LUẬN văn THẠC sĩ xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu bằng LC MS MS

TỔNG QUAN

Tổng quan về aflatoxin

Aflatoxin đƣợc phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1960 sau sự kiện Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây Những con gà tây này bị hoại tử gan sau khi đƣợc cho ăn lạc mốc và aflatoxin đƣợc xác định là nguyên nhân gây bệnh [15,25]

Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp đƣợc sản xuất bởi một vài loại vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus

Nấm mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trước và sau khi thu hoạch, khi bảo quản cũng nhƣ chế biến Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin nhƣ ngũ cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu như hạt đậu, hạt hướng dương, bông; các loại gia vị nhƣ ớt , hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng các sản phẩm từ sữa (bơ, pho mát ) [10,20]

Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tương tự nhau và đều là dẫn chất của difuranocoumarin, được tổng hợp nhờ con đường polyketide Ngày nay, người ta đã xác định được khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lƣợt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2

[27] Aflatoxin B1là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm Thông thường, nếu không có aflatoxin B 1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [10,14]

Aflatoxin hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ nhƣ cloroform, methanol, dimethyl sulfoxid Độ tan của aflatoxin trong nước vào khoảng 10–

20 mg/l Dung dịch aflatoxin trong dung môi cloroform hay benzen có thể đưuọc trong nhiều năm nếu bảo quản ở điều kiện lạnh và tối [3]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Ở nhiệt độ đun nấu thông thường không thể phân hủy được aflatoxin, nhưng dưới ánh sáng tử ngoại các aflatoxin bị phân hủy Trong công thức cấu tạo có vòng lacton nội phân tử, nên các aflatoxin dễ bị phân hủy bởi base mạnh và nếu tiếp tục acid hóa nhẹ thì aflatoxin ban đầu đƣợc tái tạo [3]

Các aflatoxin phát huỳnh quang rất mạnh, dựa vào tính chất này ta có thể phát hiện chúng ở nồng độ rất thấp (trên sắc ký đồ lớp mỏng có thể phát hiện với lƣợng chất khoảng 0,5ng hay nhỏ hơn) Đây chính là cơ sở hóa lý cho việc phát hiện và định lƣợng các hợp chất này [3]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bảng 1 1 Tính chất của một vài aflatoxin

STT Loại aflatoxin CTPT TLPT

(đvC) Tính chất CTCT TLTK

- Huỳnh quang màu xanh da trời

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 223; 265; 362 nm

- Huỳnh quang màu xanh da trời

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm

- Huỳnh quang màu xanh lá cây

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 243; 257; 264;

- Huỳnh quang màu xanh lá cây

- Hấp thụ UV cực đại trong môi trường ethanol: 265; 363 nm

- Huỳnh quang màu xanh tím

Các loài nấm mốc có thể sinh aflatoxin gồm các loài thuộc chi

Aspergillus, thuộc họ nấm cúc: A flavus, A arachidicola, A bombycis, A minisclerotigenes, A nomius, A ochraceoroseus, A parasiticus, A pseudotamarii, A rambellii, trong đó A flavus và A parasiticus là hai chủng nấm chủ yếu thường gặp sinh aflatoxin B 1 [12] Hầu hết các chủng nấm

Aspergillus sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 30-35 o C và độ ẩm không khí trên 55% trong khoảng pH rộng từ 3-10 trên những cơ chất giàu năng lƣợng dạng tinh bột [6] Tuy nhiên, sự có mặt của chủng nấm mốc sinh aflatoxin không đồng nghĩa với nhiễm aflatoxin do sự tổng hợp aflatoxin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý, hóa học và sinh học

 Điều kiện môi trường và cơ chất:

Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc và sự hình thành aflatoxin bao gồm: năng lượng (thường dưới dạng tinh bột), vitamin, acid béo, amino acid và chất khoáng, đặc biệt cần có mặt Kẽm (Zn) Vì thế, nhiễm độc aflatoxin thường có trong những sản phẩm nhiều tinh bột, các hạt có dầu nhƣ hạt bông, đậu nành tỷ lệ nhiễm ít hơn [14]

Nhiệt độ và độ ẩm cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành aflatoxin Nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho tổng hợp aflatoxin theo nghiên cứu lần lƣợt là 12 o C và

42 o C Nhiệt độ tối ƣu để hình thành aflatoxin là 25-35 o C, nhiệt độ tối ƣu để tổng hợp aflatoxin B1 là 24-28 o C Độ ẩm cần thiết cho tổng hợp aflatoxin của nấm mốc là trên 62%, hàm ẩm nông sản cho tổng hợp aflatoxin tối đa ở nông sản nhiều tinh bột là 18% và trong quả, hạt có dầu là 9-10% [10,14,21]

Như vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến sự nhiễm độc aflatoxin trong sản phẩm Các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có Việt nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mƣa nhiều phần lớn

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU thời gian trong năm, thường có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin nhiều hơn so với các nước ôn đới Các nước đang phát triển như ở khu vực Đông Nam Á, Châu Phi chƣa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và bảo quản chƣa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin trong các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dƣợc liệu nói riêng

1.1.4 Cơ chế gây bệnh của aflatoxin

Trong số các loại aflatoxin thì AFB 1 là loại độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực, thực phẩm

AFB1 đƣợc chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính aflatoxin exo- 8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành AFM1 ít độc tính hơn bởi cytochrome P450, một họ enzyme trong tế bào gan Sự epoxide hóa AFB 1 là một bước nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thƣ Aflatoxin exo-8,9-epoxide là một chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết ái lực cao với guanine base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine Aflatoxin-N7-guanine methyl hóa biến G thành T, gây đột biến gen và có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thƣ [13,19]

Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là dihydrodiol, gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng chức năng của acid nucleic và protein Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn ức chế enzyme RNA polymerase và ribosomal translocase, ảnh hưởng đến quá trình phiên mã và dịch mã [12]

Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ (LC- MS/MS)

(LC-MS/MS) 1.2.1 Sắc ký ái lực miễn dịch a) Sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực là một kỹ thuật sắc ký lỏng sử dụng một thuốc thử liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân tích các thành phần trong hỗn hợp Lưu giữ chất phân tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc của các cặp có trong cơ thể sống nhƣ: kháng nguyên – kháng thể, enzyme – cơ chất, hormone – receptor [1] Để thực hiện sắc ký ái lực người ta cố định một thành phần của cặp (phối tử - ái lực) trên một chất mang rắn làm pha tĩnh đƣa vào cột Mẫu phân tích có thành phần thứ hai đƣợc đƣa vào cột nhờ một pha động có pH xác định, lực ion và thành phần dung môi phù hợp gọi là dung dịch đệm rửa giải

Khi mẫu phân tích qua cột, các thành phần khác khuếch tán dễ dàng, chỉ có hai thành phần của cặp tương tác đặc hiệu và liên kết với nhau Nhờ một dung dịch đệm rửa giải, liên kết trên bị phá vỡ và thành phần chọn lọc với phối tử ái lực đi ra khỏi cột Phát hiện và định lƣợng bằng một detector thích hợp [1]

- Phối tử ái lực: là những chất có tính đặc hiệu cao với chất phân tích, quyết định thành công của kỹ thuật tách ái lực Phối tử ái lực có thể có nguồn gốc sinh học (kháng thể, protein ) hoặc nguồn gốc hóa học (boronat, phức càng cua kim loại )

- Chất mang: là những chất rắn đƣợc dùng để cố định phối lực ái tử trong cột sắc ký Một số chất mang thường dùng trong sắc ký ái lực là agarose và agarose liên kết, cellulose, silica b) Sắc ký ái lực miễn dịch

Sắc ký ái lực miễn dịch là một loại hình sắc ký ái lực sử dụng phối tử ái lực là kháng thể hoặc kháng nguyên Do tính đặc hiệu cao của tương tác kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU thuật sắc ký ái lực miễn dịch trở thành một công cụ phổ biến và quan trọng trong phân tích các chất có nguồn gốc sinh học [1]

Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch còn đƣợc ứng dụng để tinh chế và làm giàu chất phân tích trong cột chiết pha rắn (SPE) với nhiều ƣu điểm [25]:

- Sử dụng ít dung môi

- Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích

- Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn

Nhƣợc điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng đƣợc một lần (kháng thể bị biến tính) [25]

1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ a) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thời gian chất phân tích đƣợc rửa giải đƣợc ghi lại nhờ detector gọi là thời gian lưu Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [1]

Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là các hạt hình cầu có đường kính 1,5–10 ϻm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực (các silica có chứa nhóm alkyl ít cacbon mang nhóm chức phân cực –CN, -NH2 )

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh không phân cực (các silica gắn mạch cacbon dài C18, C8 )

Pha động trong HPLC là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi ít phân cực nhƣ hexan, iso propyl ether , ngƣợc lại trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực như nước, methanol, acetonitril

Có hai cách dùng pha động để rửa giải [1]:

- Đẳng dòng: các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy sắc ký

- Gradient: tỷ lệ các thành phần dung môi pha động thay đổi trong quá trình chạy sắc ký Chế độ này phù hợp với mẫu phân tích nhiều thành phần với khả năng phân cực khác nhau, tăng khả năng rửa giải, rút ngắn thời gian phân tích b) Khối phổ (MS)

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lƣợng và điện tích của ion (m/z) đƣợc tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion đƣợc tạo thành trong buồng ion hóa, đƣợc gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lƣợng các chất [1]

Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu:

Hình 1.1 Sơ đồ khối của máy khối phổ

- Bộ nạp mẫu: là bộ phận đƣa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi bằng cách thích hợp Bộ nạp mẫu có thể phân thành hai nhóm chính là nhóm nạp mẫu trực tiếp và nhóm nạp mẫu gián tiếp Trong nạp mẫu gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu ra của một thiết bọ phân tích khác đƣợc kết nối với khối phổ nhƣ sắc ký khí (GC/MS), sắc ký lỏng (LC/MS), điện di mao quản (CE/MS)

- Bộ nguồn ion: trong máy khối phổ, có nhiều cách để ion hóa phân tử và nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi Một số kỹ thuật thường dùng nhƣ ion hóa bằng va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng tia điện, ion hóa bằng giải hấp Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hóa bằng tia điện ESI

Đối tƣợng nghiên cứu

Nền mẫu giàu tinh bột có nguy cơ nhiễm aflatoxin cao nên chúng tôi lựa chọn dƣợc liệu giàu tinh bột nhƣ Cát căn, Trạch tả, Hoài sơn, để xây dựng quy trình định lƣợng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) trong dược liệu Các mẫu được thu mua trên thị trường Hà Nội

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu thu mua

STT Tên dƣợc liệu Địa điểm lấy mẫu STT Tên dƣợc liệu Địa điểm lấy mẫu

Phố Lãn Ông 11 Trạch tả 3 Chợ Ninh

Phố Lãn Ông 15 Ý dĩ 3 Chợ Ninh

Phố Lãn Ông 19 Hoài sơn 3 Chợ Ninh

Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

Chuẩn Aflatoxin (Supelco, USA): AFB1 (Lot: LB04859); AFB2 (Lot:

LB04871); AFG1 ( Lot: LB02201); AFG2 (Lot: LB04861) dạng lỏng có nồng độ 1 ppm

- Các dung môi dùng cho LCMS: methanol, acetonitril của hãng Merck

- Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu methanol, ethanol mua của Trung Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích P.A

- Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorid (Merck, Đức)

- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hóa

- Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ 2 lần LC-MS/MS 8045 của Shimadzu

- Cột sắc ký Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) của Shimadzu

- Máy lắc ngang HS 260 (IKA, Đức)

- Cột chiết pha rắn Aflatest chứa kháng thể đơn dòng (VICAM, Mỹ)

- Bộ dụng cụ chiết pha rắn Visiprep TM 24 (Supelco, Mỹ)

- Cân phân tích Mettle Toledo có độ chính xác 0,1mg (Mettle Toledo, Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g (Precisa Gravimetry, Thụy Sĩ)

- Pipet chính xác có thể điều chỉnh thể tích 10-100ϻL và 100-1000ϻL

- Ống ly tâm nhựa 50 mL

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu Cát căn, Trạch tả, hạt Sen để tiến hành nghiên cứu

- Thái mẫu, sấy mẫu dƣợc liệu ở nhiệt độ 50 o C đến khi độ ẩm đạt khoảng 5%

- Bảo quản trong túi kín cho tới khi đƣa vào nghiên cứu chiết xuất

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng aflatoxin trong dược liệu

Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích:

- Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ (MS)

- Tối ƣu hóa điều kiện sắc ký lỏng

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu đƣợc hàm lƣợng aflatoxin là lớn nhất

- Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC

2.3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột trên thị trường Hà Nội Áp dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá mức độc ô nhiễm aflatoxin trên các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường Hà Nội.

Phương pháp nghiên cứu

- Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2018 – 20/04/2019

- Địa điểm lấy mẫu: chợ Ninh Hiệp, phố Lãn Ông

- Khối lƣợng mẫu: 0,5 kg/mẫu

- Dƣợc liệu đƣợc xay nhỏ, đựng trong túi nilon

- Bảo quản ở nơi thoáng mát

2.4.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí

- Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ (MS): Lựa chọn ion mẹ, ion con, các thế Q1, Q2, Q3 thích hợp để thu đƣợc tín hiệu phân tích cao nhất

- Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng: Thành phần pha động, chương trình gradient

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và làm sạch mẫu với mục đích thu đƣợc hàm lƣợng aflatoxin là lớn nhất: Khảo sát thành phần dung môi chiết, dung môi loại tạp

2.4.3 Quy trình thẩm định phương pháp 2.4.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc

Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác nhƣ: các tiền chất, các chất chuyển hóa, tạp chất

Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung quy trình

- Xác định: Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ

Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất

2.4.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lƣợng nhỏ nhất có thể đƣợc phát hiện với mức tin cậy xác định

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

- Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

LOQ đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ các chất phân tích

- Xác định: Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

2.4.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và đƣợc biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

- xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i

- ̅ : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm

- N: Số lần thử nghiệm Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết

- C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL)

- Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm LCSolution) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát điều kiện khối phổ

Kỹ thuật FIA (Flow injection analysis) là một kỹ thuật phân tích sử dụng trong HPLC mà không sử dụng cột sắc ký Ứng dụng trong khảo sát phổ khối, dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb đƣợc tiến hành tiêm vào hệ thống khối phổ với các điều kiện nhƣ sau:

+ Pha tĩnh: không lắp cột

+ Pha động: ACN: amoni acetat 10 mM (50:50, v/v) + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

+ Interface Voltage: -5kV đối với ESI-positive Kết quả thu đƣợc khi quan sát ở chế độ ESI-positive, thấy có mảnh ion mẹ [M+H] + của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có giá trị m/z tương ứng là 313,20; 315,20; 329,15 và 331,15 Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố trước đây

Hình 3.1 Phổ khối của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 quan sát dưới chế độ

ESI-positive Sau đó tiếp tục áp dụng kỹ thuật FIA để tiến hành tối ƣu hóa điều kiện

MS/MS tự động Tiến hành tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ mỗi chất 100 ppb, cài đặt thông số máy để tiến hành tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh 2 ion con đối với mỗi chất

Kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Thông số MS tối ƣu

TT Độc tố Ion mẹ

Hình 3.2 Phổ khối của ion con các aflatoxin

Nhận xét: Trong định lượng bằng phương pháp MRM, ion con có tín hiệu cao hơn thường được lựa chọn để định lượng hàm lượng của chất phân tích, còn ion con có tín hiệu thấp hơn đƣợc lựa chọn để xác nhận sự có mặt của chất phân tích đó Kết quả tối ƣu hóa thu đƣợc cho thấy, các ion con 241,05; 286,95; 243,10 và 313,00 được lựa chọn để định lượng tương ứng AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 Còn các ion con 284,95; 259,20; 311,05 và 245,00 được lựa chọn để định tính tương ứng các độc tố này.

Khảo sát điều kiện sắc ký

Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường sử dụng cột C18 để phân tích các độc tố aflatoxin Đây cũng là loại pha tĩnh đƣợc sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm Các cột pha tĩnh nhồi các hạt có kớch thước nhỏ (1,7 àm, 1,9 àm …) và chiều dài cột ngắn cho hiệu lực tỏch cao cũng nhƣ giảm thời gian phân tích Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm,

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chỳng tụi lựa chọn cột Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) của Shimadzu để tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác

Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid formic, amoni acetat Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường lựa chọn amoni acetat để tiến hành phân tích các aflatoxin

- Các điều kiện sắc ký đƣợc giữ cố định nhƣ sau:

+ Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

- Điều kiện khối phổ: Nhƣ mục 3.1 Chế độ quan sát MRM Chúng tôi dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 nồng độ mỗi chất10 ppb để tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động với 2 chương trình gradient nhƣ sau

Bảng 3.2 Một số chương trình gradient khảo sát

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Hình 3 3 Sắc ký đồ chương trình gradient 1

Hình 3 4 Sắc ký đồ chương trình gradient 2

Nhận xét : Với chương trình gradient 1, píc bị chẻ píc và kéo đuối Với chương trình gradient 2, píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 tương đối

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU gọn, cân xứng và giảm hiện tượng chẻ píc Vì vậy chúng tôi lựa chọn chương trình gradient 2 để tiến hành các khảo sát tiếp theo

Bảng 3 3 Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient 2

Thông số AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

Hệ số đối xứng (A s) 1,077 1,121 1,082 1,203 t R (phút) 3,130 3,038 3,040 2,940

Nhƣ vậy, chúng tôi đã khảo sát đƣợc điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ nhƣ sau: Điều kiện khối phổ:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Điều kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: Shimpack C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 àm) + Pha động: Kênh A: ACN; Kênh B: amoni acetat 10 mM + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Trong các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường sử dụng hỗn hợp methanol : nước với tỷ lệ 80 : 20 hoặc 75 : 25 để tiến hành phân tích các aflatoxin Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi chiết mẫu khác nhau nhằm tìm ra điều kiện phụ hợp với phòng thí nghiệm

Quy trình xử lý mẫu nhƣ sau: Cân chính xác khoảng 25 g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 250 ml Thêm khoảng 5 g NaCl Thêm chính xác 100 ml dung môi chiết methanol : nước (với 2 tỷ lệ khảo sát là 80 : 20 và 60 : 40)

Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút Lọc lấy dịch lọc Lấy chính xác 10 ml dịch lọc, pha loãng với 40 ml nước Ly tâm, lấy dịch lọc Lấy chính xác 10 ml dịch lọc mẫu bên trên Cho qua cột SPE-IM với tốc độ 1 ml/phút Rửa tạp bằng 20 ml dung dịch đệm PBS Rửa giải bằng 1 ml methanol Lọc qua màng lọc 0,22 àm thu đƣợc dung dịch sắc ký

Cả 2 khảo sát đều đƣợc tiến hành thêm chuẩn hỗn hợp AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ khoảng 5 ppb Kết quả được đánh giá trên hiệu suất thu hổi so với dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi khác nhau

TT Độc tố Dung môi chiết

Nhận xét: Khi tiến hành thay đổi dung môi chiết, hiệu suất thu hồi của

AFB1 thay đổi không đáng kể, trong khi AFB2, AFG1 và AFG2 có hiệu suất thu hồi cao hơn khi sử dụng dung môi chiết là MeOH : nước (80 : 20) Vì vậy để hiệu suất thu hồi đạt cao nhất chúng tôi lựa chọn dung môi MeOH : nước

(80 : 20) để tiến hành các khảo sát tiếp theo

3.3.2 Khảo sát dung môi làm sạch

Khi tiến hành làm sạch dịch chiết bằng cột ái lực miễn dịch SPE-IM, dung môi làm sạch có vai trò quan trọng đối với hiệu suất thu hồi của các chất phân tích Chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi làm sạch nhƣ dung dịch đệm PBS, dung môi MeOH : H2O (5 : 95) và MeOH (10 : 95) Tiến hành xử lý mẫu như mục 3.3.1, dịch lọc trước khi làm sạch bằng cột SPE-IM được tiến hành thêm chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 sao cho dịch chạy sắc ký có nồng độ khoảng 5 ppb Kết quả thu đƣợc đánh giá trên hiệu suất thu hồi của chất phân tích so với dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng Kết quả được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi của các aflatoxin với các dung môi làm sạch

TT Độc tố Dung môi làm sạch

Nhận xét: Kết quả thu đƣợc cho thấy, khi sử dụng dung môi làm sạch là MeOH : H2O với tỷ lệ MeOH tăng dần thì hiệu suất thu hồi giảm đi Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung dịch PBS làm dung môi làm sạch.

Thẩm định phương pháp

Để xác định tính chọn lọc đối với sắc kí khối phổ, chúng tôi sử dụng phương pháp xác nhận Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-

MS/MS) là 4 Tức là cần có 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con

Bảng 3.6 Ion mẹ và ion con của aflatoxin

[M+H] + Ion con Vai trò Số điểm IP

Như vậy phương pháp có tính đặc hiệu đáp ứng yêu cầu Để xác định chắc chắn phương pháp có tính đặc hiệu cao, chúng tôi đã tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn Kết quả cho thấy mẫu trắng không cho các mảnh m/z của chất phân tích Trên sắc đồ mẫu thử xuất hiện các píc của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có thời gian lưu trùng khớp với thời gian lưu trên mẫu chuẩn Như vậy, phương pháp có tính đặc hiệu cao

A Mẫu thử thêm chuẩn B Mẫu chuẩn

Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 3.4.2 Tính phù hợp hệ thống Để xác định tính phù hợp hệ thống của phương pháp, chúng tôi tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch hỗn hợp chuẩn AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 có nồng độ là 5 ppb với điều kiện đã khảo sát Tiến hành ghi lại thời gian lưu và diện tích píc tương ứng Kết quả thu được như Bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 t R (phút)

Nhận xét: Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc và thời gian lưu của các aflatoxin đều nhỏ hơn 5,0%, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống LC-MS/MS sử dụng là phù hợp và đảm bảo độ ổn định của phép phân tích định lƣợng aflatoxin

3.4.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến tính và đường chuẩn Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn aflatoxin với khoảng nồng độ từ 0,1 – 10 ppb

Tiến hành sắc ký với điều kiện đã khảo sát Ghi lại tín hiệu píc và tiến hành xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích píc và nồng độ aflatoxin trình bày trong Bảng 3.8

Bảng 3.8 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của các chất

Hình 3.6 Đường chuẩn của các độc tố aflatoxin Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R 2 Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong Bảng 3 cho thấy R 2 lớn hơn 0,99 cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lƣợng các aflatoxin

3.4.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) Để đánh giá LOD và LOQ của phương pháp, chúng tôi thêm chuẩn vào mẫu thử không chứa chất phân tích sao cho mức nồng độ cuối cùng ở mức 5 ppb Sau đó tiến hành pha loãng trên nền mẫu thực không chứa chất phân tích và phân tích đến khi thu đƣợc chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền Từ đó xác định LOD và LOQ Kết quả thu được như Bảng 3.9 y = 18795x + 1434.6 R² = 0.9949

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFB1 y = 8891.2x + 4015.3 R² = 0.9967

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn AFB2 y = 18475x + 63.89 R² = 0.9989

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFG1 y = 11779x - 3717.8 R² = 0.9956

Nồng độ (ppb) Đường chuẩn của AFG2

Bảng 3.9 Kết quả xác định LOD và LOQ của phương pháp

3.4.5 Độ lặp lại và độ thu hôi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau 50, 100,

150 ng/mL (tương ứng 500, 1000, 1500 àg/kg trờn mẫu), phõn tớch lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ Các kết quả tính độ lệch chuẩn tương đối và độ thu hồi đƣợc trình bày trong bảng 3.12

Bảng 3.10 Độ lặp lại và độ thu hồi của aflatoxin trên nền mẫu dƣợc liệu

Mẫu Nồng độ (ppb) Độ thu hồi (%)

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

2,5 àg/kg tương ứng 1,25 ppb

TT-1 1,21 1,12 1,33 1,26 96,8 89,6 106,4 100,8 TT-2 1,20 1,41 1,35 1,35 96,0 112,8 108,0 108,0 TT-3 1,19 1,02 1,05 1,37 95,2 81,6 84,0 109,6 TT-4 1,35 1,11 1,43 1,09 108,0 88,8 114,4 87,2 TT-5 1,09 1,09 1,11 1,13 87,2 87,2 88,8 90,4 TT-6 1,42 1,31 1,34 1,39 113,6 104,8 107,2 111,2

5 àg/kg tương ứng 2,5 ppb

TT-1 2,32 2,43 2,47 2,33 92,8 97,2 98,8 93,2 TT-2 2,46 2,16 2,59 2,34 98,4 86,4 103,6 93,6 TT-3 2,39 2,33 2,23 2,17 95,6 93,2 89,2 86,8 TT-4 2,22 2,37 2,34 2,29 88,8 94,8 93,6 91,6 TT-5 2,09 2,19 2,21 2,47 83,6 87,6 88,4 98,8 TT-6 2,04 2,12 2,25 2,52 81,6 84,8 90,0 100,8

7,5 àg/kg tương ứng 3,75 ppb

TT-1 3,71 3,65 3,47 3,44 98,9 97,3 92,5 91,7 TT-2 3,55 3,45 3,79 3,67 94,7 92,0 101,1 97,9 TT-3 3,35 3,49 3,55 3,73 89,3 93,1 94,7 99,5 TT-4 3,79 3,67 3,89 3,53 101,1 97,9 103,7 94,1 TT-5 3,42 3,51 3,65 3,69 91,2 93,6 97,3 98,4 TT-6 3,84 3,93 3,74 3,45 102,4 104,8 99,7 92,0

Nhận xét: Theo quy định của AOAC, phần trăm tìm lại tại khoảng nồng độ 1 – 5 àg/Kg đạt trong khoảng 40 – 120% và RSD(%) ≤ 30 [3] Kết quả thu đƣợc có độ đúng từ 81,6 - 113,6% và RSD(%) từ 3,56 - 11,61%

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt khi phân tích các aflatoxin trong dƣợc liệu

3.5 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng aflatoxin trong dược liệu Áp dụng phương pháp đã xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng aflatoxin trong các mẫu dược liệu giàu tinh bột thu mua trên thị trường Hà Nội Mỗi mẫu đƣợc tiến hành lặp lại 3 lần độc lập Kết quả nhƣ Bảng 3.11

Bảng 3.11 Kết quả hàm lƣợng aflatoxin trên các mẫu dƣợc liệu giàu tinh bột

STT Tên dƣợc liệu Địa điểm lấy mẫu

17 Hoài sơn 1 Phố Lãn Ông (-) (-) (-) (-)

*Ghi chú: (-) : Không phát hiện chất phân tích

Nhận xét: Kết quả thu đƣợc cho thấy hầu hết các mẫu dƣợc liệu thu mua trên địa bạn Hà Nội đều không phát hiện aflatoxin Mẫu YD4 đƣợc thu mua tại chợ Ninh Hiệp có phát hiện AFB1 và AFG1 hàm lƣợng lần lƣợt là 0,37 và 0,60 àg/kg

Nhƣ vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng các aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2) trong dƣợc liệu với quy trình phân tích nhƣ sau:

Dung dịch thử : Cân chính xác khoảng 25 g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 250 ml Thêm khoảng 5 g NaCl Thêm chính xác 100 ml dung môi chiết methanol : nước tỷ lệ 80 : 20 Lắc ngang trên máy lắc ngang 30 phút

Tiêu đề	Xây dựng Phương pháp Định lượng Aflatoxin trong Dược liệu bằng LC-MS/MS
Tác giả	Hà Anh Tuấn
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Phương, TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	74
Dung lượng	2,01 MB