Nghiên cứu quy trình tạo phôi chuột knockout gene lep trung tâm công nghệ sinh học tp hồ chí minh

H GENE LEP - NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI CHUỘT KNOCKOUT GENE LEP SỬ DỤNG KỸ THUẬT CRISPR/Cas9 RESEARCH TO CREATE MOUSE EMBRYO KNOCKOUT GENE LEP USING CRISPR/Cas9 TÓM TẮT Hiện kỹ thuật CRISPR/Cas sử dụng nhiều công nghệ chỉnh sửa gene Trong nghiên cứu này, phôi chuột knockout gene Lep tạo cách vi tiêm plasmid có cấu trúc CRISPR/Cas9 hướng đến exon gene Nghiên cứu sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gRNA, tạo dịng plasmid px330-gRNA-R px330-gRNA-L có khả định hướng giúp hệ CRISPR/Cas9 loại bỏ đoạn exon có chiều dài 420bp, vị trí 29070816 – 29071236 gene Lep Phôi chuột tạo phương pháp bơm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) Sau 6h ICSI, phôi chuột giai đoạn hợp tử hai tiền nhân, knockout gene cách vi tiêm plasmid px330-gRNA-R px330-gRNA-L với nồng độ ng/µl vào tiền nhân đực Kết kiểm tra PCR phơi có vi tiêm plasmid cho thấy 36/72 (50%) phôi loại bỏ đoạn exon gene Lep Như vậy, nghiên cứu tạo thành công phôi knockout gene Lep dạng dị hợp Từ khóa: CRISPR/Cas9, Leptin, béo phì, chuột knock-out, vi tiêm ABSTRACT Nowadays, the CRISPR/Cas technology is becoming increasingly popular in gene editing technology In this study, mouse embryos knockout knockout Lep gene were generated by microinjecting a plasmid with the CRISPR/Cas9 construct directed at exon of the gene site The study used bioinformatics software to design gRNAs, and cloned plasmids px330gRNA-R and px330-gRNA-L capable of guiding the CRISPR/Cas9 system to direct remove exon with a length of 420bp, at positions 29070816 – 29071236 on the Lep gene Mouse embryos were generated by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) After 6h of ICSI, mouse embryos, zygote in two progenitor stage, were knockout gene by microinjection px330gRNA-R and px330-gRNA-L plasmids at a concentration of ng/µl into the male pronucleus The PCR test showed that 36/72 (50%) the embryos were injected with plasmid to removed the Lep genes Thus, the study has successfully created mouse embryos knockout Lep gene in heterozygous zygote form Keywords: CRISPR/Cas9, Leptin, obesity, knockout mouse, injected GIỚI THIỆU Ở Việt nam, việc tạo động vật chuyển gene vấn đề Hiện chưa có cơng bố nghiên cứu biến đổi di truyền chuột - mơ hình động vật để nghiên cứu bệnh lý người Chuột knockout có hữu ích việc nghiên cứu mơ hình hóa loại bệnh khác như: ung thư, béo phì, bệnh tim, đái tháo đường, viêm khớp, stress, lão hóa bệnh Parkinson Chuột knockout cung cấp bối cảnh sinh học thuốc liệu pháp khác phát triển thử nghiệm (Rajashekar et al., 2013) Do đó, làm chủ công nghệ tạo chuột biến đổi di truyền hỗ trợ lớn cho nghiên cứu y sinh phục vụ nâng cao chất lượng sống người Động vật biến đổi gene thường sử dụng phịng thí nghiệm mơ hình nghiên cứu y sinh Chúng công cụ quan trọng để nghiên cứu bệnh người, sử dụng để tìm hiểu chức gene bệnh cụ thể, tiến trình phát triển xác định đáp ứng với can thiệp điều trị Hơn 95% số sử dụng loài gặm nhấm biến đổi gene, chủ yếu chuột Để tạo mơ hình động vật bị biến đổi gene sử dụng phương pháp chuyển gene để loại bỏ khố gene để xác định chức gene Sự phát triển động vật chuyển gene gần có nhiều thay đổi nhờ xuất công cụ chỉnh sửa gene CRISPR, giúp giảm đáng kể số bước để tạo động vật chuyển gene, làm cho toàn trình nhanh tốn (Crystal Ayres, 2019) CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hệ thống miễn dịch thích nghi, tồn nhiều loại vi khuẩn Việc ứng dụng CRISPR/Cas nghiên cứu sản xuất động vật biến đổi di truyền giúp tạo sinh vật mơ hình cách nhanh chóng, hiệu tiết kiệm chi phí (Zhang et al., 2017) Công nghệ CRISPR/Cas cho phép việc chỉnh sửa gene giai đoạn phôi trở nên dễ dàng với bước chính: (1) chuẩn bị hợp tử, (2) chuyển hỗn hợp gRNA Cas9 mRNA vào hợp tử, (3) chuyển phôi chứa hỗn hợp CRISPR/Cas9 vào “mang thai hộ” để sản xuất hệ F0 Năm 2013, mơ hình chuột KO (knock out) áp dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 tạo từ phòng thí nghiệm Jaenisch Theo nhóm nghiên cứu, việc kết hợp mRNA Cas9 gRNA (Tet1, Tet2) tạo chuột mang 80% đột biến gene (Wang et al., 2103) Các nghiên cứu rằng, việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 mang lại thuận tiện, hiệu nhanh chóng việc tạo chuột knockout gene Ngày nay, CRISPR/Cas9 sử dụng mạnh mẽ để sản sinh allele đột biến nhiều loài sinh vật khác chuột cống (rat), heo, thỏ, chó, khỉ tế bào gốc phôi người (LiFang & Jin-Song, 2016) Leptin protein gồm 167 axit amin tạo gene leptin, tín hiệu quan trọng việc điều chỉnh khối lượng mô mỡ trọng lượng thể, hoạt động cách ức chế lượng thức ăn kích thích tiêu hao lượng Khiếm khuyết sản xuất leptin gây béo phì nghiêm trọng Ở chuột, gene Lep chứa ba exon exon exon mã hóa cho protein leptin (Lonnqvist et al., 1995) Do đó, đột biến gene Lep nghiên cứu sâu để sản xuất mơ hình chuột béo phì tiểu đường Để loại bỏ chức gene Lep, gRNA thường thiết kế nằm vùng exon 3, nhằm phá vỡ cấu trúc protein leptin (Moon et al., 2013) Roh et al (2018) tạo mơ hình chuột béo phì, chuột tiểu đường thông qua công cụ CRISPR/Cas9 Trong nghiên cứu này, thiết kế gRNA hướng đến loại bỏ chức gene Lep, để tạo phôi chuột knockout, hướng đến tạo chuột knockout, làm tiền đề cho nghiên cứu tạo động vật biến đổi di truyền NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu Mus musculus var Albino (Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) Dịng tế bào HEK293 (Phịng CNSH Động vật - Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp HCM) Plasmid px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-hGem plasmid pCAG-EGxxFP (Addgene, Mỹ (Code # 71707 code # 50716 tương ứng)) Các đoạn oligonucleotide (Công ty IDT) 2.2 Phương pháp 2.2.1 Thiết kế gRNA tạo dòng plasmid px330-gRNA Các trình tự gRNA thiết kế dựa trình tự genome công cụ tin sinh học trực tuyến như: CRISPOR, IDT CRISPR, KOnezumi, CHOPCHOP, Benchling CRISPR Guide Design gRNA sàng lọc có vị trí bắt cặp tương ứng exon nhằm giúp protein Cas cắt bỏ DNA mục tiêu Các gRNA chọn thỏa tiêu chí sau: + Điểm S-Score, E-Score ≥ 50 + Phần trăm GC > 50-60%, bắt đầu G + Kích thước gRNA: 17-20bp Tạo dịng plasmid px330-gRNA-R plasmid px330-gRNA-L (dùng để knockout gene LEP phôi) Tổng hợp plasmid pCAG-EGxxFP-lep (plasmid pCAG-EGxxFP chèn đoạn exon gene lep, có độ dài 420bp, khoảng vị trí 29070816 - 29071236 có chứa gRNA-L gRNA-R) 2.2.2 Đánh giá cắt đặc hiệu hệ CRISPR/Cas9 Plasmid pCAG-EgxxFP-lep có chứa trình tự exon gene lep sử dụng để kiểm tra khả cắt đặc hiệu hệ CRISPR/Cas9 tế bào HEK293 Đồng chuyển plasmid px330-gRNA-L px330-gRNA-R hai plasmid px330-gRNA-L, px330-gRNA-R plasmid pCAG-EGxxFP-lep vào tế bào HEK293 Nếu Cas9 cắt trình tự gRNA-L gRNA-R gene LEP, lúc gene EGFP dạng hoàn chỉnh, làm tế bào HEK293 phát sáng Điều chứng tỏ hệ CRISPR/Cas9 cắt đặc hiệu 2.2.3 Vi tiêm hỗn hợp plasmid chứa hệ CRISPR/Cas9 vào hợp tử hai tiền nhân Chuột gây siêu noãn 10 IU PMSG 10 IU hCG (Lars M Ittner & Jurgen Gotz, 2007; Andrew Cho et al., 2009) Sau 12 - 14 tiêm hCG, tiến hành thu trứng Sau ISCI (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection) thu nhận hợp tử tiền nhân Vi tiêm plasmid px330-gRNA-L px330-gRNA-R vào hợp tử hai tiền nhân với nồng độ 5ng/µl Hợp tử hai tiền nhân vi tiêm thành cơng tiền nhân cịn ngun vẹn, không bị vỡ, không bị trào tế bào chất ngồi sau 24 vi tiêm, phơi khơng bị chết 2.2.4 PCR đánh giá kiểu gene phôi Những phôi sau vi tiêm nuôi đến giai đoạn phôi – tế bào, thu tế bào để kiểm tra kiểu gene tiếp tục nuôi phôi Kiểu gene kiểm tra dựa kết chạy PCR điện di gel agarose Cặp mồi sử dụng để khuếch đại đoạn exon gene LEP Primer (F) LEP: 5’- CAGCTGATGACAGGAAGTAAGG -3’ Primer (R) LEP 5’- CAGCTGATGACAGGAAGTAAGG -3’ Sử dụng đoạn gene SOX21 dài 237 bp, đoạn gene động vật hữu nhũ làm chứng nội: Primer (F) SOX21: 5’- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG-3’ Primer (R) SOX21: 5’- GCACTCCAGAGGACAGCAGTGTCAATA-3’ Điện di gel agarose 2-3% đọc kết hệ thống Image Quant Lab 500 GE KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế gRNA tạo dòng plasmid px330-gRNA Gene Lep nằm nhiễm sắc thể số 6, có vùng mã hóa protein nằm 03 exon Dựa vào trình tự gene mục tiêu, gRNA thiết kế nhằm knockout (loại bỏ) đoạn DNA có kích thước 396 bp exon (Hình 1) Kết chọn lọc in silico với thông số S-score, E-score, % GC, kích thước trình tự PAM sàng lọc 70 cặp gRNA, có khả sử dụng để knockout gene Lep Từ kết này, nhóm nghiên cứu chọn gRNA (bảng 1, Hình 2) để sử dụng cho thí nghiệm sau (kết chọn cặp gRNA công bố báo khác) Hình Sơ đồ mơ tả vùng gene mục tiêu gene Lep Primer (F) LEP, Primer (R) LEP: trình tự primer để chọn vùng trình tự 640bp exon 3; gRNA-L, gRNA-R: trình tự gRNA định hướng giúp protein Cas9 cắt đoạn DNA 396 bp exon Bảng Thông số kỹ thuật sgRNA Tên Trình tự PAM S-Score E-Score %GC gRNA-L GATACCGACTGCTATGCAGG AGG 73 63 55 gRNA-R GGCTCCCAAGAATCATGTAG AGG 73 61 50 Hai gRNA chọn, vị trí gRNA-L (29070813- 29070833), gRNA-R (2907119929071219), có bắt cặp liền mạch với trình tự mục tiêu khơng có đột biến nucleotide so với trình tự gRNA khác (Hình 2) Hình Kết so sánh bắt cặp cặp gRNA chọn với trình tự gene Lep phần mềm Bioedit Tạo dòng plasmid px330-gRNA-L px330-gRNA-R cách chèn trình tự gRNA-L gRNA-R vào plasmid px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-hGem Kết tạo dòng thu 02 dòng plasmid px330 có chứa xác trình tự gRNA-L gRNA-R, thể qua kết giải trình tự gene (Hình 3A, hình 3B) (A) (B) Hình Kết giải trình tự gRNA chèn vào plasmid A gRNA-L, B gRNA-R Plasmid pCAG-EGxxFP chèn đoạn exon (420 bp) gene Lep (sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI EcoRI), kết tạo dòng plasmid pCAG-EGxxFP-lep, sử dụng để kiểm tra khả cắt đặt hiệu hệ CRISPR/Cas9 tế bào HEK293 Kết cho thấy trình tự exon chèn vào plasmid pCAG-EGxxFP, sản phẩm PCR với cặp mồi pCAG-F, pCAG-R điện di gel agarose có kích thước khoảng 700 bp trình tự chưa chèn vào, kích thước 1100 bp chèn đoạn exon (Hình 4) Mồi pCAG-R: GGTCAGCTTGCCGATATCGA (vị trí: 2372 - 2391) Mồi pCAG-F : GCAACGTGCTGGTTATTGTG (vị trí: 1688 - 1707) Hình Sản phẩm PCR pCAG-EGxxFP-lep với cặp mồi pCAG-F, pCAG-R (M): thang DNA, (1): Sản phẩm PCR không chèn trình tự exon gene Lep (704bp), (2): Sản phẩm PCR có chèn trình tự exon gene Lep (1124 bp) 3.2 Đánh giá cắt đặc hiệu hệ CRISPR/Cas9 Để đánh giá hiệu knockout CRISPR/Cas9, tế bào HEK 293 biến nạp đồng thời plasmid px330-gRNA-R; plasmid px330-gRNA-L plasmid pCAG-EGxxFP-lep Kết sau biến nạp cho thấy, đoạn exon gene Lep chèn plasmid pCAG-EGxxFP cắt thành cơng, trình tự gene EGFP có độ dài đầy đủ khơi phục tổng hợp nên protein GFP - phát sáng huỳnh quang xanh tế bào HEK293 (Hình 5) Kết chi tiết cho thấy, sau 48h biến nạp, nhóm tế bào biến nạp px330-gRNA-L pCAGEGxxFP-lep (Hình 5D); nhóm tế bào biến nạp px330-gRNA-R pCAG-EGxxFP-lep (Hình 5E) nhóm tế bào biến nạp đồng thời px330-gRNA-R; px330-gRNA-L pCAG-EGxxFP-lep (Hình 5F) quan sát thấy tín hiệu GFP dương tính Điều chứng tỏ gRNA-L gRNA-R nhận biết trình tự mục tiêu pCAG-EGxxFP-Lep, nên hướng Cas9 đến cắt gene mục tiêu gene EGFP khôi phục, tạo protein GFP làm tế bào HEK 293 phát sáng Trong nhóm đối chứng, tế bào biến nạp plasmid pCAG-GFP (Hình 5A), quan sát rõ tín hiệu dương tính GFP, đối chứng dương quy trình biến nạp Ngược lại, tín hiệu GFP khơng phát nhóm đối chứng âm, tế bào đồng biến nạp pCAG-EGxxFP-lep px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-hGem (Hình 5B) nhóm tế bào đồng biến nạp pCAG-EgxxFP với px330-gRNA-R px330-gRNA-L (Hình 5C) Hình Biến nạp plasmid vào tế bào HEK 293 cho việc kiểm tra hoạt động CRISPR/Cas9 (10X) A pCAG-GFP; B pCAG-EGxxFP-lep px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-hGem; C pCAGEgxxFP với px330-gRNA-R px330-gRNA-L; D pCAG-EGxxFP-lep px330-gRNA-L; E pCAGEGxxFP-lep px330-gRNA-R; F pCAG-EGxxFP-lep, px330-gRNA-L px330-gRNA-R 3.3 Vi tiêm hỗn hợp plasmid chứa hệ CRISPR/Cas9 vào hợp tử hai tiền nhân Trứng tinh trùng sau thu nhận, sử dụng làm nguyên liệu cho trình ICSI (bơm tinh trùng vào trứng) để tạo hợp tử tiền nhân Sau thực ICSI, hợp tử tiền nhân sử dụng làm nguyên liệu cho trình vi tiêm vào tiền nhân đực, nhằm tạo phơi knockout (KO) gene Sau lần thực vi tiêm, kết q trình vi tiêm tạo phơi KO trình bày chi tiết bảng Bảng Kết vi tiêm nhóm thí nghiệm Vi tiêm plasmid Số phôi vi tiêm 88 Tỉ lệ (%) thành công 81,70 ± 2,93 Vi tiêm dung dịch elution Số phôi vi tiêm 74 Tỉ lệ (%) thành công 82,37 ± 1,54 ICSI Số hợp tử tiền nhân Tỉ lệ (%) phôi tế bào 76 84,14 ± 3,75 Số liệu bảng cho thấy, tỉ lệ vi tiêm thành cơng đồng nhóm thí nghiệm dao động khoảng 82% khơng có khác biệt, tỉ lệ vi tiêm thành công đánh giá dựa số phôi không bị chết sau vi tiêm số phôi phát triển lên giai đoạn sau 24 nuôi Kết cho thấy, trình vi tiêm đồng khả sống sót phơi sau vi tiêm nghiệm thức nhau, chứng tỏ dung dịch chọn vi tiêm không ảnh hưởng đến tỉ lệ thành công trình vi tiêm Kết vi tiêm thấp so với nghiên cứu Andrew Cho et al (2009), với tỉ lệ phôi vi tiêm thành công 95% 3.4 PCR đánh giá kiểu gene phôi Những phôi sau vi tiêm nuôi đến giai đoạn phôi – tế bào, thu tế bào để kiểm tra khả knockout gene hệ CRISPR/Cas9 phản ứng PCR với cặp mồi tương ứng phần 2.2.4 Trong tổng số 72 phôi (81,7%) vi tiêm thành công, thu 55 phôi phát triển vượt qua giai đoạn phôi tế bào để tạo thành phơi dâu, phơi nang (Hình 7), chiếm tỉ lệ 76% (55/72) Tất phôi kiểm tra kiểu gene để xác định phơi có knockout hay khơng Trong 55 phơi, có 36 phơi knockout gen Lep, đạt tỉ lệ 50% (36/72) số phôi vi tiêm plasmid Kết điện di kiểm tra PCR thể hình cho thấy, giếng (chứng dương), phôi không bị knockout gene Lep tạo band có kích thước 642 bp Giếng 3,4 sản phẩm PCR phôi bị knockout gene Lep cho vị trí gel; vị trí 642 bp vị trí 642 - 396 = 246 bp (Hình 6) Sản phẩm band, hệ CRISPR/Cas9 cắt sợi DNA, sợi lại nguyên kích thước Hình Kết điện di sản phẩm PCR tế bào phôi thu giai đoạn phơi tế bào Hình Phơi sau vi tiêm phát triên đến giai đoạn phôi nang (200X) (M): Thang kích thước DNA; (1): chứng nội, sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene 237 bp gene động vật hữu nhũ, gene SOX21; (2): chứng dương, sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 642 bp gene Lep không bị knockout; (3), (4): sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 642 bp gene Lep knockout KẾT LUẬN Như vậy, nghiên cứu này, thiết kế tổng hợp plasmid px330 mang trình tự gRNA, có khả nhận biết cắt đặc hiệu trình tự mục tiêu gene Lep chuột Quy trình vi tiêm plasmid vào tiền nhân đực cho thấy tỉ lệ phơi KO đạt 50% Kết nghiên cứu có tiềm to lớn ứng dụng tạo chuột chuyển gene tương lai phục vụ cho nghiên cứu y sinh học nước nhằm đưa nghiên cứu Việt Nam đến gần với nghiên cứu giới LỜI CẢM TẠ: Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp sở Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Andrew Cho, Naoto Haruyama, Ashok B Kulkarni (2009) Geneeration of transgeneic mice Current Protocols Cell Biology, 42(1), 19-11 Crystal Ayres (2019) 20 Biggest Pros and Cons of Transgenic Animals Enviroment Lars M Ittner & Jurgen Gotz (2007) Pronuclear injection for the production of transgenic mice Nature protocols, 2, 1206-1215 Li-Fang, J.I and Jin-Song, L (2016) Generation of genetically modified mice using CRISPR/Cas9 and haploid embryonic stem cell systems Zoological Research, 37(4), 205 Lonnqvist, F., Arner, P., Nordfors, L., and Schalling, M (1995) Overexpression of the obese (ob) gene in adipose tissue of human obese subjects Nature medicine, 1(9), 950-953 Moon, H S., Dalamaga, M., Kim, S Y., Polyzos, S A., Hamnvik, O P., Magkos, F., Paruthi, J., and Mantzoros, C S (2013) Leptin's role in lipodystrophic and nonlipodystrophic insulin-resistant and diabetic individuals Endocrine reviews, 34(3), 377 - 412 Rajashekar B., Suhasini K and Pattar Jayashree (2013) Gene kicked mouse: Knockout mouse and its application Int Res J Pharm, 4(7) Roh, J.I, Lee, J., Park, S.U., Kang, Y.S., Lee, J., Oh, A.R., Choi, D.J., Cha, J.Y., Lee, H.W (2018) CRISPR – Cas - mediated geneeration of obese and diabetic mouse models Exp Anim, 67(2), 229-237 Wang, H., Yang, H., Shivalila, C.S., Dawlaty, M M., Cheng, A W., Zhang, F., and Jaenisch, R (2013) Onestep generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering Cell, 153(4), 910-918 Wang, Y.C., McPherson, K., Marsh, T., Gortmaker, S.L., Brown, M (2011) Health and economic burden of the projected obesity trends in the USA and the UK Lancet, 378(9793), 815-825 Zhang, Z., Zhang, Y., Gao, F., Han, S., Cheah, K S., Tse, H F and Lian, Q (2017) CRISPR/Cas9 genomeediting system in human stem cells: current status and future prospects Molecular Therapy-Nucleic Acids, 9, 230-241