Khảo sát tác dụng phòng ngừa sỏi tiết niệu của cao chiết từ quả chuối hột musa balbisiana colla

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHẢO SÁT TÁC DỤNG PHÒNG NGỪA SỎI TIẾT NIỆU CỦA CAO CHIẾT TỪ QUẢ CHUỐI HỘT (Musa balbisiana Colla) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Lý Hải Triều Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ KHẢO SÁT TÁC DỤNG PHỊNG NGỪA SỎI TIẾT NIỆU CỦA CAO CHIẾT TỪ QUẢ CHUỐI HỘT (Musa balbisiana Colla) (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 10/12/2020) Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Chủ nhiệm nhiệm vụ (Ký ghi rõ họ tên) (ký tên) Lý Hải Triều Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ TP HCM, ngày 30 tháng 10 năm 2020 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Khảo sát tác dụng hỗ trợ điều trị sỏi tiết niệu cao chiết từ Chuối hột (Musa balbisiana Colla) Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Lý Hải Triều Ngày, tháng, năm sinh: 07/11/1994 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ: Điện thoại: Tổ chức: 0838274377 Nhà riêng: Mobile: 0932046948 Fax: 0838292646 E-mail: lhtrieu12csh@gmail.com Tên tổ chức công tác: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Địa tổ chức: 41 Đinh Tiên Hoàng, P Bến Nghé, Q1, TP HCM Địa nhà riêng: 476/8B Lê Văn Lương, Ấp 3, Xã Phước Kiển, Huyện Nhà Bè, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Điện thoại: 02838230780 Fax: E-mail: khoahoctre@gmail.com Website: khoahoctre.com.vn Địa chỉ: Số 01 Phạm Ngọc Thạch, Phường Bến Nghé, Quận 1, TP HCM Họ tên thủ trưởng tổ chức: Đoàn Kim Thành Số tài khoản: 3713.0.1083277.00000 Kho bạc: Nhà nước Quận Tên quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Công nghệ TP HCM II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: 01/2019/HĐ – KHCNT – VƯ từ tháng 12 năm 2019 đến tháng 12 năm 2020 - Thực tế thực hiện: từ tháng 12 năm 2019 đến tháng 12 năm 2020 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 85 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 85 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: ……………….tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT … Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 5, 2020 42,5 10, 2020 25,5 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 5, 2020 42,5 10, 2020 25,5 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Ghi (Số đề nghị toán) 76,520380 8,479,615 Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 70,11 0460 Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH 70,110 460 70,11 0460 70,110 460 9,080 9,080 9,080 9,080 5,809 540 85 5,8095 40 85 5,809 540 85 5,8095 40 85 Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Nguyên vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Các văn hành trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban Tên văn TT hành văn Số 01/2019/HĐ- Hợp đồng thuê khoán KHCNT-VƯ, ngày 30 tháng 12 năm 2019 Ghi Tên công trình nghiên cứu khoa học: Khảo sát tác dụng hỗ trợ điều trị sỏi tiết niệu cao chiết từ Chuối hột (Musa balbisiana Colla) … Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* … - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Lý Hải Triều Tên cá nhân tham gia thực Lý Hải Triều Nội dung tham gia Viết thuyết minh đề cương Thực thực nghiệm hóa học, tác dụng in vitro dược lý Tổng kết, báo cáo Sản phẩm chủ yếu đạt Thuyế minh, báo cáo tổng hợp kết nghiên cứu Ghi chú* Lê Văn Minh Lê Văn Minh Cố vấn khoa học Hỗ trợ thực số thực nghiệm dược lý Các kết nghiên cứu Báo cáo tổng hợp Lâm Bích Thảo Lâm Bích Thảo Tham gia thực số thực nghiệm hóa học Hà Quang Hà Quang Tham gia thực Thanh Thanh số Các kết nghiên cứu thực nghiệm dược lý Lê Đức Thanh Lê Đức Thanh Các kết nghiên cứu Nguyễn Minh Nhật Nguyễn Minh Tham gia thực Các kết số nghiên cứu thực nghiệm thực vật học Nhật Tham gia thực Các kết số nghiên cứu thực nghiệm hóa học - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* … - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, (Nội dung, thời gian, TT địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) Báo cáo kết quả: Khảo sát tác Báo cáo kết quả: Khảo sát dụng hỗ trợ điều trị sỏi tiết niệu tác dụng hỗ trợ điều trị sỏi Ghi chú* cao chiết từ Chuối hột (Musa balbisiana Colla) Thời gian: 12-15/10/2020 Kinh phí: 4,9 triệu đồng Địa điểm: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM tiết niệu cao chiết từ Chuối hột (Musa balbisiana Colla) Thời gian: 12-15/10/2020 Kinh phí: 4,9 triệu đồng Địa điểm: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM … - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Thời gian (Bắt đầu, kết thúc Các nội dung, công việc - tháng … năm) chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế Thực tế đạt hoạch Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm 01/202001/2020vi học bột dược liệu Chuối 02/2020 02/2020 hột Xây dựng tiêu chuẩn sở đề nghị cho nguyên liệu Chuối hột Nội dung 2: Sàng lọc cao chiết 02/2020tiềm dựa hoạt tính ức 3/2020 chế hình thành tinh thể calci oxalat in vitro 02/20203/2020 Nội dung 3: Chiết xuất xây 4/2020dựng tiêu chuẩn sở đề nghị 5/2020 cho cao chiết tiềm từ Chuối hột 4/20205/2020 Người, quan thực Lý Hải Triều, Lê Văn Minh, Lâm Bích Thảo, Lê Đức Thanh, Nguyễn Nhật Minh Lý Hải Triều, Lê Văn Minh, Lâm Bích Thảo, Lê Đức Thanh, Nguyễn Nhật Minh, Hà Quang Thanh Lý Hải Triều, Lê Văn Minh, Lâm Bích Thảo, Nội dung 4: Đánh giá kiểm tra 6/2020hoạt tính ức chế hình thành tinh 7/2020 thể calci oxalat in vitro cao chiết tiềm 6/20207/2020 Nội dung 5: Khảo sát độc tính 8/2020cấp đường uống tác dụng 11/2020 dược lý cao chiết tiềm từ Chuối hột 6/20209/2020 Báo cáo tổng kết đề tài 9/202010/2020 11/202012/2020 Lê Đức Thanh, Nguyễn Nhật Minh Lý Hải Triều, Lê Văn Minh, Lâm Bích Thảo, Lê Đức Thanh, Hà Quang Thanh Lý Hải Triều, Lê Văn Minh, Lâm Bích Thảo, Lê Đức Thanh, Nguyễn Nhật Minh, Hà Quang Thanh Lý Hải Triều, Lê Văn Minh, Lâm Bích Thảo - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm Đơn tiêu chất lượng vị đo chủ yếu Cao chiết tiềm Gam từ Chuối hột với thông số kỹ thuật kèm theo - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số lượng 100 Theo kế hoạch 100 Thực tế đạt 325,28 Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Quy trình chiết xuất cao Quy trình ổn chiết tiềm định, khả thi, kinh tế, có độ tin cậy khoa học Tiêu chuẩn sở đề nghị Các số liệu, cho nguyên liệu cao hình ảnh đạt độ chiết từ Chuối hột dựa tin cậy khoa Dược điển Việt Nam học V Báo cáo tổng kết đề tài Các số liệu, Ghi Quy trình ổn định, khả thi, kinh tế, có độ tin cậy khoa học Các số liệu, hình ảnh đạt độ tin cậy khoa học Các số liệu, hình ảnh đạt độ hình ảnh đạt độ tin cậy khoa tin cậy khoa học học - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Bài báo Được chấp 02 chấp nhận đăng nhận đăng tạp tạp chí chuyên chí chuyên ngành ngành quốc tế quốc tế Tên sản phẩm Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà xuất bản) - 01 International Journal of Research in Pharceutical Sciences (Scopus) - 01 Pharmaceutical Sciences Asia (Scopus) - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) Thu hái Chuối hột Xử lý nguyên liệu theo tiêu chuẩn dược liệu Bột nguyên liệu khô Chuối hột Làm ẩm ethanol 45% 30 phút Dược liệu sau làm ẩm Nạp dược liệu vào bình, hệ thống chiết Chiết với ethanol 45% 60 phút 70-80 oC, tỷ lệ chiết 1: 20 (w/v) Thu dịch chiết Dịch chiết ethanol 45% Chuối hột Cô quay thu hồi dung môi 60-70 oC Cao chiết Xác định độ ẩm tính hiệu suất thu cao chiết Hình Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao chiết từ Chuối hột (M balbisiana Colla) 128 Phụ lục Tiêu chuẩn kiểm nghiệm đề nghị cho nguyên liệu khô Chuối hột TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỀ NGHỊ BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU TRUNG TÂM SÂM VÀ DƯỢC LIỆU TP HCM NGUYÊN LIỆU QUẢ CHUỐI HỘT SỐ: NGÀY CÓ HIỆU LỰC: ĐỐI TƯỢNG Quả Chuối hột (Musa balbisiana Colla), thu huyện Tân Thạnh, tỉnh Long An Mẫu dược liệu khô lưu giữ Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh (Mã số lưu mẫu: QCH-TTS-2020) A B C Hình Nguyên liệu Chuối hột (Musa balbisiana Colla) Quả Chuối hột tươi (A), Quả Chuối hột thái lát phơi sấy khô (B) bột nguyên liệu khô Chuối hột 129 YÊU CẦU KỸ THUẬT 2.1 Mô tả Quả mọng, to thẳng, có cạnh, thằng góc với trục, thịt nạc chứa nhiều hạt, hạt hình cầu 4-5 mm 2.2 Tính chất bột dược liệu Bột Chuối hột thơ có màu nâu, mùi hắc Mảnh vỏ màu nâu gồm tế bào hình chữ nhật xếp thành dãy, mô mềm thịt đa giác, mảnh vỏ hạt màu vàng cam gồm tế bào hình chữ nhật Nhiều hạt tinh bột hình chng, bầu dục đa giác nằm riêng lẽ hay kết thành khối, kích thước 20-50 µm Rốn hạt lệch tâm, bó mạch phân bố rải rác Mủ màu nâu kết thành khối nằm riêng lẻ 2.3 Mất khối lượng làm khơ Khơng q 13% 2.4 Tro tồn phần Khơng 7% 2.5 Tro không tan acid Không 0,7% 2.6 Định tính Phương pháp hóa học: Dịch chiết bột nguyên liệu cho phản ứng dương tính cho phản ứng với thuốc thử đặc trưng flavonoid: NaOH 10%, FeCl3 5%, Cyanidin, Pb(CH3COO)2 10% Sắc kí lớp mỏng: Xuất vết sắc ký đồ quan sát đèn tử ngoại bước sóng 365 nm sau phun thuốc thử AlCl3 2% HCl 5% ethanol (hệ dung môi n-hexan; ethyl acetat (7: v/v)) 2.7 Định lượng Hàm lượng polyphenol tổng: Xác định hàm lượng polyphenol tổng nguyên liệu theo chuẩn acid gallic phương pháp UV-Vis Hàm lượng polyphenol tổng không 30,5 mg/g (3,05%) tính theo dược liệu khô kiệt 130 Hàm lượng flavonoid toàn phần: Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần nguyên liệu theo chuẩn quercetin phương pháp UV-Vis Hàm lượng flavonoid tồn phần khơng 0,12 mg/g (0,012%) tính theo dược liệu khô kiệt PHƯƠNG PHÁP THỬ 3.1 Hình thức: Bằng cảm quan nguyên liệu phải đạt yêu cầu nêu 3.2 Mất khối lượng làm khô: Theo DĐVN V (Phụ lục 9.6, trang 203) 3.3 Tro toàn phần: Theo DĐVN V (Phụ lục 9.8, trang 204) 3.4 Tro không tan acid: Theo DĐVN V (Phụ lục 9.7, trang 203-204) 3.5 Định tính Phương pháp hóa học Cân g dược liệu cho vào bình erlen, thêm 50 mL dung dịch ethanol 45%, đun 80 oC Tập trung toàn dịch chiết được, tiến hành thực phản ứng hóa học đặc trưng cho flavonoid sau: - Phản ứng với NaOH 10%: Dịch phản ứng có màu đậm chuyển sang nâu đỏ - Phản ứng với FeCl3 5%: Tùy theo nhóm flavonoid tùy vào vị trí nhóm OH phân tử mà sau phản ứng cho dung dịch có màu xanh, xanh lục, xanh đen hay nâu - Phản ứng Cyanidin: Dung dịch flavonoid hay dịch chiết có chứa flavonoid sau thêm vào Mg nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau đến phút (có thể đem đun) dung dịch có màu đỏ cam, đỏ thẫm đỏ tươi - Phản ứng với Phản ứng với Pb(CH3COO)2 10%: Dịch phản ứng có tủa màu trắng Sắc kí lớp mỏng  Bản mỏng Silicagel 60F254  Hệ dung môi khai triển: n-hexan: Ethyl acetat (7: 3, w/v)  Phát hiện: Quan sát đèn tử ngoại bước sóng 365 nm sau phun thuốc thử AlCl3 2% HCl 5% ethanol  Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch thử: Cân g bột dược liệu, chiết siêu âm với ethanol 45% (3 lần × 50 mL) 10 phút Tập trung toàn dịch chiết đến cắn Cắn hịa với 30 mL nước cất, siêu âm cho tan hết cắn Dịch chiết nước lắc với diethyl ether (3 lần × 20 mL) Dịch chiết nước thu tiếp tục lắc với ethyl acetat 131 (3 lần × 20 mL) Dịch chiết ethyl acetat đến cắn cịn mL, tiến hành chấm sắc ký 3.6 Định lượng Định lượng polyphenol tổng Chuẩn bị mẫu thử: Cân g bột dược liệu, chiết kiệt với 250 mL methanol hệ thống shoxhlet Tập trung toàn dịch chiết, định mức đến 250 mL methanol Lấy 100 mL dịch chiết đến cắn Cắn hịa lỗng với methanol, lấy 200 µL dung dịch tiến hành qt bước sóng mẫu phản ứng khoảng 650-850 nm, xác định đỉnh hấp thu cực đại định lượng polyphenol mẫu Xây dựng đường chuẩn acid gallic: Cân mg acid gallic, định mức xác thành 10 mL nước cất dung dịch có nồng độ 100 µg/mL Từ dung dịch chuẩn này, hút vào bình định mức thể tích khác để dãy mẫu có hàm lượng acid gallic 10 µg, 20 µg, 30µg, 40 µg, 50 µg, 60 µg Thêm ml nước cất Lắc Cho vào bình định mức 0,5 mL thuốc thử Follin-Ciocalteu Lắc Để yên phút Thêm 1,5 mL Na2CO3 Thêm nước cất đến đủ 10 mL Để yên Sau tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 758 nm Bảng Mẫu phản ứng định lượng polyphenol tổng Bình định mức Hút từ dung dịch chuẩn (µL) 50 100 150 200 250 Hàm lượng acid gallic (µL) 10 20 30 40 50 Nước cất (mL) 6 6 6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thuốc thử Folin-Ciocalteu (mL) Lắc đều, để yên phút Dung dịch Na2CO3 20% (mL) Nước cất (mL) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,95 1,9 1,85 1,8 1,75 Lắc đều, để yên sau qt bước sóng 132 Tính tốn: Cơng thức tính hàm lượng polyphenol tổng (tính theo chuẩn acid galic) có g mẫu khơ xây dựng từ phương trình hồi quy y = ax + b (xét ý nghĩa phương trình): ( ⁄ )= ( − ) × × × 10 × × (1 − ℎ) Trong đó: m: khối lượng mẫu dùng (g) At: độ hấp thu mẫu thử h: khối lượng làm khô g mẫu a: hệ số trước x phương trình b: hệ số tự phương trình k: độ pha lỗng mẫu thử P (%): hàm lượng polyphenol tổng tính theo Dc: độ tinh khiết mẫu chuẩn chuẩn acid galic (mg/g) Định lượng flavonoid toàn phần Dung dịch thử: Cân g bột dược liệu, chiết kiệt với 250 mL methanol hệ thống shoxhlet Tập trung toàn dịch chiết, định mức đến 250 mL methanol Lấy 100 mL dịch chiết cô đến cắn Cắn hòa với 30 mL nước cất, siêu âm cho tan hết cắn Dịch chiết nước lắc với diethyl ether đến kiệt chất Dịch chiết nước thu tiếp tục lắc với ethyl acetat đến kiệt chất Thu dịch ethyl acetat, đến cắn Cắn hịa với methanol thu dung dịch thử A Mẫu quercetin chuẩn: Cân xác mg chất chuẩn quercetin, hịa tan ml MeOH, sau cho vào bình đựng mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ 10 mL, dung dịch chuẩn có nồng độ 100 μg/ml Sau pha lỗng thành hàm lượng: 10, 15, 20, 25, 30 (μg) Dựng đường chuẩn quercetin Mẫu chuẩn: Lấy xác mL dung dịch mẫu chuẩn pha cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm xác mL MeOH, lắc Mẫu thử: Lấy xác mL dung dịch A cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm xác mL MeOH, lắc Mẫu trắng: MeOH Tính tốn: Cơng thức tính hàm lượng flavonoid tồn phần (tính theo chuẩn quercetin) có g mẫu khơ xây dựng từ phương trình hồi quy y = ax + b (xét ý nghĩa phương trình) 133 ( ⁄ )= ( − ) × × × 10 × × (1 − ℎ) Trong đó: m: khối lượng mẫu dùng (g) At: độ hấp thu mẫu thử h: khối lượng làm khô g mẫu a: hệ số trước x phương trình b: hệ số tự phương trình k: độ pha lỗng mẫu thử F (%): hàm lượng flavonoid tồn phần tính Dc: độ tinh khiết mẫu chuẩn theo chuẩn quercetin (mg/g) Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Người đề nghị ThS Lý Hải Triều 134 Phụ lục Tiêu chuẩn kiểm nghiệm đề nghị cho cao chiết Chuối hột TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỀ NGHỊ BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU TRUNG TÂM SÂM VÀ DƯỢC LIỆU TP HCM CAO CHIẾT QUẢ CHUỐI HỘT SỐ: NGÀY CÓ HIỆU LỰC: ĐỐI TƯỢNG Nguyên liệu Chuối hột chiết với ethanol 45% phương pháp đun hồi lưu (tỷ lệ 1: 20, w/v), thu cao ethanol 45% từ Chuối hột (Musa balbisiana Colla) Mẫu cao chiết lưu giữ Trung tâm Sâm Dược liệu TP Hồ Chí Minh (Mã số lưu mẫu: CCH-TTS-2020) YÊU CẦU KỸ THUẬT 2.1 Tính chất Dạng cao đặc, màu vàng nâu sánh, vị nhạt, đắng, có mùi thơm đặc trưng 2.2 Mất khối lượng làm khô Khơng q 20% 2.3 Tro tồn phần Khơng q 14% 2.4 Định tính Phương pháp hóa học: Dịch chiết cao cho phản ứng dương tính cho phản ứng với thuốc thử đặc trưng flavonoid: NaOH 10%, FeCl3 5%, Cyanidin, Pb(CH3COO)2 10% Sắc kí lớp mỏng: Xuất vết sắc ký đồ quan sát đèn tử ngoại bước sóng 365 nm sau phun thuốc thử AlCl3 2% HCl 5% ethanol (hệ dung môi n-hexan; ethyl acetat (7: v/v)) 2.8 Định lượng 135 Hàm lượng polyphenol tổng: Xác định hàm lượng polyphenol tổng nguyên liệu theo chuẩn acid gallic phương pháp UV-Vis Hàm lượng polyphenol tổng khơng 152,7 mg/g (15,27%) tính theo dược liệu khơ kiệt Hàm lượng flavonoid toàn phần: Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần nguyên liệu theo chuẩn quercetin phương pháp UV-Vis Hàm lượng flavonoid tồn phần khơng 1,1 mg/g (0,11%) tính theo dược liệu khơ kiệt PHƯƠNG PHÁP THỬ 3.1 Hình thức: Bằng cảm quan nguyên liệu phải đạt yêu cầu nêu 3.2 Mất khối lượng làm khô: Theo DĐVN V (Phụ lục 9.6, trang 203) 3.3 Tro toàn phần: Theo DĐVN V (Phụ lục 9.8, trang 204) 3.4 Định tính Phương pháp hóa học Cân 1,5 g cao cho vào cốc, thêm 50 mL dung dịch ethanol 45%, đun 80 oC Tập trung toàn dịch chiết được, tiến hành thực phản ứng hóa học đặc trưng cho flavonoid sau: - Phản ứng với NaOH 10%: Dịch phản ứng có màu đậm chuyển sang nâu đỏ - Phản ứng với FeCl3 5%: Tùy theo nhóm flavonoid tùy vào vị trí nhóm OH phân tử mà sau phản ứng cho dung dịch có màu xanh, xanh lục, xanh đen hay nâu - Phản ứng Cyanidin: Dung dịch flavonoid hay dịch chiết có chứa flavonoid sau thêm vào Mg nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau đến phút (có thể đem đun) dung dịch có màu đỏ cam, đỏ thẫm đỏ tươi - Phản ứng với Phản ứng với Pb(CH3COO)2 10%: Dịch phản ứng có tủa màu trắng Sắc kí lớp mỏng  Bản mỏng Silicagel 60F254  Hệ dung môi khai triển: n-hexan: Ethyl acetat (7: 3, w/v)  Phát hiện: Quan sát đèn tử ngoại bước sóng 365 nm sau phun thuốc thử AlCl3 2% HCl 5% ethanol  Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch thử: Cân 1,5 g cao hòa tan với ethanol 45% siêu âm (3 lần × 50 mL) 10 phút Tập trung tồn dịch chiết đến cắn 136 Cắn hịa với 30 mL nước cất, siêu âm cho tan hết cắn Dịch chiết nước lắc với diethyl ether (3 lần × 20 mL) Dịch chiết nước thu tiếp tục lắc với ethyl acetat (3 lần × 20 mL) Dịch chiết ethyl acetat đến cắn cịn mL, tiến hành chấm sắc ký 3.6 Định lượng Định lượng polyphenol tổng Chuẩn bị mẫu thử: Cân 0,05 g cao hịa lỗng với methanol, lấy 200 µL dung dịch tiến hành quét bước sóng mẫu phản ứng khoảng 650-850 nm, xác định đỉnh hấp thu cực đại định lượng polyphenol mẫu Xây dựng đường chuẩn acid gallic: Cân mg acid gallic, định mức xác thành 10 mL nước cất dung dịch có nồng độ 100 µg/mL Từ dung dịch chuẩn này, hút vào bình định mức thể tích khác để dãy mẫu có hàm lượng acid gallic 10 µg, 20 µg, 30µg, 40 µg, 50 µg, 60 µg Thêm ml nước cất Lắc Cho vào bình định mức 0,5 mL thuốc thử Follin-Ciocalteu Lắc Để yên phút Thêm 1,5 mL Na2CO3 Thêm nước cất đến đủ 10 mL Để yên Sau tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 758 nm Bảng Mẫu phản ứng định lượng polyphenol tổng Bình định mức Hút từ dung dịch chuẩn (µL) 50 100 150 200 250 Hàm lượng acid gallic (µL) 10 20 30 40 50 Nước cất (mL) 6 6 6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thuốc thử Folin-Ciocalteu (mL) Lắc đều, để yên phút Dung dịch Na2CO3 20% (mL) Nước cất (mL) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,95 1,9 1,85 1,8 1,75 Lắc đều, để yên sau quét bước sóng 137 Tính tốn: Cơng thức tính hàm lượng polyphenol tổng (tính theo chuẩn acid galic) có g mẫu khơ xây dựng từ phương trình hồi quy y = ax + b (xét ý nghĩa phương trình): ( ⁄ )= ( − ) × × × 10 × × (1 − ℎ) Trong đó: m: khối lượng mẫu dùng (g) At: độ hấp thu mẫu thử h: khối lượng làm khô g mẫu a: hệ số trước x phương trình b: hệ số tự phương trình k: độ pha loãng mẫu thử P (%): hàm lượng polyphenol tổng tính theo Dc: độ tinh khiết mẫu chuẩn chuẩn acid galic (mg/g) Định lượng flavonoid toàn phần Dung dịch thử: Cân 0,5 g cao hịa tan hồn tồn với methanol siêu âm, dịch chiết cô đến cắn Cắn hòa với 30 mL nước cất, siêu âm cho tan hết cắn Dịch chiết nước lắc với diethyl ether đến kiệt chất Dịch chiết nước thu tiếp tục lắc với ethyl acetat đến kiệt chất Thu dịch ethyl acetat, đến cắn Cắn hịa với methanol thu dung dịch thử A Mẫu quercetin chuẩn: Cân xác mg chất chuẩn quercetin, hòa tan ml MeOH, sau cho vào bình đựng mức 10 ml, bổ sung MeOH vừa đủ 10 mL, dung dịch chuẩn có nồng độ 100 μg/ml Sau pha loãng thành hàm lượng: 10, 15, 20, 25, 30 (μg) Dựng đường chuẩn quercetin Mẫu chuẩn: Lấy xác mL dung dịch mẫu chuẩn pha cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm xác mL MeOH, lắc Mẫu thử: Lấy xác mL dung dịch A cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm xác mL MeOH, lắc Mẫu trắng: MeOH Tính tốn: Cơng thức tính hàm lượng flavonoid tồn phần (tính theo chuẩn quercetin) có g mẫu khơ xây dựng từ phương trình hồi quy y = ax + b (xét ý nghĩa phương trình) 138 ( ⁄ )= ( − ) × × × 10 × × (1 − ℎ) Trong đó: m: khối lượng mẫu dùng (g) At: độ hấp thu mẫu thử h: khối lượng làm khô g mẫu a: hệ số trước x phương trình b: hệ số tự phương trình k: độ pha loãng mẫu thử F (%): hàm lượng flavonoid tồn phần tính Dc: độ tinh khiết mẫu chuẩn theo chuẩn quercetin (mg/g) Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Người đề nghị ThS Lý Hải Triều 139 Phụ lục Dữ liệu lợi tiểu Na+ SL 22 22.5 23 21 24 23 Cl- C0,8g/kg C1,6g/kg Fur10mg/kg 23 25 42 22.8 24.6 46.2 24 23.2 44 24.5 34 41 29.2 23.7 24 35.9 47.6 33 39.8 SL 38 38.2 39.1 38.2 37.6 37 C0,8g/kg C1,6g/kg Fur10mg/kg 37.5 39 79 38.4 38.7 77.7 38.7 88 61.3 38 43.3 88.2 68.9 42.3 37.6 94.6 91.8 35.7 72.4 K+ SL 31.6 21.3 36 30.1 33 32.2 65.89 10.2 21.25 SL 2.5 0.65 0.6 2.2 0.6 2.2 2.1 0.5 C0,8g/kg C1,6g/kg Fur10mg/kg 32.4 31 43.6 34 32.1 52.3 33 35 56 32 34 38.1 33.5 30.9 66 32 71.62 52.2 82.03 62.68 75.19 92.8 78.24 Thể tích nước tiểu (ml) C0,8g/kg C1,6g/kg Fur10mg/kg 1.5 4.1 4.5 1.75 1.4 1.15 3.2 2.4 2.4 1.8 2 2.8 140 SL 184 179 230 215 239 200 227 190 214 Trọng lượng chuột C0,8g/kg C1,6g/kg Fur10mg/kg 257 218 218 284 210 228 200 313 210 206 265 245 185 175 285 200 244 235 242 203 176 218 202 Phụ lục Dữ liệu phòng sỏi SL BL 2.2 2.1 3.5 4.8 Thể tích nước tiểu (ml) BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 1.5 6.3 4.8 6.3 7.5 5.5 10 6.25 6.2 1.5 7.5 7.25 5.5 1.5 4.8 2.8 0.59 0.6 0.87 0.71 2.24 Calci nước tiểu BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 1.96 0.5 0.43 1.08 1.12 1.29 0.37 1.35 3.47 1.42 0.79 0.41 1.08 1.4 0.26 0.72 5.07 4.19 0.48 1.08 5.35 1.68 0.466 0.41 3.36 1.29 13.4 10.2 21.25 28.92 16.06 Phospho nước tiểu BL BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 58.21 48.55 61 29.39 55.39 34.78 53.16 51.11 55.34 40.04 26.25 25.28 28.04 51.75 38.95 42.8 42.37 30.71 25.13 29.39 14.78 28.18 53.6 33.16 33.25 SL BL SL SL BL 3.41 3.34 3.05 2.95 6.03 SL BL 2.63 2.51 2.14 2.35 2.69 Magie nước tiểu BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 2.88 13.04 3.46 1.54 1.14 15.63 7.17 9.58 2.12 6.51 2.02 9.21 1.6 5.98 7.74 1.27 1.44 8.18 6.39 1.54 1.94 12.02 5.57 4.63 1.49 8.12 4.63 Calci máu BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 2.55 2.39 2.3 2.45 2.47 2.34 2.56 2.5 2.27 2.34 2.67 2.19 2.61 2.42 2.74 2.5 2.62 1.76 2.68 2.37 141 2.27 2.36 2.45 SL BL 2.08 1.93 1.98 SL BL 12.4 10.9 12.4 8.5 10.8 SL BL 61.7 47.7 49.1 60.3 63.1 2.45 2.35 Phospho máu BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 1.98 1.7 1.47 1.94 2.05 2.37 1.57 2.2 2.25 1.67 2.16 1.71 2.32 1.99 1.39 2.07 2.25 1.52 2.02 1.8 2.12 2.08 1.78 1.94 1.98 1.99 Urea máu BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 14.7 16.7 11.4 16.2 12.1 12.3 10.4 14 11.1 10.4 7.4 12 15.5 12.6 11.3 14.7 7.9 13.3 13.4 12.5 11.8 8.3 9.5 13.3 Creatinin máu BL+C0,8g/kg BL+C1,6g/kg BL+NC2,5g/kg 63.1 68.7 61.7 62.9 63.1 62.9 59.8 64.5 71.5 67.1 57.3 55.4 58.9 62.9 45.7 65.9 63.1 62.7 65.9 65.7 64.5 65.7 56.1 55.2 64.5 71.5 58.6 64.1 Phụ lục Bài báo khoa học 142