Tạo chủng aeromonas hydrophila đột biến và thử nghiệm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của cá tra giống

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA GIỐNG ThS VŨ THỊ THANH HƢƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 1/2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN VÀ THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA GIỐNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 4/2016 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Với mục tiêu tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến thử nghiệm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch cá Tra giống Các chủng A hydrophila hoang dại gây bệnh cá Tra từ tỉnh Đồng Sông Cửu Long phân lập đánh giá độc lực genome Hai chủng vi khuẩn có độc lực cao AG1 AG1.4 có hai kiểu gen khác chọn để tiến hành tạo chủng đột biến phương pháp knock-out gen aroA (gen mã hóa 5-enolpyruvylshikimate 3phosphate synthase) Chủng đột biến knock out gen có độc lực thấp nhiều so với chủng hoang dại 100.000 lần Hơn nữa, chủng đột biến có khả kháng bệnh cho cá Tra A hydrophila gây với RPS >95% thử nghiệm với hai phương pháp tiêm ngâm Tiềm sử dụng chủng vi khuẩn đột biến knock out gen vaccine ngừa bệnh xuất huyết cho cá Tra phương pháp ngâm cao Đề tài đề nghị phát triển thêm để hoàn thiện vaccine sống nhược độc nhằm đưa vào ứng dụng i SUMMARY OF RESEARCH CONTENT In the goal of obtaining the knock-out gene mutant using as vaccine against septicemia disease for catfish, the strains of A hydrophila have been isolated from diseased catfish in provinces of Mekong delta The toxicity and genomic analysis were characterized Two bacterial strains with different genomic characteristic in the O-antigen cluster were used to create aroA knock-out gene mutant Those mutants shown a considerable, at least 10,000 folds, lower in pathogenicity comparing to wild type Moreover, the protection against A hydrophila assay with intraperitoneal injection or bath immersion method also shown a high survival (RPS>95%) for catfish while treated with mutant strains The potential application of this mutant as the attenuated live vaccine against A hydrophila for catfish is considerable The project should be funded to future commercialization ii I MỤC LỤC TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan .4 1.1.1 Tổng quan Aeromonas hydrophila bệnh xuất huyết .4 1.1.2 aroA Gen aroA tính an tồn vaccine nhƣợc độc đột biến gen .5 1.1.3 Tính an tồn chủng đột biến gen aroA .6 1.1.4 Khả xâm nhiễm A.hydrophila tiềm vaccine A hydrophila sống nhƣợc độc dạng ngâm 1.2 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn 11 1.3 Mục tiêu đề tài 11 II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 12 2.1 Nội dung 1: Phân lập chủng Aeromonas hydrophila có độc lực cao từ mẫu cá Tra bị bệnh xuất huyết .13 2.1.1 Mô tả nội dung 13 2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.1.3 Sản phẩm nội dung cần đạt .17 2.2 Nội dung 2: Tạo chủng A hydrophila đột biến gen aroA phƣơng pháp knockout gen 17 2.2.1 Mô tả nội dung 17 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.3 Sản phẩm nội dung cần đạt .25 2.3 Nội dung 3: Thử nghiệm độc lực in vivo chủng A hydrophila đột biến gen aroA phƣơng pháp tiêm cá Tra giống 25 2.3.1 Mô tả nội dung 25 2.3.2 Phƣơng pháp thực 26 2.3.3 Sản phẩm nội dung cần đạt đƣợc 26 2.3.4 Loại bỏ gen kháng Kanamycin khỏi chủng A hydrophila đột biến 27 2.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu bảo vệ chủng đột biến nhƣợc độc khả gây đáp ứng miễn dịch cá Tra giống 31 2.4.1 Mô tả nội dung 31 2.4.2 Phƣơng pháp thực 31 2.4.3 Sản phẩm nội dung cần đạt 37 i III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Nội dung 1: Phân lập chủng Aeromonas hydrophila có độc lực cao từ mẫu cá Tra bị bệnh xuất huyết .38 3.1.1 huyết Phân lập dòng A hydrophila từ mẫu cá Tra bị bệnh xuất 38 3.1.2 Thử nghiệm độc lực dòng A hydrophila hoang dại .42 3.2 Nội dung 2: Tạo chủng A hydrophila đột biến gen aroA phƣơng pháp knockout gen 46 3.2.1 Tạo cassette knockout gen 46 3.2.2 Tiếp hợp tạo chủng đột biến .50 3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm độc lực in vivo chủng A hydrophila đột biến gen aroA phƣơng pháp tiêm cá Tra giống 56 3.3.1 Thử nghiệm độc lực 56 3.3.2 Loại bỏ gen kháng Kanamycin khỏi chủng A hydrophila đột biến 58 3.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu bảo vệ chủng đột biến nhƣợc độc khả gây đáp ứng miễn dịch cá Tra cá giống 59 3.4.1 Đánh giá hiệu bảo vệ chủng đột biến nhƣợc độc phƣơng pháp tiêm 59 3.4.2 Đánh giá hiệu bảo vệ chủng nhƣợc độc phƣơng pháp ngâm 62 3.4.3 Khảo sát diện kháng thể kháng A hydrophila theo thời gian 2-6 tuần sau tiêm phƣơng pháp vi ngƣng kết kháng nguyên- kháng thể 64 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66 4.1 Kết luận 66 Đề nghị 66 PHỤ LỤC 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 ii DANH SÁCH HÌNH H nh Lộ tr nh Shikimate nguồn: http: www.topsan.org Hinh 2.1 Plasmid pCAMBIA1300 21 Hinh 2.2 Cấu trúc gen kháng Kanamycin nhân dòng 21 Hình 2.3 Hình minh họa trình loại bỏ gen KmR nhờ vào hoạt động enzyme flippase trình tự nhận biết FRT .22 Hình 2.4 Cấu trúc cassette HKT 23 Hình 2.5 Plasmid pCP20 27 Hình 2.6 Hình minh họa trình loại bỏ gen KmR nhờ vào hoạt động enzyme Flippase trình tự FRT 28 Hình 2.8 Hình minh họa trình xảy ngưng kết kháng thể huyết cá tế bào vi khuẩn .36 Hình 2.9 Hình minh họa phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên-kháng thể .37 Hình 3.1 Kết so sánh đoạn trình tự 923bp khuếch đại cặp mồi Aho-F/R dòng A hydrophila công bố ngân hàng gen 40 Hình 3.2 Cá bị bệnh xuất huyết khuẩn lạc phân lập từ m u cá ệnh m i trường Rimler Shott 41 Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn ưới vật kính 100x 41 Hình 3.4 H nh điện di sản phẩm PCR khuếch đại cặp mồi Aer-F/R dòng vi khuẩn phân lập từ m u cá bệnh xuất huyết .42 Hình 3.5 Cây phát sinh lồi A hydrophila dựa so sánh genome (nguồn: NCBI) 45 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen HaroA(hình A), TaroA (hình B) KmR(hình C) .46 Hình 3.7 Sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli DH5α nhân òng đoạn gen HaroA (hình A), TaroA(hình B), KmR(hình C) 47 Hình 3.8 H nh điện di sản phẩm cắt plasmid pJET::TaroA pJET::HaroA enzyme BamHI XbaI 47 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc DH5α iến nạp sản phẩm nối HTaroA .48 Hình 3.10 H nh điện di sản phẩm cắt plasmid pJET::HTaroA pJET::KmR enzyme BamHI 48 Hình 11 Kết điện di sản phẩm P R khuẩn lạc iến nạp sản phẩm nối HKT với cặp primer pJ T RpJ T 49 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm cắt pJ T::HKT p P7 ằng BglII gel agarose 1% .49 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm P R khuẩn lạc iến nạp ằng primer FpGP704/RpGP704 gel agarose 1% .50 Hình 14 Kết sàng lọc khuẩn lạc tiếp hợp m i trường L Kanamycin-Colistin 51 Hình 3.15 Kết P R khuẩn lạc tiếp hợp với cặp primer aro -F1/aroA -R1 52 iii Hình 3.16 Kết điện di sản phẩm PCR primer Aer-F/R gel agarose 1% 53 Hình 3.17 Kết điện di sản phẩm PCR primer aroA -F1/aroA -R1 gel agarose 1% 53 Hình 18 Kết điện di sản phẩm PCR primer aroA -F4/aroA -R4 gel agarose 1% .54 Hình 3.19 Kết điện di sản phẩm PCR primer aroA-F5/aroA-R5 gel agarose 1% 55 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm PCR primer FKm/RKm gel agarose 1% 55 Hình 3.21 Kết điện di sản phẩm PCR primer FpGP704/RpGP704trên gel agarose 1% 56 Hình 3.22 Kết biến nạp pCP20 vào A hydrophila m i trường LBchloramphenicol-Colistin 59 Hình 3.23 Kết vi ngưng kết kháng nguyên kháng thể (huyết cá sau 0,2,4,6 tuần tiêm chủng A hydrophila nhược độc 65 DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng quát nội ung phương pháp nghiên cứu 12 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ minh họa knockout gen tái tổ hợp tương đồng 18 Sơ đồ 2.3 Quy trình tạo chủng hy rophila đột biến gen aroA phương pháp knockout gen .20 Sơ đồ 2.4 Sơ đồ vị trí cặp mồi nhân òng đoạn gen HaroA TaroA .22 Sơ đồ Phương pháp kiểm tra chủng đột iến ằng P R 24 Sơ đồ 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định độc lực in vivo chủng A hydrophila đột biến gen aroA cá Tra giống phương pháp tiêm .26 Sơ đồ 2.7 Quy trình loại bỏ pCP20 phương pháp nu i cấy nhiệt độ cao 30 Sơ đồ 2.8 Bố trí thí nghiệm xác định LD50 chủng A hydrophila hoang dại cá Tra giống phương pháp tiêm 32 Sơ đồ 2.9 Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu bảo vệ chủng A hydrophila đột biến nhược độc cá Tra giống phương pháp tiêm .33 Sơ đồ 2.10 Bố trí thí nghiệm xác định LD50 A hydrophila hoang dại trêncá Tra giống phương pháp ngâm 34 Sơ đồ 2.11 Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu bảo vệ chủng A hydrophila đột biến nhược độc cá Tra giống phương pháp ngâm .35 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Các cặp mồi kích thước tương ứng sản phẩm PCR ùng để kiểm tra chủng A hydrophila knockout gen aroA A hydrophila hoang dại 25 Bảng 3.1 Danh sách dịng A hydrophila giải trình tự toàn genome (nguồn: NCBI) 38 DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Biểu đồ Kết thử nghiệm độc lực òng A hydrophila phân lập từ n iang Đồng Tháp ằng phương pháp tiêm 43 Biểu đồ 3.2 Kết thử nghiệm độc lực dòng A hydrophila phân lập từ Bến Tre, Cần Thơ Tiền Giang phương pháp tiêm 44 Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ cá chết tích lũy theo ngày sau tiêm chủng A hydrophila đột biến M25 hoang dại AG1 .57 Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ cá chết tích lũy theo ngày sau tiêm chủng A hydrophila đột biến M14 hoang dại AG1.4 58 Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ cá chết tích lũy theo ngày sau tiêm chủng A hydrophila hoang dại AG1.4 nhằm xác định liều LD50 .60 Biểu đồ 3.6 Hiệu bảo vệ chủng A.hydrophila đột biến M14 phương pháp tiêm 61 Biểu đồ 3.7 Tỉ lệ % cá chết tích lũy theo ngày sau ngâm phút 26oC chủng A hydrophila hoang dại AG1.4 chủng đột biến M14 63 Biểu đồ 3.8 Biểu đồ tỉ lệ sống cá thí nghiệm hiệu bảo vệ chủng A hydrophila đột biến M14 .64 v BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: “Tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến thử nghiệm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch cá Tra giống” Chủ nhiệm đề tài: ThS Vũ Thị Thanh Hương Nhóm thực hiện: ThS Vũ Thị Thanh Hương ThS Trương Ngọc Thùy Liên ThS Ngô Thị ích Phượng KS Lê Văn Hậu KS Trần Văn Hương TS Nguyễn Quốc Bình Cơ quan chủ trì: Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh Thời gian thực đề tài: 12/2013-12/2015 Kinh phí đƣợc duyệt: 000 000 (năm trăm hai mƣơi triệu đồng) Kinh phí cấp: 468.000.000 theo TB số: 361/TB-SKHCN ngày 23/12 /2013 TB số 302/TB-SKHCN ngày 23/12/2014 Mục tiêu: Theo đề cương uyệt) - Tạo chủng Aeromonas hydrophila nhược độc đột biến gen aroA - Hiệu bảo vệ chủng nhược độc thông qua số RPS (tỉ lệ sống cá)  60% Nội dung: Theo đề cương uyệt) 1- Phân lập chủng A hydrophila độc lực cao 2- Tạo chủng A hydrophila đột biến gen aroA phương pháp tái tổ hợp gen 3- Thử nghiệm độc lực in vivo chủng A hydrophila đột biến gen aroA phương pháp tiêm cá Tra giống 4- Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch làm vaccine 3.8 Kết thử nghiệm đánh giá hiệu bảo vệ chủng M phƣơng pháp ngâm Nồng độ c ng độc (ngâm): 1,26 106 CFU/ml Công độc cá tổng Nghiệm liều ban ngày ngày ngày ngày cá STT thức LD50 đầu 10 chết M14(1) M14(2) M14(3) có công độc DC1 DC2 DC3 DC4 DC5 DC6 có cơng độc % cá chết TB TB % cá STD cá chết sống 0% 29 0 0 0 0 0 0% 29 0 0 0 0 0 0% 27 0 0 0 0 0 0% 26 4 0 0 0 10 38% 3% 26 4 0 0 0 10 38% 30 0 0 0 13 43% 30 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0% 0 0 0 0 0 0% không 30 công độc 30 90 0% 0% 100% 40% 60% 0% 100% Kết so sánh tr nh tự đoạn O-antigen chủng độc lực cao công cụ Blast- NCBI Kết so sánh tr nh tự chủng AG với liệu genbank công cụ blast 91 Kết so sánh tr nh tự chủng BT với liệu genbank công cụ blast 92 4.3 Kết so sánh tr nh tự chủng TG với liệu genbank công cụ blast 93 4.4 Kết so sánh tr nh tự chủng AG 407 với liệu genbank công cụ blast 94 4.5 Kết so sánh tr nh tự chủng CT với liệu genbank công cụ blast 95 4.6 Kết so sánh tr nh tự chủng DT với liệu genbank công cụ blast 96 4.7 Kết so sánh tr nh tự chủng AG với liệu genbank công cụ blast 97 4.8 Kết so sánh tr nh tự chủng AG 4, BT , TG , AG 407 công cụ blast 98 4.9 Kết so sánh tr nh tự chủng DT , CT công cụ blast 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh [1] B Austin and D A Austin, Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish, vol 25 Springer Science & Business Media, 2007 [2] M ltarri a, S Merino, an R av n, “ polar lagella operon lg o Aeromonas hydrophila contains genes require or lateral lagella expression,” Mic …, 2003 [3] S A Palumbo, D R Morgan, and R L Buchanan, “In luence o Temperature, NaCI, and pH on the Growth of Aeromonas hydrophila,” J Food Sci., vol 50, no 5, pp 1417–1421, Sep 1985 [4] steve, iosca, an maro, “Virulence o Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water,” Dis Aquat Organ., 1993 [5] H Huizinga, sch, an T Hazen, “Histopathology o re ‐sore disease (Aeromonas hydrophila) in naturally and experimentally infected largemouth bass Micropterus salmoi es Lacepe e ,” J Fish Dis., 1979 [6] G Lio-Po, L l right, an Leaño, “ xperiments on virulence ose an portals of entry for Aeromonas hydrophila in walking cat ish,” J Aquat Anim …, 1996 [7] T Hazen and M Raker, “Ultrastructure of Red‐Sore Lesions on Largemouth Bass (Micropterus salmoides): Association of the Ciliate Epistylis sp and the Bacterium Aeromonas hydrophila*,” J …, 1978 [8] V Inglis, R J Ro erts, an N R romage, “ acterial iseases o ish.,” 1993 [9] Pathiratne, “ ssociation o Aeromonas hydrophila with epizootic ulcerative syn rome US o reshwater ish in Sri Lanka,” J A …, 1994 [10] S ngka, “The pathology o the walking cat ish, larias atrachus L , in ecte intraperitoneally with Aeromonas hydrophila,” Asian Fish Sci, 1990 [11] V urke, M ooper, an J Ro inson, “Hemagglutination patterns o Aeromonas spp in relation to iotype an source.,” J C i …, 1984 [12] J Jan a an P Du ey, “Mesophilic aeromona s in human isease: current taxonomy, la oratory i enti ication, an in ectious isease spectrum,” Rev Infect Dis., 1988 [13] K henghesh an S ei , “Isolation an haemolytic activity o Aeromonas species rom omestic ogs an cats,” … I fec Di , 1999 [14] M uimarães, “Aeromonas hydrophila vacuolating activity in the Caco-2 human enterocyte cell line as a putative virulence actor,” FEM …, 2002 100 [15] S allister an W gger, “ numeration an characterization of Aeromonas hydrophila and Aeromonas caviae isolate rom grocery store pro uce.,” Appl E vi …, 1987 [16] N Yucel, r em, an D Kaya, “Some virulence properties an characterization of motile Aeromonas species from milk and white cheese,” Int J d i y …, 2005 [17] H Daskalov, “The importance o Aeromonas hydrophila in oo sa ety,” Food Control, 2006 [18] J Plum , J rizzle, an J De igueire o, “Necrosis and bacterial infection in channel catfish (Ictalurus punctatus) following hypoxia 1,” J Wildl Dis., 1976 [19] H ang, K Ling, R e, an Y Sin, “ nhancement o protective immunity in blue gourami, Trichogaster trichopterus (Pallas), against Aeromonas hydrophila and Vibrioanguillarum by A hydrophila major,” J Fish Dis., 2000 [20] M Sautour, P Mary, N hihi , an J P Hornez, “The e ects o temperature, water activity and pH on the growth of Aeromonas hydrophila and on its su sequent survival in microcosm water,” J Appl Microbiol., vol 95, no 4, pp 807–813, 2003 [21] J llan an R M W Stevenson, “ xtracellular virulence actors o Aeromonas hydrophila in ish in ections,” Can J Microbiol., vol 27, no 10, pp 1114–1122, Oct 1981 [22] M Ya av, In ira, an nsary, “ ytotoxin ela oration y Aeromonas hydrophila isolate rom ish with epizootic ulcerative syn rome,” J Fish Dis., 1992 [23] J Vivas an arrace o, “ ehavior o an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine in water microcosms,” A …, 2004 [24] L To , “Toxin pro uction y strains o Aeromonas hydrophila grown in la oratory me ia an prawn pur e,” Int J Food Microbiol., vol 9, no 3, pp 145–156, Nov 1989 [25] L S To , J Har y, M Stringer, an artholomew, “Toxin production by strains of Aeromonas hydrophila grown in laboratory media and prawn pur e.,” Int J Food Microbiol., vol 9, no 3, pp 145–56, Nov 1989 [26] G Tsai, F Tsai, and Z Kong, “ ects o temperature, me ium composition, pH, salt and dissolved oxygen on haemolysin and cytotoxin production by Aeromonas hydrophila isolate rom oyster,” Int J Food Microbiol., 1997 [27] L Jaco s an H henia, “ haracterization o integrons and tetracycline resistance determinants in Aeromonas spp isolated from South African aquaculture systems,” Int J Food Microbiol., 2007 [28] L Vaughan, P Smith, an T oster, “ n aromatic-dependent mutant of the fish 101 pathogen Aeromonas salmonicida is attenuated in fish and is effective as a live vaccine against the salmoni isease,” Infect Immun., 1993 [29] C Hernanz Moral, E Flaño del Castillo, P López Fierro, A Villena Cortés, J Anguita Castillo, A Cascón Soriano, M Sánchez Salazar, B Razquín Peralta, an Naharro arrasco, “Molecular characterization o the Aeromonas hydrophila aroA gene and potential use of an auxotrophic aroA mutant as a live attenuate vaccine.,” Infect Immun., vol 66, no 5, pp 1813–21, May 1998 [30] M H Rahman, S Suzuki, an K Kawai, “ ormation o via le ut nonculturable state (VBNC) of Aeromonas hydrophila and its virulence in goldfish, arassius auratus.,” Microbiol Res., vol 156, no 1, pp 103–6, Jan 2001 [31] M T Ventura an J M rizzle, “Lesions associated with natural and experimental infections of Aeromonas hydrophila in channel catfish, Ictalurus punctatus Ra inesque ,” J Fish Dis., vol 11, no 5, pp 397–407, 1988 [32] K Nus aum an Morrison, “Edwardsiella ictaluri bacteraemia elicits shedding of Aeromonas hydrophila complex in latently infected channel catfish, Ictalurus punctatus Ra inesque ,” J Fish Dis., vol 25, no 6, pp 343–350, Jun 2002 [33] M Crumlish, P C Thanh, J Koesling, V T Tung, and K Gravningen, “ xperimental challenge stu ies in Vietnamese cat ish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), exposed to Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila,” J Fish Dis., vol 33, no 9, pp 717–722, 2010 [34] Shotts an R Rimler, “Me ium or the isolation o Aeromonas hydrophila.,” Appl Microbiol., vol 26, no 4, pp 550–3, Oct 1973 [35] R Seshadri, S W Joseph, A K Chopra, J Sha, J Shaw, J Graf, D Haft, M Wu, Q Ren, M J Rosovitz, R Madupu, L Tallon, M Kim, S Jin, H Vuong, O Stine, li, J Horneman, an J Hei el erg, “ enome sequence o Aeromonas hydrophila T 7966T: Jack o all tra es,” J Bacteriol., vol 188, no 23, pp 8272–8282, 2006 [36] H C Tekedar, G C Waldbieser, A Karsi, M R Liles, M J Griffin, S Vamenta, T Sonstegard, M Hossain, S G Schroeder, L Khoo, and M L Lawrence, “ omplete enome Sequence o a hannel at ish pi emic Isolate, Aeromonas hydrophila Strain ML09-119.,” Genome Announc., vol 1, no 5, pp 1–2, 2013 [37] J W Pri geon, D Zhang, an L Zhang, “ omplete enome Sequence o the Highly Virulent Aeromonas hydrophila AL09-71 Isolated from Diseased hannel at ish in West la ama.,” Genome Announc., vol 2, no 3, pp 9–10, 2014 [38] X Gao, J Jian, W.-J Li, Y.-C Yang, X.-W Shen, Z.-R Sun, Q Wu, and G.-Q hen, “ enomic stu y o polyhy roxyalkanoates pro ucing Aeromonas 102 hydrophila K4.,” Appl Microbiol Biotechnol., vol 97, no 20, pp 9099–109, Oct 2013 [39] H C Tekedar, A Karsi, A Akgul, S Kalindamar, G C Waldbieser, T Sonstegar , S Schroe er, an M L Lawrence, “ omplete enome Sequence of Fish Pathogen Aeromonas hydrophila AL06- 6,” Genome Announc., vol 3, no 2, pp 1–2, 2015 [40] J R Huddleston, J M rokaw, J Zak, an R M Jeter, “Natural transformation as a mechanism of horizontal gene transfer among environmental Aeromonas species.,” Syst Appl Microbiol., vol 36, no 4, pp 224–34, Jun 2013 [41] H engqing an Y Song, “ lectroporation-mediated transformation of Aeromonas hydrophila.,” Plasmid, vol 54, no 3, pp 283–7, Nov 2005 Tài liệu tiếng Việt Luận án Nghiên cứu kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila gây bệnh cá Tra (Pangasianodon Hypophthalmus) đồng sông Cửu Long Tác giả: Phạm Thanh Hương; Nguyễn Anh Tuấn Trường Đại học Cần Thơ, Xác định LD50 thử nghiệm Vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) cá ghép (Cyprinus carpio) Tác giả: Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thanh Phương Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học- Đại học Cần Thơ Bài báo Bùi Quang Tề; Lê Xuân Thành; Nguyễn Thị Biên Thu Kết nghiên cứu vacxin phòng bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng đốm trắng) cho cá Tra Tác giả: Nguồn: Tạp chí Thủy sản, 2006 Đặng Thị Hoàng Oanh , Đặc điểm sinh hóa kiểu ARN ribosom vi khuẩn Aeromonas spp phân lập từ bệnh phẩm thủy sản nuôi đồng sơng Cửu Long, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 5, 85-94 Phạm Công Hoạt, Phạm Thị Tâm, Lê Văn Nhương Xác định số độc tố gây bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) phân lập từ cá chép bị bệnh xuất huyết đốm đỏ khu vực đồng Bắc Bộ Tác giả: Nguồn: Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 2011 Phạm Công Hoạt Xác định đặc tính vi khuẩn Aeromonas hydrophola phân lập từ số loài cá nước bị bệnh xuất huyết đốm đỏ số tỉnh đồng Bắc Bộ Tác giả: Nguồn: Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 2012 103 Phạm Thanh Hương, Nguyễn Thiện Nam, Từ Thanh Dung Sự kháng kháng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila gây bệnh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) Đồng sông Cửu Long Tác giả: Nguồn: Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần Nguyễn Thị Hiền, Lê Hồng Phước Nghiên cứu di truyền học chủng Aeromonas hydrophila gây bệnh cá Tra Đề tài nghiên cứu cấp nhà nước Viện nuôi trồng Thủy sản II 104