lượng Ochratoxin A dịch giải hấp xác định hàm lượng phương pháp HPLC Kết trình bày bảng Bảng 7: Kết dung lượng cột IAC Lượng thu hồi trung bình (ng) 1.83 5.23 10 10.69 20 24.1 50 53.5 100 54 Lượng OTA thu hồi (ng) Lượng OTA chuẩn cho vào (ng) 60 50 40 30 20 10 0 50 100 150 Lượng OTA cho vào (ng) Hình 11: Biểu đồ biểu thị dung lượng cột Nhận xét: Dung lượng cột 53.5ppb ứng với 0.1ml gel III.4 Thử ứng dụng mẫu cà phê nhân so sánh với cột OchraStar Fit COIAC2001 (Romer Labs-Austria): III.4.1 Thử ứng dụng mẫu cà phê nhân: - Số mẫu: 30 mẫu - Nguồn mẫu: Café control 31 - Phương pháp đánh giá: HPLC - Chiết mẫu theo qui trình (phụ lục 2.2) - Kết trình bày bảng Bảng 8: Kết ứng dụng 30 mẫu cà phê nhân Mẫu Số mẫu Tỉ lệ (%) Hàm lượng (ppb) Âm tính 0 Dương tính (5ppb) 13.33 10.23 – 22.59 Nhận xét: Trong 30 mẫu, có mẫu dương vượt giới hạn cho phép (>5ppb) chiếm tỉ lệ 13.33% 26 mẫu nằm giới hạn (