Nghiên cứu sản xuất cột sắc ký ái lực miễn dịch dùng để định lượng aflatoxin

SỞ KHOA HỌC - CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG TP HO CHÍ MINH BÁO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU „ DE TAI: „ NGHIÊN CỨU SẲN XUẤT CỘT SAC KY AI LUC MIỄN DICH DUNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: PHÂN VIỆN CƠNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Chủ nhiệm : Cộng tác viên : Ks BÙI VĂN THÌN Ts NGUYÊN LÊ TRANG Ts LE VAN TO Ks TRAN VAN AN THANG NAM 2000 SA Cât sắc ký Ai lúc miẫn dich Phân Viện Công Nahệ Sau Thụ Hoạch NỘI DUNG 2-7 Phần giới thiệu 1.1 2-4 Aflatoxin 1⁄2 Nấm mốc sinh độc tố 4-6 1.3 Các phương pháp kiểm tra aflatoxin 13.1 Phương pháp hóa lý 13.2 Phương pháp miễn địch học : 14 Về kỹ thuật sắc ký lực miễn dịch 5-6 6-7 II Nội đung phương pháp nghiên cứu 7-9 IL.1.1 Gây miễn dịch tạo kháng thể IL1 Sản xuất kháng thé (IgG ) khang aflatoxin 11.2 I2 11.2.1 Tinh chế IgG Tạo cột sắc ký lực miễn dịch Tạo cộng hợp Sepharose - IgG khang aflatoxin 7 7-9 7-8 11.2.2 X4c dinh tính chất cột II Kết bàn luận 9-15 lượng nhanh IL3 Chế tạo cột sắc ký lực miễn địch bán định IIL1 Về sản xuất IgG kháng aflatoxin I2 Cột sắc ký lực MD TII3 9-10 Các tính cột 10-13 lực MD bán định lượng nhanh 13-14 IL4 Sản xuất ứng đụng kỹ thuật cột sắc ký 1.5 Tạo cộng hợp aflatoxin - Bi-BSA AcA-IgG Ill Hoạthóa giá rấn AcA tạo cộng hợp nhập ngoại kháng aflatoxin để thay Sepharose hoạt hóa TV Kết luận V Tài liệu tham khảo 14 14 15 16 Cái sắc ký Ai luc miễn dich Phân Viện Công Nghệ Sau Thụ Hoach PHẦN GIỚI THIỆU 1.1 Aflatoxin (AFS) Aflatoxin - độc tố nấm mốc, sắn phẩm thứ phát từ q trình trao đổi chất mốc nhóm Aspergilius tổng hợp, Aflavus, A parasiticus Ti aflatoxin bắt nguồn từ chữ "a" Aspergillus, “fla” từ tên loài flavus cồn " toxin" có nghĩa độc Có khoảng 16 độc tố aflatoxin khác nhau, nhiên có aflatoxin B1, B2 GI, G2, MI (AFBI, AFB2, AFGI, ) kiểm tra giám sát thường xuyên nơng phẩm thức ăn gia súc Hình cho thấy cấu trúc phân tử độc tố nấm kể Cịn bang cho biết thành phần hóa học tính chất vật lý aflatoxin Theo hiệp hội ung thư, aflatoxin liệt kê vào nhóm độc chất gây ung thư cao Khi vào thể aflatoxin chuyển tới tổ chức gan thận Trong thể, aflatoxin chuyển hóa thành dạng epoxide gốc C2 - C3 vùng dihydrofuran, với cấu trúc epoxide, aflatoxin dé dàng tạo liên kết déng trị với phân tử DNA enzyme hay protein cấu trúc Aflatoxin liên kết DNA nhiễm sắc thể tạo tiễn lệ cho bệnh ung thư Còn liên kết với protein cấu trúc làm tổn thương gan, song hành với bệnh viêm gan B, C thi đễ gây nên bệnh xơ gan Người mẹ mang thai nhiễm độc aflatoxin có nguy bị sẩy thai dị tật thai Đã có nghiên cứu nhiễm aflatoxin thức ăn gia súc (3), bệnh aflatoxicosis Việt nam (4), giải pháp phòng ngừa nhiễm độc aflatoxin (5) Liêu chết (D50) AFBI chuột 1,2 mạ/ kg, và- AFGI 1,5mg - mg/1kg qua đường tiêu hóa Bang 1: liểu chết AFBI đối số súc vật (gây nhiễm lần) Súc vật Vịt, Chuột Hamster Chuột đất vàng Chó Tuổi Cân nặng) ngày 30 ngày trưởng thành trưởngthành Đường gây nhiễm tiêu hóa - bung - LD50 mg/kg 0,37 10,2 1,0 1,0 Phân Viên Công Nghệ Sau Thu Hoạch Côt sắc ký Ai lực miễn địch ‘Binh 1: Cấu tạo hóa học AFBI, AFB2, AFM1, ọ IIO ọ CÔ m @“ `*ơ | SS OCH; My C ~o ởA we | cơng thức Hóa học lượng phân tử điểm hấp phụ phát nm Quang nóng chảy 362-363 huỳnh Bl B2 Gl C17H1206 C1I7TH1406 C17H1207 = 312 314 328 268-269 286-289 244-246 21800 23400 16100 425 425 450 G2 C17H1707 330 237-240 21000 450 M1 C17H1207 328 299 19000 425 (357nm) M2 C17H1208 = 330 293 2100 (357) B2a C17H1407 330 240 20400 - HO L #~oe1 lạ Aflatoxicol Bang : Các tính chất hóa lý aflatoxin Aflatoxin OCH; Mạ Qo mm Ị Phân Viên Công Nghệ Sau Thu Hoạch Côt sắc ký Ai lực mién dich Aflatoxin hạt ngữ cốc vững, song hoạt tinh dé bi hủy tác động kiểm Vòng lacton bị vỡ đưới tác động kiểm Đây sở khoa học để sở dụng amonia để khử độc aflatoxin (6) Dưới tác động acid mạnh, AFBI1 AFGI chuyển sang dạng "cộng hợp nước" B2a G2a, song giữ nguyên độc tính ban đầu Nhiệt độ 100°C khơng ảnh hưởng tới độc tính aflatoxin Nhiệt độ 180-200°C 30 phút khơng làm giảm tính độc aflatoxin 1.2 Nấm sinh aflatoxin loài nấm chủ yếu sinh độc tố aflatoxin A flavus va A parasiticus A nomius(1) Những thí nghiệm nhằm xác định nhiệt độ tối ưu sinh tổng hợp aflatoxin chủng A flavus/parasidcus cho thấy nhiệt độ 7,5°C 40°C không chủng sinh độc tố Nhiệt độ tối ưu cho nấm tổng hợp từ 24°C đến 28°C (`2) Các nông phẩm dễ bị nhiễm aflatoxin ngô, lạc, ý dĩ, hạt bông, gạo, số ngũ cốc khác Do vai trò aflatoxin sức khỏe người gia súc nên aflatoxin có ảnh hưởng định tới thị trường bn bán ngũ cốc toàn giới 1.3 Các phương pháp kiểm tra aflatoxin Có nhóm kỹ thuật sử dụng để kiểm tra aflatoxin : -_ -_ Các kỹ thuật hóa lý Các kỹ thuật sinh học 1.3.1 Các kỹ thuật hóa lý Các kỹ thuật aflatoxin: -_ -_ - sau ứng dụng để kiém tra- vA phát kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) Kỹ thuật sắc ký lổng cao áp (HPLC) Ky thuật sắc ký khí (GC) Theo qui định VN lượng aflafoxin chứa thực phẩm không 10ppb, thức ăn gia súc khơng q 20ppb Vì hàm lượng aflatoxin theo qui định thấp nên trước định lượng cần phải cô đặc làm tinh sach ( clean-up ) Aflatoxin chất ky nước nên tồn q trình chiết xuất, làm tỉnh phải dùng dung môi hữu độc hại, tốn nhiều thời gian Côt sắc ký Äi lực miẫn dịch Phân Viên Công Nghệ Sau Thu Hoach 13.2 học Các kỹ thuật sinh học hay gọi hệ thống thử thách sinh Các kỹ thuật sinh học bao gồm thử độc tính tế bào động vật có vú ni cấy thử tác động gây đột biến di truyền độc tố lên vi khuẩn kĩ thuật miễn dịch học sau đùng để kiểm tra phát aflatoxin: -_ -_ Miễn dịch phóng xạ ELISA Sắc ký lực miễn dịch (SKALMD) Aflatoxin phân tử có trọng lượng khơng lớn (312 đơn vị), hapten, nên cần gắn với phân tử lớn protein (BSA) có đáp ứng MD; thơng thường gắn qua gốc cabonyl vịng cyclopentanon Như epitop kháng nguyên nằm vùng đỉhydrofuran Dễ nhận thấy epitop AFBI, AFGI, AFMI, giống Kháng thể polyclonal nhận biết dihydrofuran AFGI1, Aflatoxicol vùng dihydrofuran tạo tử việc tiêm AFBI- BŠA AEMI, M2, afiatoxicol khu vực Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ Xỹ thuật miễn dịch phóng xạ lần năm 1959 sử dụng để kiểm tra insulin Trong kỹ thuật MD phóng xạ cạnh tranh phat hién aflatoxin, kháng thể đặc hiệu ủ với lượng định aflatoxin đánh dấu đồng vị phóng xạ với aflatoxin mẫu phân tích Tủa loại phức hợp kháng thể - aflatoxin, phần toxin đánh dấu lại đo phóng xạ Trên sở lượng aflatoxin đánh dấu bám với kháng thể lượng toxin đánh thuật dấu lại tính aflatoxin có mẫu phân tích Mặc dù kỹ MD phóng xạ cho độ nhậy cao song đồi hỏi trang bị cổng kểnh, dễ nhiễm phóng xạ Kỹ thuật ELISA dùng Thay aflatoxin đánh dấu đồng vị phóng xạ, người ta cao dễ sử enzyme đánh dấu lên aflatoxin Kỹ thuật ELISA có độ nhậy toxin (2) dụng bao gồm hai bước : (1) phần ứng kháng thể lên chất Nói đo hoạt tính enzyme cộng hợp toxin-enzyme điểm chung kỹ thuật ELISA dễ sử dụng, có độ nhậy cao Nhược định lượng ELISA là kỹ thuật bán định lượng, để có echính xác cẩn phải có đường cong chuẩn cho lần kiểm tra 1.4 Kỹ thuật sắc ký lực MD biệu kháng Kỹ thuật dựa nguyên tắc phẩn ứng đặc trị lên nguyên kháng thể, Kháng thể kháng aflatoxin gắn đồng giá rấn ( Sepharose, Sephadex, cellulose) Cộng hợp sepharose-kháng Côt sắc ký Ai lực miễn dich Phân Viên Công Nghệ Sau Thu Hoach thể đóng vào cột Khi cho dung dịch kiểm tra aflatoxin qua cột, tồn thành phần khơng phải aflatoxin theo dung dịch rửa trôi, aflatoxin bị kháng thể cố định cột giữ lại Sau aflatoxin giải hấp methanol Lúc aflatoxin làmtinh cô đặc Lượng aflatoxin thu cé thé bing TLC, HPLC, GC, fluorimeter Hình2 cho thấy sơ lược cách dùng sắc ký lực để tập trung tính chế aflatoxin trước định lượng máy thích hợp Hiện giới hai hãng sinh phẩm chủ yếu sản xuất cung cấp cột sắc ký lực MD dùng để kiểm tra độc tố nấm Hãng Rhone-Poulenc (Pháp) Hãng Vicam ( Hoa Kỳ) Như cột dụng cụ dùng để cô đặc tinh ,ché ( clean-up ) Các aflatoxin trược đo máy phân tích nói ưu điểm chủ yếu kỹ thuật là: độ nhậy cao, thời gian thực hành nhanh, thao tác đơn giản, không dùng hóa chất độc hại Kỹ thuật cho ba mức xác tuỳ theo điểu kiện kỹ thuật trang bị nơi Xét nghiệm bán định lượng nhanh cần có thêm tip hấp phụ Florisil đèn cực m Xét nghiệm tổng aflatoxin có mẫu cẩn có máy có Fluorimeter Cịn cần biết xác aflatoxin riêng biệt mẫu cần có thêm máy HPLC SKALMD biện sử đụng nước Cộng Đồng kinh tế Châu Âu, Hoa kỳ Úc Chính tác giả chứng kiến việc Công ty AgriFood Úc sử dụng cột sắc kí lực MD kiểm tra afiatoxin, ochratoxin số độc tế nấm khác Đây kỹ thuật Phân Viện Công Nghệ sau Thu Hoạch phối hợp với Phịng thí chế tạo nghiệm miễn dịch học Viện Pasteur Tp HCM nghiên cứu 1.4.1 Chế tạo cột SKALMD cẩn thực bước sau : a Sản xuất kháng thể kháng aflatoxin bao gồm : -_ - Gây miễn địch tạo kháng thể kháng aflatoxin đặc hiệu Tinh chế kháng thể b Tạo cột SKALMD Tao cong hop Sepharose IgG khdng aflatoxin Đóng cộng hợp vào cột nhựa kích thước 0,4x10cm e Kiểm tra tính cột sắc ký: -_ khả thu hổi -_ dung lượng bám AFB1/1 khối lượng cộng hợp -_ - khác Phan ting chéo hay tính đặc hiệu cột với aflatoxin Số lẩn tái sử dụng Dùng cột để kiểm tra aflatoxin mẫu nông phẩm mẫu phân tích cột sắc ki xt ge J x sã *} + ‡ rửa vu đe giải hấp Ỷ vd a, : —> > » a » we j + rl i ché aflatoxin Hình : Sơ lược cách dùng SKALMD để tập trung tỉnh Mẫu phân tích có AFs đưa qua SKALMD có cố dịnh kháng thể phải Kháng AFs (A) Sau rửa loại bỏ thành phần không AEs (B), aflatoxin giải hấp methanol (C) kí hiệu pha rin (sepharose) Oo O< > on gắn lên pha tắn kháng thể đặc hiệu kháng AFs aflatoxin thành phân AFs Cái Phan Viên Công Nghệ Sau Thụ Hoạch - sắc ký Ai lực miễn dịch 1.4.2 Cột sắc ký lực MD bán định lượng nhanh Cột sắc ký lực MD bán định lượng nhanh dùng cho sở chế biến thức ăn gia súc qui mơ lớn, vừa nhỏ hay gia đình nhằm mục đích sàng lọc ngun liệu thơ trước đưa vào chế biến 1.4.3 Hoạt hóa pha rắn ( sepharose, cellulose) để cố định IgG 1.4.4 Hoạt hoá aflatoxin để gắn lên BSA tạo cộng hợp AFBI-BSA thay cộng hợp AFB1-BSA nhập ngoại IL NOI DUNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Sản xuất kháng thể ( IgG ) kháng aflatoxin-B1 1I.1.1 Gây miễn dịch Thổ chọn súc vật gây MD tạo kháng huyết Thỏ vừa trưởng thành loại kg/con, nuôi l0 ngày trước tiêm MD Tiêm da (trên lưng), tiêm bắp ( phía đài chân sau) Kháng nguyên tiêm MD cộng hợp aflatoxin B1-BSA -hãng Sigma Chemical ( Hoa kỳ ) Kháng nguyên trộn với adjuvant toàn phần cho tiêm đầu Iml kháng nguyên cho khoảng 30 mũi tiêm lưng, 1ml kháng nguyên lại cho mũi tiêm bắp đùi chân sau 30 ngày sau, tiêm nhắc lại, kháng nguyên lân tron déu với adjuvant không toàn phần Tiêm lần tháng Liễu tiêm lần cho† thỏ 0,3mg AFB1-BSA IL1.2 12-14 Huyết muối Tinh ché IgG ngày sau lần tiêm thứ lấy toàn máu từ động mạch đùi ly tâm tách bổ hơng cầu, sau pha lỗng gấp đơi nước sinh lý Cho tủa IgG sulphat ammonium 50% Tiếp tục tủa có IgG bing 38% sulphat ammonium để loại protein khác transferrin, IgG tủa thu cho thẩm tích PBS, 1mM, 4°C IgG thu cho phản ứng với BŠA để loại IgG kháng BSA ( albumim huyết bồ ) 1I.2 Tạo cột sắc ký lực MD 11.2.1 Tạo cộng hợp sepharose-IgG kháng aflatoxin - B1 IgG thu dude tinh chế gắn đồng trị lên sepharose hoạt hóa CNBr theo qui trinh cia Pharmacy ty 1é 10 mg IgG/1 ml Qué trinh gắn gian thực biện chế độ nhiệt độ: 22°C - 25°C với thời trộn 4°C 24 Trong thời gian cộng hợp, hỗn hợp liên tục máy lắc nhẹ Khi cộng hợp kết thúc can kiém tra lai IgG Côt sắc ký Ai lực miễn địch Phân Viên Cơng Nghệ Sau Thu Hoạch cịn dư hỗn dịch để đánh giá hiệu suất gắn Hiệu suất cao chất lượng cột cao Cộng hợp sepharose- IgG gel có độ thấm cao cho chất lồng chẩy qua Sau sử lý để loại bổ IgG cồn bám học gel, gel đóng vào cột nhựa kích thước 0,4cmx10cm với lượng 0,1m1-0,15ml / cột IL2.2 Xác định tính cột ~_ Xác định dung lượng aflatoxin - B1 / gel Lượng aflatoxin -B1 chuẩn biết trước đưa vào cột tăng dẫn khơng cịn sức chứa, lúc biết dung lượng chứa tối đa cột aflatoxin-B1 - Kiém tra phan tng chéo cột aflatoxin khác, hay tính đặc hiệu cột Do kháng thể thu dude IA polyclonal, mat khác trình bẩy cấu trúc phân tử AFBI, B2, M1, G1, G2 có nhiều điểm tương vùng dihydrofuran, chúng tơi xác định thêm tính đặc hiệu cột affatoxin-M1, aflatoxin G1 Tính vững cột Sau lần dùng, cột phục hỏi đệm PBS,10mM, pH 7,2 dùng lại để thu hổi aflatoxin mẫn nông phẩm nhất, Làm nhắc -_ lại lần So sánh kết thu sau lần thử nghiệm Thử nghiệm dùng cột để thu hồi: Một mẫu bắp âm tính vé aflatoxin trộn với lượng aflatoxin định Hai lượng bắp được thử nghiệm 10g 50g liéu aflatoxin B1 cho trộn với bắp 10, 20, 50ppb Sau trộn, aflatoxin chiết 55% cơn, sau pha lỗng cổn mức < 30% cho qua cột để thu hổi aflatoxin, định lượng aflatoxin thu hổi TLC ~_ Kiểm tra aflatoxin mẫu nông sản cột sắc ký Các mẫu nông sẵn nghỉ aflatoxin kiểm tra song song cột sắc ký lực phương pháp hóa lý 1I.3 Chế tạo cột sắc ký lực MD bán định lượng nhanh Bộ kỹ thuật sắc ký lực MD bán định lượng nhanh gồm : - cột sắc ký - Tip cé aflatoxin chuẩn: 10ppb, 20ppb, 50ppb - tip h&p phy aflatoxin Bộ kỹ thuật cung cấp cho sở chế biến thức ăn gia súc chọn ngun liệu thơ có chất lượng tốt aflatoxin trước đưa vào chế biến Bộ kỹ thuật cho mức phát từ 10ppb trở lên Phân Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch Cát sắc ký Ai lực miễn dịch TÀI LIỆU THAM KHẢO Z Kozakiewicz 1996, Occurrence and significance of storage fungi and associated mycotoxins in rice and cereal grains ACIAR Technical Reports, 37 Somkiat contamination Prachayawarakorn, in maize stored et al under 1996, Controlling aflatoxin tropical conditions ACIAR Technical Reports 37 Duong Thanh Liem and Le Anh Phung, 1996, Aflatoxin in feeds and effects on poultry production in Vietnam ACIAR Technical Reports, 37 Tran Van An and Duong Thanh Liem 1996 The aflatoxicosis problem and management of aflatoxin in feeds in Viemam ACIAR Technical Reports, 37 Dau Ngoc Hao et al 1995 Effects of mycofix plus on aflatoxin B1 at varying concentrations in feed for broilers and layers Science and technical veterinary, VN, 2,Page 48-56 Lillehoj, E B., and Elling, F 1987 Decontamination of aflatoxincontamination-maize A Proceedings of the Workshop Cetro international de mejoramiento de maiz y trigo, Mexico City, Mexico 16 Phân Viên Công Nghệ Sau Thu Hoạch Côt sắc ký Ai lực miễn dịch PHỤ LỤC Nhận xét Trung Tâm phân tích hóa lý TP HCM Nhận xét Xí nghiệp thức ăn gia súc An Phú Đánh giá Công Ty TNHH Nông lâm Bình phước Báo cáo khoa học khảo sát tình hình nhiễm aflatoxin thức ăn gia súc Sóc Trăng kỹ thuật sắc ký lực chế tạo PV Công Nghệ Sau Thu Hoạch Hướng dẫn sử dụng cột sắc ký lực miễn dịch Một số hình ảnh cột sắc ký 1? Sở Khoa học Công nghệ Môi trường Cộng hoà Xã hội Chủ nghĩa Việt nam Thành phố Hồ Chí Minh Độc lập - Tự - Hạnh phúc TRUNG TÂM PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM NHẬN XÉT VỀ ĐỀ YÀI NGHIÊN Cứu SảN XdấT CỘT sắc KÝ LỰC MIEN DICH DUNG DE DINH LUQNG AFLATOXIN Qua báo cáo thực để tài , hoan nghênh tác giả chế tạo thành công cột sắc ký lực mién dich (SKALMD) - Tác giả tiến hành thử nghiệm có kết sau đây: - Khả bất giữ aflatoxin Bị bắp với hiệu suất cao từ 88% trở lên „ - Hoạt tính bắt giữ aflatoxin Bị gần khơng thay đổi sau lần sử dụng - Kết phân tích aflatoxin với cột SKALMD tác giả tương đương tốt so với phương pháp sắc ký ban méng TLC Tác giả thử sẩn xuất kit thử nhanh bán định lượng aflatoxin dựa kỹ thuật hãng Rhéne Diagnostics Các kết đạt theo báo cáo đáng phấn khởi Sau vài góp ý : 1) Tác giả chưa nói rõ báo cáo sử đụng phương pháp để định lượng aflatoxin bắt giữ cột SKALMD tác giả thực vai trị cột bắt giữ aflatoxin „ giúp người thí nghiệm có dung dịch đậm đặc aflatoxin nhiều so với mẫu để mang phân tích định lượng 2) Do xin tác giả nói rõ "so sánh kết phân tích phương pháp TLC với phương pháp SKALMD nào?" : Thực cách làm tác giả phối hợp cä để định lượng aflatoxin mau, dùng cột SKALMD để bắt giữ aflatoxin từ dung địch có sử dụng TLC để định lượng Cũng để nghị tác giả cho biết định lượng aflatoxin mồng cách (mắt hay sử đụng thiết bị) 3) Để nghị tác giả cho biết giới hạn phát aflatoxin B, I mẫu thực phẩm bắp chẳng hạn sử dụng cột SKALMD tác giả CÔNG TY T.N.H.H NÔNG LÂM ĐÀI LOAN (VN) MOT SO NHAN XET VE PHUONG PHAP KIEM TRA AFLATOXIN BANG COT SẮC KÝ AI LUC MIEN DICH (1.A.C) s Phòng phân tích thức ăn gia súc cơng ty nơng lâm Đài Loan tiếp nhận chuyển giao phương pháp kiểm tra Aflatoxin cột sắc ký lực miễn dịch ( I A C ) F.C.C_ Qua gần năm sử dụng phương pháp để kiểm tra Aflatoxin thức ăn gia súc nhận thấy phương pháp ứng dụng nhanh giới hạn cho phép Aflatoxin có thức ăn gia súc để xác định Phương pháp có ưu điểm đơn gidn,dé lam ,thời gian để kiểm tra mẫu thức ăn nhanh ( khoảng 180 phút có kết ) Thích hợp với điều kiện trang thiết bị phịng phân tích đơn vị sản xuất Hạn chế phương pháp khơng thể biết xác hàm lượng Aflatoxin thức ăn mà biết năm khoắng cách cỡ 10 ppm Tuy có hạn chế sở sản xuất thức ăn gia súc phương pháp sử dụng để tránh sử dụng loại nguyên liệu bj nhiém Aflatoxin giới hạn cho phép Bình Dương ngày 25 tháng năm 2000 Trưởng phịng phân tích TRAN MINH TAM ti, (@) TỔNG CƠNG TY NƠNG NGHIỆP SÀI GỊN XN THUC AN GIA SUC AN PHU S8 162 Phường An Phú, Quốn 2.TP Hồ Chỉ Mịnh ĐI 8995720 - 8976612 Fox B4-8-8976612 BẢN NHẬN XÉT Là doanh nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, yếu tố chất lượng mà chúng tơi ln ý đến tính an toàn nấm mốc, vi sinh nguyên liệu thành phẩm in Từ phịng phân tích tiếp nhận phương pháp kiểm tra Aflatox cho phương cột sắc ký lực miễn dịch (LA.C) phịng phân tích FCC thay pháp vi cột trước chúng tơi thấy rằng: giản - So với phương pháp vi cột phương pháp sắc ký lực miễn dịch đơn (về hóa chất sử dụng thao tác), cho kết nhanh xác vi sẵn xuất thức ăn - Tuy phương pháp bán định lượng xét phạm pháp tốt Điều gia súc nói chung XN chúng tơi nói riêng vận phương pháp sắc ký lực quan trọng phí cho mẫu kiểm tra theo phương xác so vơi miễn dịch thấp nhiễu có kết tương đối Afiatoxin cụ thể phương pháp khác nhập thêm máy để dọc lượng TP.HCM ngày 31 tháng 05 năm 2000 Ÿ, GIÁM pốc XÍ NGHIỆP TP, KY THUAT NGƯỜI PHÂN TÍCH [8 The Kirn lan, "Euuu 22„/£ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT G1, Cục THỦ sức Trăng CONG Y HÓA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Doe hip - Tự dù - Hạnh phúc giúp cho gia súc phát triểu vã sinh Tuy nhiền bến cạnh củ thể na tổ Aflatoxin tay, 20 mộc AspecrgiHas † od tác hai bìa, Vào nău: ¡1 10 coa tịt bị chết nguyên nhân ‘ nhụng ăa cho đần gia cẩm bị ahiểm độc tố AflaRoxin cắm với độc tổ ây, Trong xuất Kính đoanh biện pháp quản trình hình nav có nhiền thị trưởng, by on thể ngà, làm tt ;, gã, bồ đểu nbay loại thức đo nhiều nhà sản chứng í4 chưa thực (mg cục thực thức ăn sở kỹ thuật, bước đâu, nhằm Pighi định I3 ve quản Íw hạn chế thiệt hại chăn nuôi thực ân, Chị cục Thú v Sóc Trăng hàng g1o triển khai lấy mẫn loại thức ăn kính doanh cửa hàng thức Äa gia sức gia cắm trùng tỉnh kiểm tra hãm lượng đặc tố thưc ăn MỤC ĐÍCH : - Nhâm mục dịch ginp người chân sư dụng thức ân an toận động thời phát Kịp tiột tiúc an hông ddam ba tidu shuấn có biến pháp xử, - Phc hiển Meni ding L7 ve quản Ì€ trúc ăn số ki thuạt thức ăn vú gây g3y ngộ đặc : tổn thường có xuyên (câu trúc quan Bị phá hủy; tính thường + bẻ bị chết biểu 2,7 Hgớ + Khi bò tầm lượng ag | 5Hg/g, sữa Đỏ có aflatwaiavvà pI + Lain chi dude tdi O3pg/2 giảm tầng tating va pha bay gan Nói chung,lên ham nhong lượng Ẽ afkdoxin vii ligu thức > O,7ivg sé 1am ăn khôngl vượtvuớỢi q mức 2Gug/ke (20 ppb) Muc qui dịnh Công đồng chung Châu Âu cho loại thức ăn sa súc san : + Thức ần trực tiếp, thức án SOpéxg, tràn cho gia sức, cửn để + Thức da trén cho kin va gia cam :20 puke + Cae loat thie An kad) : [dudes a : Hap, 4, Các phương pháp phưán tịch Phường pháp huỳnh quang định tính sử dụng để sàng lọc, Sắc ký hẳng cao án Cột lực vàng lục - phương pháp Mẫu kiểu nghiệu Aflalosin dược viết xuất KhỎi taẫu Methanol, Dich ch tđược bạn cật có kháng thé, Kháng lử lại cột Cột rửa nước cất cho rape chất, Sau kháng nguyễn địt ức tách khỏi kháng thể bing methanol va dược phát TipFlorisiL froag TopPlorisil: Aflatoxin phat huỳnh quang dudi dah sing nf ngoai, Néng dé Aflatoxin mẫu KếT thực : Nầm 1997 ; 100 mẫu bột cá) 20 cửa hàng (các loạib ap, ttim, Higro,C argl, Con xã huyện, thị cò, 57 mẫu hàm lượng thấp 10 ppb, 34 mẫu hàm lượng 19 ppb mẫu với hầm gan bing 100 ppb mấu với hàm lượng gẫn 50 ppb Xứ lự4 k bar bap bướng dẫn cho người chăn Bị nhi Đi nhiề u SẼSỐ ppb,ca mà ¬ sử Mãm Afiex, Chinton, huyện cửa Sẻ hàng nuôi sử dụn hở dụng u é hang không bột bắp lô hàng 1998: 198 mẫu (các logi thife Sn Higr o, Con 6, Cagrill, bot ca, bap, ¢ cảm, banh dau divai 3Ư cửa hang d 11 xa thị Trong : l 25 mẫu hàm lượng thân 19 ppb 39 mẫu đ hầm lượng ưên tở ppb + mẫu với naw sẵn 100 ppb 10 mẫn với hàm lượng cao hởn 50 ppb Xử lý bạo bột bắp cửa để nghị cửa hàng không hưởng dẫn cho người chắn nuôi sử dang 100%: bật bắp hồ hàng hị nhiềm 50 ppb, ma ch sử dụng rử 20 - 30% dé bho quant & ấn, nhưý thứ chữa có nằm i6 van để hạn dũng thức Ti CšYV nie YOY ruyếc hep GSGC long , ăn bệnh sử dụng thức án có độc tổ Àfiato031n Tuy nhiên việc thựy nhiều hạn chế chưa xác khoảng hay định hàm lượng chình xác mà xác định lý Nba nước, kinh phí hạn hàm lượng qui định, Với inụe đích thực quản nhiềm Aflatoxin để từ chế, nên Chỉ cục chưa xác định rổ nguyễn nhân nhà xân xuất, có biện pháp xử lý cụ thể ' cửa hãng hay VI, RIẾN NGHỊ: thức ăn khơng Với ứnh hình kinh doanh nhiều sổ tmuua bán lượng thực cho người tiên đăng ký, sở thường cỡ sở mua bán nuôi, không đẳng ký đùng sở ấp vịt họ bán kèm thức ăn chăn Chỉ cục, nên Chỉ cục Mhững sở không thuộc phạm vị quản lý g sở này, Từ có khơng thể thực nhiệta vụ đổi với nhữn tác quảa4 tý chất lượng thức ần sở khó khăn tràngo cơngic này, thời bạn sử cửa hàng hị cục dụng thức ãa có sở, kinh doanh thức Jin gia út #ia Thư để aphi Cục thắc ¡ắc câm có đăng ký, Trước tình hình đó, Thú v, Trang tian Thủ v Vũng có gui định gìa câu: Hong kinh cụ thể lãnh vực kinh‹ laanh thức ăn gia súc doanh thuốc thú v + CÁCH SỬ DỤNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH KIỂM TRA AFLATOXIN Jeol ĐO XElcdOkokk Mục đích sử dụng Phân Viện CNSTH hợp tác với Phòng MD học Viện Pasteur Tp HCM chế tạo cột sắc ký lực miễn địch dùng để kiểm tra aflatoxin ( B1, B2, G1, G2, MI) Kỹ thuật sử dụng đơn giản, nhanh, kinh tế, kết xác Dựa nguyên tắc kháng thể đa dịng có lực cao, kháng aflatoxin đặc hiệu gắn Gel sepharose đóng cột ( 0,1 ml gel ), kỹ thuật có độ nhậy cao đặc hiệu Các nơng phẩm dùng để kiểm tra aflatoxin kỹ thuật này: lạc sản phẩm từ lạc, Kỹ thuật cho đặc hấp phụ Kỹ thuật cho ng6, đậu nành, hạt bơng, ý đĩ, sữa bị thức ăn gia súc, kết bán định lượng nhanh sau aflatoxin làm tỉnh cổ qua Florisil tip soi đưới đèn UV so sánh với tip có aflatoxin chuẩn phép định lượng xác sau aflatoxin cô đặc, tỉnh sạch, đo HPLC, TLC, Fluorimeter Cách sử đụng Lắp cột sắc ký vào sering trung gian (10 mJ), cố định sering trung gian giá đỡ, cột sắc kí có cốc hứng, Chiết xuất mẫu Cho 50 g mẫu xay kĩ g NaCl vio máy xay sinh tố dung tích L Cho 250 mi hỗn hợp cổn ethanol(hoặc methanol) - nước ( 55:45 ) vào máy xay xay tốc độ cao phút: Lọc qua phếu có giấy lọc, lấy chừng 20 - 50 ml Cứ mi địch chiết tương đương 1g mẫu Dịch chiết pha thêm với nước cất theo tỷ lệ 1:1 để giảm nồng độ cổn xuống 30% Hấp phụ dịch chiết vào cột sắc ký lực MD, Tháo nắp đáy cột sắc ký, cho 10 mi dịch chiết pha loãng với nước cất vào sering trung gian, lắp bơm vào phần sering trung gian nắp cao su Bơm từ từ có ml/phút chảy qua cột Dưới đáy cột ln có cốc hứng ‹ Rửa "Tháo bơm khỏi sering trung gian, cho 10 mÌ nước cất vào sering trung gian, bơm từ từ rửa cột với tốc độ ml/phút Làm nhiều lần cảm thấy ccột sắc ký Giải hấp Tháo bơm Đặt đáy cột sắc ký tube thủy tỉnh nhỏ hay lọ nhỏ Cho 1ml methanol loại dùng cho sắc ký lồng cao áp vào sering trung gian, ding bom bom từ từ, với tốc độ gioUgiây thu dung dịch giải hấp tube thủy tính Dung dịch giải hấp dùng để định lượng aflatoxin sắc ký lỏng cao áp, hay Fluorimeter hay TLC Ngoài dung dịch giải hấp cho hấp phụ qua típ để bán định lượng nhanh UV, Cật sắc ký sử dụng tối da không ä lẫn Sau lẫn sử dụng cân cho 0,5mml đệm có chất bảo quân Cột sắc ký đệm bâo quân gia 4-8 C Thời hạn sử dụng khơng q năm! Phịng thí nghiệm hóa phân tích P/V công Nghệ Sau Thu Hoạch Tp HCM ir 19U12jA jw] iyo apn TWeQT tĐA trÿ{ £ tt Wyo spn —