TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21 TẠO CHỦNG Aeromonas hydrophila ĐỘT BIẾN NHƯỢC ĐỘC BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCK-OUT GEN aroA Trương Ngọc Thùy Liên*, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc Bình Trung tâm Cơng nghệ sinh học Hồ Chí Minh, *truongngocthuylien@gmail.com TĨM TẮT: Với mục tiêu phát triển vaccine kháng lại xâm nhiễm Aeromonas hydrophila cá, chủng A hydrophila đột biến tạo phương pháp knock-out gen aroA, gen mã hóa 5enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase Đoạn dài 683 bp gen thay gen kháng Kanamycin KmR tạo tổ hợp gen (cassette) aroA:KmR Chủng E coli Sm10λpir chứa vector pGP704 có mang cassette aroA:KmR sử dụng để tiếp hợp với A hydrophila hoang dã tạo chủng đột biến Độc lực chủng A hydrophila đột biến kiểm tra phương pháp tiêm vào cá tra giống Kết cho thấy LD50 chủng đột biến lớn 107 CFU/ml, chủng hoang dã có LD50 thấp 103 CFU/ml Như vậy, chủng M25 A hydrophila đột biến bất hoạt gen aroA có độc lực thấp nhiều (>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu Từ khóa: Aeromonas hydrophila, đột biến, knock-out gen, nhược độc, vaccine MỞ ĐẦU Trong bệnh thường gặp cá tra, bệnh nhiễm trùng huyết Aeromonas hydrophila gây thiệt hại thứ hai, sau bệnh gan thận mủ, tỷ lệ gây chết lên đến 80% Hiện nay, người nuôi cá tra chủ yếu sử dụng kháng sinh để chữa bệnh cho cá, để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh việc nghiên cứu tạo vaccine cần thiết Trong phương pháp tạo vaccine, phương pháp knock-out gen tạo vaccine sống nhược độc phương pháp phổ biến hữu hiệu Với chiến lược lựa chọn gen mục tiêu cho phương pháp knock-out gen, có hướng loại bỏ yếu tố gây độc gây đột biến khuyết dưỡng Trong đó, đột biến gen aroA đột biến khuyết dưỡng nhiều nghiên cứu lựa chọn Gen aroA mã hóa cho enzyme 5enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase, enzyme cần thiết cho sinh tổng hợp folate; dòng đột biến gen aroA bị độc tính khơng thể phát triển mơ khơng thể tự tổng hợp folate đồng thời khơng thể thu nhận folate từ bên [1] Thune et al (1999) [3] sử dụng phương pháp knock-out để tạo chủng E ictaluri đột biến gen aroA Vaughan (1993) [4] nghiên cứu độc tính Aeromonas salmonicida đột biến aroA cá hồi Atlantic (10 đến 15 g) kết nồng độ 106CFU dòng đột biến khơng gây chết cá dịng hoang dại gây chết 100% cá nồng độ Priebe et al (2001) [2] tạo đột biến loại bỏ gen aroA đối tượng Pseudomonas aeruginosa Dòng đột biến chứng minh nhược độc chủng qua đường mũi màng bụng chuột với liều lên đến 5.109 CFU không gây bệnh Moral et al (1998) [1] nghiên cứu gây đột biến khuyết dưỡng loại bỏ gen aroA làm độc tính vi khuẩn A hydrophila dùng vaccine cho cá hồi Kết tiêm với nồng độ 108 CFU/ml vào cá hồi, chủng đột biến khơng gây bệnh, đó, 50% LD dịng hoang dã 106CFU/ml Ngồi đặc tính nhược độc, dịng đột biến gen aroA cịn thể tính an tồn đưa mơi trường tự nhiên, điều chứng minh nghiên cứu Vivas et al (2004) [5], dịng đột biến có khả sống sót nước thấp so với dòng hoang dã không tồn lâu môi trường nuôi cá Từ vấn đề trên, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến gen aroA (GeneID: 4489425) nhược độc ứng dụng làm vaccine cho cá tra an toàn đưa môi trường tự nhiên VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng Aeromonas hydrophila hoang dã phân lập từ cá bệnh An Giang Vi khuẩn cấy môi trường RS (Rimler Shott) 15 Truong Ngoc Thuy Lien et al (HiMedia) môi trường đặc hiệu để phân lập A hydrophila Các dòng vi khuẩn thu nhận định danh cách giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal Cá tra ương nuôi từ giai đoạn nỗn hồng đến 7-10 g bể composite Trước tiến hành thử nghiệm, cá (n=10) kiểm tra diện A hydrophila cách cấy mẫu máu môi trường RS Tạo chủng A hydrophila nhược độc Tạo plasmid mang cassette aroA::KmR Đoạn đầu HaroA đoạn cuối TaroA gen aroA khuếch đại từ gen A hydrophila, gen kháng kháng sinh Kanamycin KmR khuếch đại từ pCAMBIA (Canada) cặp mồi (bảng 1), chuyển vào pJET1.2 Blunt (Fermentas) nhân dòng E coli DH5α (Invitrogen) Ba đoạn gen sau cắt nối với enzyme cắt hạn chế SacI, BamHI, XbaI (New England Biolabs) để tạo thành cassette aroA::KmR có thứ tự nối sau: HaroA-KmR-TaroA Cassette có vùng đầu cuối tương đồng với gen aroA, đoạn marker chọn lọc KmR Casstte chuyển vào plasmid pGP704 (Đại học Harvard) biến nạp E coli Sm10 λpir (Biomedal) Gen kháng Kanamycin dùng với mục đích knockout đoạn gen aroA đồng thời marker chọn lọc dòng đột biến tạo thành thí nghiệm Tuy nhiên, tính an tồn vi khuẩn biến đổi gen, tránh phát tán gen kháng kháng sinh môi trường tượng chuyển gen ngang, chủng đột biến sau tạo thành cần loại bỏ gen kháng Kanamycin nghiên cứu Đó lý cặp mồi khuếch đại gen KmR chèn thêm đoạn trình tự FRT 5’ GAAGTTCCTATT CtctagaaaGtATAGGAACTTC 3’ trình tự nhận biết hệ thống λ Red Recombinase Bảng Danh sách cặp mồi sử dụng trình tạo cassette S TT Tên mồi aroA -F1 aroA -R3 aroA -F3 aroA -R1 FKm RKm aroA_F4 aroA_R4 aroA_F5 aroA_R5 FpJET1.2 RpJET1.2 Gen HaroA TaroA Kanamycin (KmR) aroA aroA aroA aroA Trình tự 5’- AAGAGCTCTTGTGCCACCCGCAGTCTTGC -3’ 5’- AAGGATCCTTCACCGCGAAGCTGCG - 3’ 5’- AAGGATCCATGCGGCCATGACCATCG -3’ 5’- AATCTAGATCACGCGCGCTGACTGAT -3’ 5’AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATA GGAACTTCGGAATAGGAACTTCCCAGCCAGCCAA-3’ 5-’AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTC TCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATC CAGT-3’ 5’- GGAGCCGGTCAATCTGTTCC- 3’ 5’- CGGGGATGTGGTTCATGTCC- 3’ 5’- GCTGGTCAGCTTTATGGATGGC- 3’ 5’- ATCTAGCCCGCACGGGCAG- 3’ 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' Tiếp hợp E coli Sm10 λpir mang cassette (chủng cho) chủng A hydrophila hoang dã (chủng nhận) tăng sinh môi trường LB đến pha tăng trưởng (OD600=1), sau dịch tăng sinh bổ sung BSA mg/ml 10 mM MgSO4 Chủng cho chủng nhận trộn chung theo tỷ lệ 1: 9, đưa hỗn hợp lên màng nitrocellulose (Whatman) có đường kính 16 Enzyme cắt hạn chế SacI BamHI BamHI XbaI BamHI BamHI lỗ màng 0,45 µm Màng chuyển lên môi trường LB agar bổ sung BSA mg/ml 10 mM MgSO4 phủ lên LB agar loại, ủ 28oC, Vi khuẩn sau thu nhận, trộn dịch vi khuẩn (resuspension) cấy trải môi trường LB agar bổ sung kanamycin colistin, chọn lọc dòng A hydrophila mang cassette Các khuẩn lạc thu nhận kiểm tra kiểu gen PCR TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21 với trình tự gen aroA gen kháng kanamycin (AAF65337.1) công bố Genbank (khơng trình bày) chứng tỏ đoạn gen nhân dịng thành cơng Thử nghiệm độc lực Chủng đột biến hoang dã tăng sinh môi trường LB lỏng đến OD600 đạt 1,45 (khoảng 109 CFU/ml) Sinh khối vi khuẩn ly tâm 2.200 g 15 phút 4oC, sau trộn dịch vi khuẩn pha loãng NaCl 0,65% [3] Cá bố trí thí nghiệm bể plastic 100 lít, bể 10 cá Nồng độ vi khuẩn tiêm vào cá, chủng A hydrophila hoang dã 103, 104, 105, 106 CFU/ml, chủng đột biến 104, 105, 106, 107 CFU/ml, đối chứng âm tiêm nước muối 0,65% Mỗi công thức lặp lại lần Theo dõi ghi nhận số lượng cá chết tuần Các đoạn gen nối với theo thứ tự hình Cassette tạo thành chuyển vào vector pGP704 nhân dòng E coli Sm10λpir Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid nhân dịng với enzyme BglII (hình 2d) cho thấy tạo cassette nhân dịng thành cơng plasmid pGP704 E coli Sm10λpir KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tạo cassette mang gen aroA đột biến Kết nhân dịng đoạn HaroA (kích thước 354 bp), TaroA (kích thước 363 bp) kiểm tra cặp mồi FpJET1.2/RpJET1.2 cho sản phẩm kích thước 473 bp 482 bp; kết nhân dòng gen KmR (kích thước 1327 bp) trình bày hình 2A, 2B, 2C Các đoạn gen giải trình tự đối chiếu cho thấy có trùng khớp 99-100% A Hình Sơ đồ cassette cặp mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chủng A hydrophila đột biến B 7 500 bp C D kb kb 1500 bp 1000 bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% A: 2-6 Các dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET::HaroA, thang DNA, đối chứng(-); B: 15 Các dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET::TaroA Thang DNA, Đối chứng(-); C: Khuẩn lạc E coli DH5α chứa pJET::KmR, thang DNA, đối chứng (-); D: Kết cắt plasmid pGP704 chứa cassette với BglII, Thang DNA, pGP704 chứa cassette 17 Truong Ngoc Thuy Lien et al Tiếp hợp tạo chủng đột biến Do plasmid pGP704 có yếu tố di động mobRP4 cần thiết cho trình tiếp hợp, nhiên, mang vùng khởi đầu chép R6K nên để tự nhân lên tế bào, pGP704 cần có diện protein pi, mã hóa gen pir Do đó, pGP704 mang cassette aroA::KmR biến nạp vào E coli Sm10λpir, điều giúp kiểm soát việc tái tổ hợp cassette từ pGP704 vào gen A hydrophila Chủng E coli Sm10λpir mang cassette tiếp hợp với A hydrophila hoang dã để tạo chủng đột biến Trong trình tiếp hợp, nhờ vào mobRP4, plasmid pGP704 mang cassette đột biến từ tế bào E coli di chuyển vào tế bào A hydrophila Do có tương đồng HaroA TaroA với gen aroA, có trao đổi chéo tương đồng diễn cassette plasmid pGP704 gen aroA genome A hydrophila, kết gen aroA bị knock-out thay cassette Bên cạnh đó, A hydrophila khơng có gen pir nên pGP704 tự chép nhân lên hệ tế bào A B B C Hình Kết điện di gel agarose 1% sản phẩm PCR khuẩn lạc thu nhận sau tiếp hợp cặp mồi aroA-F1/R1 Giếng 2-12 hình A, B, C Các khuẩn lạc sau tiếp hợp; giếng 13 hình A, B, C Thang DNA; giếng hình A, B, C Đối chứng (-) Sau tiếp hợp, vi khuẩn cấy trải LB-kanamycin-colistin, kết thu 33 khuẩn lạc 33 khuẩn lạc PCR kiểm tra với cặp mồi aroA-F1/aroA-R1 khuếch đại gen aroA, với dịng hoang dã cho băng kích thước 1,4 kb, dịng đột biến cho băng kích thước khoảng 2,1 kb Kết điện di hình cho thấy, 18 có khuẩn lạc giếng 11 hình 3A giếng hình 3C cho băng có kích thước tương đồng với dịng đột biến dự kiến Hai dịng vi khuẩn, kí hiệu M10 M25, tiếp tục kiểm tra PCR với cặp mồi 16S-F/16S-R, aroA-F4/aroA-R4, aroA-F5/aroA-R5, FKm/RKm, F-pGP704/R- TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21 pGP704 hình kết trình bày hình Kết PCR dịng M10 M25 với cặp mồi 16S-F/16S-R, cho băng DNA kích thước 686 bp đặc hiệu cho A hydrophila (giếng 2, 3, hình 4A) Tương tự sử dụng cặp mồi aroAF1/aroA-R1 khuếch đại gen mục tiêu aroA, A D B M10 M25 (giếng 3, 4, hình 4B) cho băng có kích thước khoảng 2,1 kb tương đương với kích thước cassette chủng hoang dã (giếng 2, hình 4B) cho băng kích thước khoảng 1,4 kb Hơn nữa, sử dụng cặp mồi FKm/RKm kiểm tra diện gen KmR, dòng M10 M25 cho kết dương tính (giếng 3,4, hình 4E) Điều cho thấy có diện cassette M10 M25 C E F Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% A: M10; M25; 1.Thang DNA; A hydrophila hoang dã (+); Chứng (-); B: M10; M25; 5.Thang DNA; A hydrophila hoang dã (+); Chứng (-); C: M10; M25; 1.Thang DNA; A hydrophila hoang dã (+); Chứng (-); E: M10; M25; 5.Thang DNA; pGP704::cassette (+); Chứng (-); D: M10; M25; 5.Thang DNA; A hydrophila hoang dã (+); Chứng (-); F: M10; M25; Thang DNA; pGP704::cassette (+); Chứng (-) Đồng thời, sử dụng cặp mồi aroAF4/aroA-R4 khuếch đại đoạn gen aroA kích thước 683 bp, dòng dòng M10 M25 (giếng 2, 3, hình 4C) cho kết âm tính, dịng hoang dã (giếng 4, hình 4C) cho kết dương tính chứng tỏ dịng M10 M25, đoạn gen bị loại bỏ Bên cạnh đó, kiểm tra với cặp mồi aroAF5/aroA-R5 phía ngồi gen aroA, dịng M10 M25 (giếng 3, 4, hình 4D) cho băng DNA kích thước khoảng 2, kb lớn so với dịng hoang dã (giếng 2, hình 4D) có kích thước khoảng 1,7 kb Điều chứng tỏ vị trí gen aroA genome M10 M25, có đột biến knock-out đoạn DNA kích thước 683 bp thay gen KmR kích thước khoảng 1,3 kb Cuối cùng, cặp mồi F-pGP704/R-pGP704 đặc hiệu sử dụng để kiểm tra tồn plasmid pGP704, dòng M10 M25 (giếng 19 Truong Ngoc Thuy Lien et al 3, 4, hình 4F) cho kết âm tính, điều chứng tỏ plasmid pGP704 khơng tồn dịng vi khuẩn Những kết PCR kiểm tra cho thấy M10 M25 dòng A hydrophila đột biến bất hoạt gen (knock-out gen) aroA Đánh giá độc lực chủng đột biến gen aroA phương pháp tiêm Kết thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dã đột biến M25 trình bày bảng Chủng hoang dã tiêm vào cá với nồng độ 102, 103, 104, 105CFU/cá chủng đột biến tiêm với nồng độ 103, 104, 105 106 CFU/cá Kết với nồng độ 102 CFU/cá, chủng hoang dã gây chết 77% cá, chủng đột biến với nồng độ 104 CFU/cá không gây chết cá Chủng đột biến bắt đầu gây chết 30% cá nồng độ tiêm 105 CFU/cá 40% cá nồng độ tiêm 106 CFU/cá Cá chết có biểu bệnh có diện A hydrophila máu Rõ ràng kết cho thấy, chủng đột biến có độc lực thấp hơn 1.000 lần so với chủng hoang dã Bảng Kết thử nghiệm độc lực chủng A hydrophila hoang dã đột biến A hydrophila hoang dã A hydrophila đột biến Nồng độ tiêm 102 103 104 105 103 104 105 106 (CFU/cá) Cá chết (%) 77 83 85 95 0 30 40 Khi so sánh với kết Moral (1998) [1], LD50 dòng hoang dã 106 CFU/ml với dòng đột biến gen aroA, 108 CFU/ml chưa gây chết cá, có chênh lệch độc lực khoảng 100 lần dòng đột biến hoang dã Tuy nhiên, chủng A hydrophila hoang dã phân lập có độc lực cao (LD501.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu Tuy nhiên, cần đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch dòng đột biến kháng lại bệnh nhiễm trùng huyết hướng sử dụng làm vaccine TÀI LIỆU THAM KHẢO Moral C H., del Castillo E F., Fierro P L., Cortés A V., Castillo J A., Soriano A C., Carrasco G N., 1998 Molecular 20 Đối chứng (-) NaCl 0,65% characterization of the Aeromonas hydrophila aroA gene and potential use of an auxotrophic aroA mutant as a live attenuated vaccine Infect Immun., 66(5): 1813-1821 Priebe G P., Mary M B., Hatano K., Grout M., Fadie T C., Gerald B P., Joanna B G., 2001 Construction and characterization of a live, attenuated aroA deletion mutant of Pseudomonas aeruginosa as a candidate intranasal vaccine Virginia USA Thune R L., Fernandez D H., Battista J R., 1999 An aroA mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and efficacious as a live, attenuated vaccine J Aquat Anim Health, 11(4): 358-372 Vaughan L M., Smith P R., Foster T J., 1993 An aromatic dependent mutant of the fish pathogen Aeromonas salmonicida is attenuated in fish andis effective as a live vaccine against the salmonid disease furunculosis Infect Immun., 61: 21722181 Vivas J., Carracedo B., Riaño J., Razquin B E., López-Fierro P., Acosta F., Villena A J., 2004 Behavior of an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine in water microcosms Appl Environ Microbiol., 70(5): 27022708 TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 15-21 A STUDY ON CREATING AN ATTENUATED Aeromonas hydrophila MUTANT STRAIN BY KNOCKING OUT aroA GENE Truong Ngoc Thuy Lien, Vu Thi Thanh Huong, Tran Thanh Tieng, Nguyen Quoc Binh Biotechnology Center of Ho Chi Minh City SUMMARY In order to develop live attenuated vaccine against Aeromonas hydrophila infection in fish, Aeromonas hydrophila mutant strain was created by knocking out the aroA gene, encoding 5-enolpyruvylshikimate 3phosphate synthase A 683 bp middle fragment of this gene was replaced by kanamycin resistance gene KmR to make the cassette aroA::KmR The E coli Sm10 λpir strain carrying suicide pGP704 plasmid with aroA::KmR was used as donor in conjugation with A hydrophila wild type to create the mutant The toxicity of the mutant strain was determined by intra-peritoneal injection into Tra catfish fingerlings The results showed that the LD50 of the mutant strain was >107 CFU/ml, whereas that of the wild type strain was