TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.)
Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., thuộc họ
Alismataceae, chi Alisma, có tên khoa học đồng nghĩa khác là Alisma plantago – aquatica Ở Việt Nam, Trạch tả còn được gọi là thủy đề, mã đề nước [4]
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây thảo, cao 40-50 cm Thân rễ hình cầu hoặc hình con quay, nạc, màu trắng, lá có cuống dài, bẹ to mọc ốp vào nhau, xòe ra như hình hoa thị, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, mép nguyên lượn sóng, gân lá 5-7 hình cung
Cụm hoa mọc trên một cán thẳng dài có khi đến 1m thành chùy có nhiều vòng hoa xếp thành tầng nhỏ dần về phía ngọn, mỗi tầng phân nhánh thành những chùy nhỏ; hoa lưỡng tính, màu trắng hay hồng, đài có 3 răng màu lục, tồn tại đến khi thành quả; tràng hoa 3 cánh có 1 cựa màu vàng nhạt rất mỏng và rụng sớm; nhị 6 – 9, dẹt, bầu nhiều ô xếp thành một vòng, mỗi ô có một noãn, vòi nhụy mảnh dễ rụng
Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại
Chi Alisma L có khoảng 10 loài, phân bố rải rác từ vùng nhiệt đới đến vùng cận nhiệt đới và ôn đới ẩm Trạch tả có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam Hiện đã biết có hai loài được dùng làm thuốc là Trạch tả (A plantago – aquatica L.) và loài A canaliculatum Ở Việt Nam, Trạch tả chỉ thấy trồng ở các tỉnh như Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương, Hưng Yên [4]
Dược liệu Trạch tả là thân rễ của cây Trạch tả: Thân rễ thu hoạch vào tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng Loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngoài và rửa sạch, phơi hay sấy khô
Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hòa trong 60 ml nước), sao vàng [4]
Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56]
1.1.4 Thành phần hóa học Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa học ở thân rễ
Theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây, các terpenoid được coi là thành phần chính trong Trạch tả [17] Với hợp chất đặc trưng là triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane (alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat) Ngoài ra, Trạch tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine, phytosterol, acid béo và nhựa Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học trong thân rễ Trạch tả còn ít Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester, AA, AA
Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học trong rễ Trạch tả Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu trúc
Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol
A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả
[30] Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6) được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31] Alisol O (7) và alisol P
(8) được phân lập năm 2008 [53] Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18]
(1) AA OH OH OH OH H O
(2) alisol A 24 – acetat OH OH OH OH O O
(5) alisol E OH OH OH OH H O
Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định Năm
1994, kaurane-2,12-dione (10) được phân lập từ thân rễ Trạch tả bởi
Nakajima và cộng sự [32] Sau đó, Peng và cộng sự phân lập được hai diterpenoid mới là oriediterpenol (11) và oriediterpenoside (12) từ thân rễ
(12) oriediterpenoside Hình 1.4 Công thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả 1.1.4.3 Các sequiterpenoid
Có khoảng 36 sequiterpenoid đã được xác định, chia thành 4 nhóm: guaiane, germaraerane, eudesmane và oplopanane
Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33]
Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D (16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B
(18), C, D) [45] [46] Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol
(20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32] Năm 2001, orientalol E (21) thuộc nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34]
(14) Alismoxide CH3 OH OH CH3
(17) Orientalol A OH OH OH CH3
(18) Sulfoorientalol B HSO3 OH OH CH3
(19) 10-O-methyl-alismoxit OCH3 OH OH OCH3
(20) eudesma-4(14)-en-1,6-diol (21) orientalol E Hình 1 5 Công thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả
Có khoảng 9 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trạch tả: robustaflavon, amentoflavon, 2,20,4 – trihydroxylchalcone, daidzein, calycosin, 7 – hydroxyl – coumarin, apigene, luteolin, emodin [15,24]
Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn chất polysaccharides [39] Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là alisman PII và alisman SI [37,40]
Ngoài ra, trong Trạch tả còn xác định được một số chất khác như:
1.1.5 Một số tác dụng dƣợc lý
Trạch tả đã được sử dụng lâu đời trong Y học cổ truyền Trung Hoa với mục đích điều trị thiểu niệu Nghiên cứu trên chuột cho thấy dịch chiết EtOH Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg làm tăng đáng kể lượng nước tiểu nhưng thấp hơn hydroclothiazid [40,41] Nghiên cứu trên chuột Sprague- Dawley cho thấy dịch chiết ethanol Trạch tả có tác dụng lợi tiểu ở liều thấp (2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg) nhưng ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg) lại làm giảm đáng kể lượng nước tiểu [9]
Tương tự, khi khảo sát với các dịch chiết khác, cho thấy: Dịch chiết n- butanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) làm tăng lượng nước tiểu Dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800 mg/kg) làm giảm lượng nước tiểu [7] Điều đó cho thấy tác động sinh học trên thận của các dịch chiết Trạch tả ở các hàm lượng khác nhau là khác nhau, nên liều lượng sử dụng cần được chú ý nhiều hơn trong các ứng dụng lâm sàng
Gần đây, nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2017) nhằm đánh giá tính tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu Kết quả cho thấy tỷ lệ thành phần thích hợp nhất trong hoạt động lợi tiểu là: AB23 : alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate (7.2: 0.6: 2.8: 3.0:
Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley cho thấy tác dụng hạ lipid máu khi dùng alisol A 24-acetat liều 425 mg/kg [16] Nghiên cứu gần đây trên chuột tăng lipid máu cho thấy Trạch tả liều 2,26 g/kg/ngày làm giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, nhưng làm tăng nồng độ HDL huyết thanh Từ đó, người ta cho rằng Trạch tả làm giảm sự tổng hợp cholesterol ở gan thay vì làm tăng quá trình chuyển hóa cholesterol [10]
Một nghiên cứu khác trên chuột gây đột biến gen apoE và làm tăng sự biểu hiện heparan sulfate proteoglycan ở gan cho thấy Trạch tả và simvastatin ở liều 10 lần so với liều sử dụng trên người có ý nghĩa điều trị với chứng xơ vữa động mạch, khi làm giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL [35]
Nhìn chung, Trạch tả có thể làm giảm cholesterol trên chuột để dự phòng tăng lipid máu Tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế để ứng dụng trong điều trị lâm sàng
Từ lâu đời, Trạch tả đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị tiểu đường Nghiên cứu cho thấy các triterpenes loại protostane có hoạt tính hạ đường huyết thông qua cơ chế ức chế hoạt động α- glucosidase và thúc đẩy sự hấp thu glucose, mà không làm tăng adipogenesis như thiazolidinediones [23] Tuy nhiên, các thử nghiệm mới được thực hiện trên in vitro và cần được nghiên cứu sâu hơn trên cơ thể người để ứng dụng trong lâm sàng
Ức chế hình thành sỏi thận
Tác dụng ức chế sự hình thành sỏi thận đã được chứng minh bằng các nghiên cứu dược lý hiện đại trên chuột Nghiên cứu cho thấy khi cho một nhóm chuột được điều trị trong 4 tuần với 0,5 mL/kg triterpenoids thì hàm lượng canxi trong mô thận, lượng canxi bài tiết trong nước tiểu 24h, creatinin huyết thanh và nồng độ ure trong máu giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng [6,29] Nghiên cứu bởi Cao và cộng sự cũng cho thấy, khi sử dụng 1 mL/ngày các thành phần có hoạt tính của Trạch tả trong 28 ngày có thể làm giảm sự hình thành canxi oxalate ở thận [5]
Tác động của Trạch tả trên hệ miễn dịch đã được đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol Trạch tả liều 50 mg/kg, 200 mg/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus Những kết quả chỉ ra rằng dịch chiết Trạch tả có ảnh hưởng trên các phản ứng dị ứng khác nhau, đặc biệt là dị ứng loại III [20]
Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat
1.2.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của AA
Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy – methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a] phenathren – 3 – one
Tên thông thường: alisol A Tính chất: - Dạng bột, màu trắng, không mùi, nóng chảy ở 90 - 91 0 C
- Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol
Nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh rằng những thay đổi đơn giản trong cấu trúc gốc AA có thể tạo ra một số dẫn xuất tiềm năng chống lại HBV 40 dẫn xuất của AA được tổng hợp và khảo sát trong ảnh hưởng chống virus viêm gan B in vitro Và thu được 14 chất tiềm năng [50] Hợp chất 6a cho hoạt tính cao chống lại sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt (IC500,024 mM), kháng nguyên HBV e (IC50=0,028 mM) (SIHBsAg >108, SIHBeAg > 93) [49]
Thử nghiệm khác trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các hợp chất A1, A23, A24 có hoạt tính cao chống lại sự tiết kháng nguyên bề mặt HBV với giá trị IC50 tương ứng là 0,0048, 0,0044, 0,014 mM, kháng nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng 0,011, 0,012, 0,018 mM; SIHBsAg
> 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200, SIHBeAg > 156 Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F@,9%) [51]
Nghiên cứu gần đây bởi Ma và cộng sự (2016) cho thấy AA có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng Gram dương Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus với giá trị MIC là 12,5-100mg/mL [25]
Nghiên cứu đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 cho thấy AA hàm lượng 0,05mmol/kg, 0,2mmol/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có hiện tượng arthus [20]
1.2.2 Tổng quan về alisol B 23 – acetat
1.2.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của AB23
Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3- [(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo-
1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl] acetate
Tên thông thường: alisol B 23 - acetat
1.2.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý
Nghiên cứu bởi Chen và cộng sự cho thấy trên những bệnh nhân thận mãn tính có sự kích hoạt các trục RAS/Wnt/ -catein dẫn đến tổn thương các tế bào biểu mô ống thận, đã được cải thiện khi sử dụng AB23 [8]
Năm 2017, một nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá tác động bảo vệ của AB23 với bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) ở chuột
NASH được gây ra bằng cách cho chuột ăn chế độ thiếu methionine và choline trong 4 tuần Sau đó mẫu máu và gan được thu thập Kết quả chỉ ra khi điều trị với AB23 làm giảm đáng kể sự tích lũy triglycerid ở gan, từ đó làm giảm nguy cơ viêm, xơ gan [28]
Một nghiên cứu khác chứng minh tác dụng bảo vệ của AB23 chống lại độc tính gan và ứ mật gây ra bởi 17α-ethinylestradiol (EE) AB23 làm giảm tổng hợp acid mật thông qua việc ức chế biểu hiện gen Cyp7a1 và Cyp8b1, làm tăng chuyển hóa acid mật qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1 [26]
AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17]
Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng
Năm 2016, Zhang và cộng sự đã tiến hành xét nghiệm MTT cùng với việc phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng tồn tại của tế bào ung thư buồng trứng sau khi điều trị với AB23 Kết quả cho thấy AB23 ức chế đáng kể biểu hiện của cả ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, giảm mức độ biểu hiện của các protein CDK4, CDK6 và cyclin D, ngăn chặn chu trình tế bào ở pha G1 AB23 ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của các tế bào ung thư buồng trứng [48]
Ngoài ra, AB23 còn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21], ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian P- glycoprotein [41]…
Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA và AB23 trong Trạch tả
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng AA và AB23 trong
TLTK Đối tƣợng phân tích Điều kiện phân tích
[55] AA, alisol A 24- acetate và AB23
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (65:35)
+ Bước sóng phát hiện: 210 nm và 254 nm + Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
+ Nhiệt độ cột: 35 O C + Thể tớch tiờm mẫu: 10àL
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C 18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (65:35)
+ Bước sóng phát hiện: 208 nm + Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút + Nhiệt độ cột: 25 O C
[22] AB23 - Dung môi chiết: ACN
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: C 18 (4,6 ì 250mm; 5àm ) + Pha động: ACN:W (75:25)
+ Bước sóng phát hiện: 215 nm
1.3.2 Các nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về định tính, định lượng các hoạt chất chính trong dược liệu Trạch tả còn rất ít
Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006) với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập và xác định được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester,
AA, AA 24 – acetat và alisol G [2]
1.3.3 Tiêu chuẩn về dƣợc liệu Trạch tả trong một số Dƣợc điển
Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đưa chuyên luận dược liệu Trạch tả vào quy định trong Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam…
Dược điển Trung Quốc (2015) quy định sử dụng HPLC để định lượng
AB23 trong thân rễ Trạch tả Quy trình xử lý mẫu như sau: 0,5 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 25 ml ACN trong 30 phút Hệ dung môi pha động sử dụng là ACN:W (73:27, v/v), detector UV ở bước sóng 208nm, cột C18
Dược điển Trung Quốc quy định, mẫu thử phải có chứa ít nhất 0,050% AB23 tính theo mẫu khô kiệt [9]
Dược điển Hồng Kông cũng sử dụng HPLC để định lượng alisol B monoacetate: 1 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 20 mL MeOH trong
30 phút Detector UV ở bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút Pha động được lựa chọn là ACN:W với chương trình rửa giải:
Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông
Dược điển Hồng Kông cũng quy định, mẫu phải có chứa ít nhất 0,082% alisol B monoacetat [38]
Trong chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV), chưa có quy định về chỉ tiêu định lượng hoạt chất chính, chỉ có các quy định về các tiêu chí thông thường: độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid Vì vậy, chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV) chưa đánh giá chính xác được chất lượng dược liệu Trạch tả Việt Nam cũng như mẫu nhập khẩu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Trạch tả được thu hái tại Ninh Bình và lưu trữ tại Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng 3/2018 Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành thu thập các mẫu dược liệu Trạch tả tại một số cơ sở trên thị trường Hà Nội để tiến hành áp dụng phương pháp đã xây dựng
Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại Viện Dược liệu
Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu
1 M1 Vũ Thị Bình 30 Lãn Ông
2 M2 Nguyễn Thị Ban 32 Lãn Ông
3 M3 Nguyễn Thị Sáu 54 Lãn Ông
5 M5 Phan Thị Tý 63A Lãn Ông
2.1.2 Hóa chất và dung môi
Chất chuẩn AA do hãng Biopurify Phytochemicals Ltd cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%
Chất chuẩn AB23 do hãng Sigma – Aldrich cung cấp, độ tinh khiết đạt 98%
Các dung môi hóa chất dùng cho phân tích HPLC đều đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết của hãng Merck
Các dung môi hóa chất dùng cho xử lý mẫu đều đạt chuẩn tinh khiết phân tích
2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Cân phân tích (Sartorius, BP-221S)
Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)
Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45) Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15- LC)
Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5)
Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu): Bơm LC- 20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL- 20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A Shimadzu
Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng
- Khảo sát hệ dung môi pha động
2.2.2 Định lƣợng AA bằng HPLC
2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng
+ Dung môi chiết + Tỷ lệ dung môi chiết
2.2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp
- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
- Tính thích hợp hệ thống
2.2.3 Phân tích mẫu thực Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính AA và AB23; định lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng
Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với
30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng [38]
- Cân khoảng 1 mg chuẩn AA, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH
- Cân khoảng 1 mg chuẩn AB23, hòa tan trong khoảng 2 ml
- Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254
- Pha động: Để tìm được hệ dung môi phù hợp, cho các vết tách biệt nhau trên bản
Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)
Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)
Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1) + Định tính AB23:
Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)
Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)
Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)
- Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol
2.3.2 Định lƣợng AA bằng HPLC 2.3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử:
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu Trạch tả cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm chính xác khoảng 25 ml EtOH Đem siêu âm trong 30 phút Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm
Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc AA bằng cách cân chính xác khoảng 5 mg chuẩn AA, hòa tan trong chính xác khoảng 5 ml MeOH được dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn trung gian có khoảng nồng độ thích hợp
2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải với pha động gồm ACN (kênh A) phối hợp với H2O (kênh B) theo các tỷ lệ khác nhau
Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR) của AA, độ phân giải (RS) và hệ số kéo đuôi của pic (AS) RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau
2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
- Khảo sát dung môi chiết: Khảo sát các dung môi chiết là EtOH, hỗn hợp MeOH : H O với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi
- Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết: Từ dung môi chiết phù hợp, tiến hành chiết với các thể tích dung môi khác nhau để lựa chọn được thể tích chiết tối ưu
- Khảo sát thời gian chiết: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút, 90 phút
2.3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Tính chọn lọc: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn và mẫu phân tích thêm chuẩn Pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn với các pic tạp
Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng với chương trình đã lựa chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic
Thời gian lưu AA của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng phải tương đương nhau Pic AA trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu, có ý nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3
Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 - 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10
Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích
Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R 2 Theo đó 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
Tính thích hợp hệ thống:
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích Yêu cầu các giá trị thời gian lưu, diện tích pic của AA có RSD ≤ 2%
THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Định tính AA và AB23 bằng TLC
Chuẩn bị mẫu: mẫu thử và mẫu đối chiếu được chuẩn bị như mục
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 5 àl dung dịch thử, dung dịch đối chiếu Sau khi triển khai, để khô bản mỏng ngoài không khí rồi phun dung dịch thuốc thử, sấy bản mỏng ở 105 o C trong vòng 5 phút
Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử
Khảo sát hệ dung môi pha động:
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:
Hệ dung môi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)
Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)
Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)
Kết quả: Sắc ký đồ định tính AB23 trong Trạch tả được trình bày như hình 3.1
Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366
Quan sát dưới ánh sáng thường
Nhận xét: Kết quả định tính TLC cho thấy với 3 hệ dung môi khảo sát chất AB23 cho vết có giá trị R f nằm trong khoảng 0,16 – 0,6 Tuy nhiên không thấy vết AB23 tương ứng (cùng giá trị Rf và cùng mầu sắc với vết AB23 chuẩn) xuất hiện trong mẫu thử Điều này chứng tỏ các mẫu Trạch tả nghiên cứu không có thành phần AB23 Chúng tôi lựa chọn hệ dung môi A để định tính thành phần AB23 trong các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường
Khảo sát hệ dung môi pha động:
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 3 hệ dung môi pha động:
Hệ dung môi A’: hexan: aceton (1:1)
Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)
Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1)
Kết quả: Sắc ký đồ định tính AA trong Trạch tả được trình bày như hình 3.2
Hình 3.2 Khảo sát định tính AA
Ký hiệu: Quan sát dưới đèn UV 366
Quan sát dưới ánh sáng thường
Nhận xét: Trong các hệ dung môi khảo sát, nhận thấy hệ dung môi B cho R f của AA trong khoảng 0,4; vết tách biệt khỏi các vết khác Vì vậy chúng tôi chọn hệ dung môi pha động hexan: aceton (1,5:1) (v/v) để triển khai sắc ký
Sau quá trình khảo sát và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định tính AB23 và AA bằng sắc ký lớp mỏng theo các điều kiện dưới đây:
- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)
- Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 1 mg chất chuẩn AB23, AA tương ứng hòa tan trong khoảng 2 ml methanol
- Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với 30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc ký lớp mỏng
Định tính AB23: petroleum ete : ethyl acetat (8:9) (v/v)
Định tính AA: hexan: aceton (1,5:1) (v/v)
- Cách tiến hành: Đưa lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch thử và 5 μl dung dịch chất đối chiếu Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không khí ở nhiệt độ phòng và phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol Sấy bản mỏng ở 105 o C trong vài phút Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 366 và ánh sáng thường
Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với vết đạt được trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu
3.1.3 Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường theo phương pháp đã xây dựng trong mục 3.1.1 và
Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu Trạch tả
Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số mẫu Trạch tả
Quan sát dưới đèn UV 366 Quan sát dưới ánh sáng thường
- M1 – M7: Các mẫu thử dược liệu Trạch tả, lần lượt từ M1 – M7
- C: Mẫu chất đối chiếu AB23
- C’: Mẫu chất đối chiếu AA
Nhận xét: Trên sắc ký đồ của các mẫu M1 – M7 có vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AA Trong khi đó, không thấy xuất hiện vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của AB23 Như vậy, có thể tạm kết
Định lượng AA bằng HPLC
Từ kết quả thu được trong mục 3.1.3 Nhận thấy có thể lựa chọn alisol
A làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Trạch tả Từ đó, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng alisol A trong dược liệu Trạch tả
Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây [22,54,55] để định lượng AA trong Trạch tả, cột C18 thường được sử dung Để phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện có chúng tôi sử dụng cột Eclipse XDB-C18 (4,6mm x 250nm, 5àm)
3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động
Một số điều kiện sắc ký cố định:
- Cột Elipse XDB – C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 àm)
- Pha động: Acetonitril (ACN) và nước (H 2 O)
- Bước sóng phát hiện: 210 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/ phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được chuẩn bị như mục 2.3.2.1
Tiến hành khảo sát pha động là hệ dung môi ACN : H2O và thay đổi tỷ lệ giữa 2 thành phần theo 3 chương trình dung môi:
- Chương trình dung môi 1: ACN : H 2 O (80:20)
- Chương trình dung môi 2: ACN : H 2 O (70:30)
- Chương trình dung môi 3: ACN : H 2 O (60:40) Kết quả thu được trong hình 3.5
Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động
Với chương trình dung môi 1 và 2 ta thấy AA được rửa giải sớm (tR 5,045 và 6,508) Với chương trình dung môi 2, pic AA rửa giải muộn hơn (tR
= 9,676) và đã tách hoàn toàn khỏi các pic khác, pic gọn, cân đối với hệ số kéo đuôi A S = 1,262 Độ phân giải của pic AA với các pic liền kề R S > 2,5 Vì vậy chúng tôi lựa chọn chương trình dung môi 3 cho phương pháp định lượng
3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.2.3.1 Khảo sát dung môi chiết
Trên cùng một nền mẫu phân tích, chúng tôi tiến hành chiết theo quy trình dự kiến Sử dụng dung môi chiết là EtOH và MeOH : H2O với các tỷ lệ khác nhau Với mỗi loại dung môi, phân tích lặp lại 3 lần bằng HPLC ở điều kiện đã xây dựng như trên, tính kết quả trung bình Thu được kết quả như sau:
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Dung môi (g) Diện tích pic
Nhận xét: Khi sử dụng hỗn hợp dung môi chiết là MeOH 80% (v/v), hàm lượng AA thu được là cao nhất Do đó chúng tôi sử dụng dung môi này để chiết AA khỏi nền mẫu phân tích
3.2.3.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Thực hiện chiết siêu âm theo quy trình trong mục 2.3.2.1 Với sự thay đổi thể tích dung môi chiết MeOH 80% ở ba mức: 25ml, 50ml, 100ml Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Thể tích dung môi chiết (ml) (g) Diện tích pic
Với kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết như trên, chúng tôi nhận thấy chiết với 25 ml MeOH 80% cho hàm lượng AA cao nhất Vì vậy chúng tôi lựa chọn thể tích dung môi chiết cho AA là 25 ml
3.2.3.3 Khảo sát thời gian chiết
Trên cùng một nền mẫu, tiến hành chiết siêu âm với 25ml MeOH 80% với thời gian chiết thay đổi: 10 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút và 90 phút
Quy trình tương tự như mục 2.3.2.1 Phân tích lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết (phút) (g) Diện tích pic
Nhận xét: Với kết quả khảo sát thời gian chiết như trên, chúng tôi nhận thấy hàm lượng AA đo được trong mẫu tăng khi thời gian chiết mẫu tăng Tuy nhiên, khi tăng thời gian chiết mẫu lên 40 phút thì hàm lượng AA thay đổi không đáng kể
Do đó chúng tôi lựa chọn quy trình chiết siêu âm 30 phút để chiết AA ra khỏi nền mẫu
3.2.3.4 Quy trình xử lý mẫu đƣợc lựa chọn
Dựa vào kết quả khảo sát dung môi chiết, tỷ lệ dung môi chiết và thời gian chiết, chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu sau đây cho phương pháp định lượng AA trong thân rễ Trạch tả
Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn 3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng
Tiến hành phân tích 3 mẫu: mẫu trắng, dung dịch AA chuẩn, dung dịch mẫu thử với chương trình khảo sát trong mục 3.2.2 ta thu được kết quả đánh giá bằng sắc ký đồ tương ứng như hình 3.7
Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào ống ly tâm 50 ml
Dịch chiết Thêm chính xác 25 ml
Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
Trên sắc ký đồ cho thấy, thời gian lưu của AA ở mẫu thử và mẫu chuẩn là tương đương nhau, pic AA không bị trùng với các pic khác chứng tỏ phương pháp và hệ thông sắc ký có độ đặc hiệu cao
3.2.4.2 Tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp hệ thống được đánh giá theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.2.4 Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn AA cú nồng độ 104,2 àg/ml Kết quả thu được trỡnh bày trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc lần lượt là 0,028% (< 2%) và 0,415% (< 2%), cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định của
3.2.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Phân tích mẫu thử đã được xác định nồng độ AA, sau đó pha loãng dần đến khi trên sắc ký đồ của dung dịch thử, tại thời gian lưu của AA xác định được tỷ lệ S/N = 3 – 4 Từ đó tìm được LOD Mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình
Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD
Tại nồng độ 0,17 àg/ml, tỷ lệ S/N = 3 – 4
Với kết quả này chúng tôi xác định:
Giới hạn phỏt hiện: LOD = 0,17 àg/ml
Giới hạn định lượng: LOQ = LOD x 3,3 = 0,51 àg/ml
3.2.4.4 Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính
Chuẩn bị một dãy dung dịch AA chuẩn có nồng độ tăng dần từ 4,17 àg/ml đến 416,8 àg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký với cỏc điều kiện đó khảo sỏt trong mục 3.2.2 Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ AA được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AA
Datafil e Nam e:LOD-0.1667-20ul-002.lcd Sam pl e Nam e:thu Sam pl e ID:01
Hình 3.9 Đường chuẩn của AA
Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 12779x – 6729,6 (R² = 1)
Ký hiệu: x: nồng độ alisol A (àg/ml) y: diện tích pic (mAU.s)
Nhận xét: Đường chuẩn được đánh giá thông qua hệ số tương quan R
Kết quả đánh giá đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.7 có R 2 = 1 > 0,99 cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng AA
Ứng dụng phương pháp
Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường, mỗi mẫu thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình
Hàm lượng % AA trong dược liệu khô tuyệt đối được tính theo công thức:
C: nồng độ AA trong dung dịch mẫu thử (àg/mL) m: khối lượng mẫu dược liệu đem phân tích (g) d: độ ẩm của mẫu dược liệu (%)
Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu Trạch tả Tên mẫu Độ ẩm (%) Diện tích píc
Hàm lƣợng trung bình (kl/kl) %
Với 7 mẫu định lượng cho thấy, Trạch tả được trồng tại Ninh Bình có chứa hàm lượng AA cao nhất (0,374 %) Các mẫu Trạch tả thu thập trên thị trường có chứa hàm lượng AA dao động 0,23 – 0,38 %.
Bàn luận
Trạch tả là một loại dược liệu quý, được sử dụng lâu đời trong nền YHCT Trung Quốc và nước ta để điều trị một loạt các bệnh liên quan đến khó
Ngày nay, do nhu cầu sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược cho mục đích chăm sóc sức khỏe ngày càng tăng cao khiến cho dược liệu Trạch tả được sử dụng với khối lượng khá lớn Trạch tả hiện là một trong những dược liệu đang được trồng ở nhiều vùng tại Việt Nam như Ninh Bình, Hưng Yên,…đặc biệt tỉnh Ninh Bình đang có dự án xây dựng chỉ dẫn địa lý cho cây trạch tả trồng tại vùng này Tuy nhiên, phần lớn dược liệu Trạch tả trên thị trường Việt Nam chưa được kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu không đạt chất lượng, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh và gây tổn thất lớn về kinh tế Vì vậy, công tác kiểm tra, đánh giá dược liệu Trạch tả là rất quan trọng
Trong khi đó, DĐVN IV tuy đã có chuyên luận Trạch tả nhưng chưa được viết chi tiết, chưa xây dựng phương pháp định tính và định lượng các hoạt chất chính Qua tham khảo, Dược điển Hồng Kông và Dược điển Trung Quốc đều sử dụng AB23 làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm dược liệu Trạch tả
Tuy nhiên, qua quá trình khảo sát nhận thấy dược liệu Trạch tả trồng và hiện có trên thị trường Việt Nam không có hoặc có rất ít hoạt chất này Trong khi đó, AA lại có trong tất cả các mẫu nên có thể sử dụng làm ―maker‖ để kiểm soát chất lượng dược liệu Trạch tả
3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính
Trên thực tế có thể sử dụng phương pháp HPLC để kết hợp định tính và định lượng AA và AB23 trong thân rễ Trạch tả Tuy nhiên trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi chọn định tính bằng TLC, vì phương pháp TLC có ưu điểm hơn so với HPLC là rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu và thời gian phân tích, trang thiết bị đơn giản hơn Qua đó có thể áp dụng để định tính nhanh các mẫu dược liệu trên thị trường
Phương pháp định tính mà chúng tôi xây dựng đã sử dụng hệ dung môi đơn giản và thuốc thử hiện màu nhạy, phổ biến trong nhiều phòng phân tích kiểm nghiệm ở Việt Nam Chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu theo một quy trình dễ thực hiện và tốn ít thời gian Kết quả sắc ký đồ thu được đã cho vết của AA và của AB23 có màu dễ nhận biết và giá trị R f phù hợp
Với các điều kiện phân tích dự kiến, chúng tôi nhận thấy phương pháp đã xây dựng đáp ứng đầy đủ các yêu cầu cần thiết của một phương pháp định tính
3.4.3 Quy trình xử lý mẫu định lƣợng
Xử lý mẫu là bước đóng vai trò quan trọng trong phân tích định lượng giúp loại bỏ tạp và tách lấy chất ra khỏi dược liệu Sau khi tham khảo một số tài liệu, căn cứ tính chất của AA cũng như khảo sát các điều kiện, chúng tôi đã lựa chọn được một quy trình xử lý mẫu mang lại hiệu suất cao và phù hợp với điều kiện hiện có
Phương pháp chiết siêu âm là một phương pháp đã được sử dụng phổ biến, đặc biệt là trong chiết xuất hoạt chất từ dược liệu do tính đơn giản và hiệu suất chiết cao
Các nghiên cứu chiết hiện có đã sử dụng một trong các dung môi: methanol, ethanol, hỗn hợp MeOH : H2O, hỗn hợp ACN : H2O Tuy nhiên, với mục đích ứng dụng rộng rãi, phù hợp với quy mô của nhiều phòng kiểm nghiệm, và qua quá trình khảo sát, chúng tôi thấy rằng chiết siêu âm 1 lần với
25 ml MeOH 80% trong 30 phút là hợp lý về kinh tế, an toàn với môi trường và giảm được lượng dung môi sử dụng
Sử dụng phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm như chọn điều kiện phân tích linh động, độ chọn lọc cao, độ nhạy cao, kết quả tương đối chính xác, quy trình tiến hành đơn giản
AA là hợp chất có khả năng hấp thụ tại bước sóng trong vùng tử ngoại nên có thể sử dụng detector UV-VIS để phân tích Với các điều kiện sắc ký đã thiết lập, pha động chỉ gồm có acetonitril và nước, chương trình rửa giải đẳng dòng đơn giản, vì vậy có thể triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm của Việt Nam
Các chỉ tiêu thẩm định đã được tiến hành gồm có: tính chọn lọc, tính phù hợp hệ thống, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp Các tiêu chí thẩm định đều đạt theo yêu cầu của AOAC, khoảng tuyến tính rộng cho phép định lượng AA trong các đối tượng đa dạng
3.4.5 Kết quả phân tích mẫu thân rễ Trạch tả
Do chưa có tiêu chuẩn cho AA và AB23 trong dược liệu Trạch tả và đề tài mới chỉ áp dụng trên 7 mẫu thực, nên chúng tôi bước đầu kết luận các mẫu đều chứa AA và hàm lượng AA trong dược liệu Trạch tả trong khoảng 0,23% đến 0,38% Tuy nhiên, qua thử nghiệm định tính, cả 7 mẫu đều không chứa AB23 Trong các mẫu phân tích, mẫu dược liệu Trạch tả trồng và thu hái tại Ninh Bình có hàm lượng AA cao nhất
Nguyên nhân các mẫu thân rễ Trạch tả không định tính thấy AB23 có thể là do quy trình xử lý sơ bộ mẫu không tốt hoặc do các yếu tố thuộc về giống, vùng trồng, thời gian thu hái, quá trình sơ chế bảo quản dược liệu Để có thể đánh giá một cách khách quan hơn cần định tính, định lượng