Khảo sát tác động ức chế tyrosinase của các cao chiết từ lá tía tô perilla frutescens trên dòng tế bào hắc tố b16f10

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ TYROSINASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TƠ (PERILLA FRUTESCENS) TRÊN DÒNG TẾ BÀO HẮC TỐ B16F10 Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược – ĐH Y Dược TP HCM Chủ trì nhiệm vụ: PGS TS Huỳnh Ngọc Trinh Thành phố Hồ Chí Minh - 2022 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ TYROSINASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TƠ (PERILLA FRUTESCENS) TRÊN DÒNG TẾ BÀO HẮC TỐ B16F10 (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Huỳnh Ngọc Trinh Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) Thành phố Hồ Chí Minh- 2022 ) CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ., ngày tháng năm 200 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ TYROSINASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TƠ (PERILLA FRUTESCENS) TRÊN DỊNG TẾ BÀO HẮC TỐ B16F10 Thuộc lĩnh vực (tên lĩnh vực): Dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: PGS TS Huỳnh Ngọc Trinh Ngày, tháng, năm sinh: 06/10/1981 Nam/ Nữ: nữ Học hàm, học vị: PGS TS Chức danh khoa học: Giảng viên cao cấp Chức vụ: phó trưởng môn Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0907733259 Fax: E-mail: hntrinh@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: môn Dược Lý, khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM Địa tổ chức: 217, Hồng Bàng, quận 5, TP HCM Địa nhà riêng: Chung cư Hà Đô centrosa, quận 10 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM Điện thoại: 02838295641 Fax: Địa chỉ: 41, Đinh Tiên Hoàng, phường Bến Nghé, quận 1, TP.HCM Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 10 năm 2021 - Thực tế thực hiện: từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 04 năm 2022 - Được gia hạn (nếu có): từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 04 năm 2022 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 29,828 tr.đ, đó: Tên Khoa Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trường: 29,828 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: 0,0 tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) Ghi (Số đề nghị toán) … c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng Thực tế đạt 16,133 16,133 Nguồn khác 16,133 16,133 Nguồn khác 11,695 11,695 11,695 2,0 2,0 29.828 29.828 0 1,5 1,5 29.328 29.328 NSKH Tổng NSKH 11,695 0 - Lý thay đổi (nếu có): không tổ chức hội đồng tự đánh giá kết thực nên khơng sử dụng khoản kinh phí 500.000 đồng theo dự toán thuyết minh đề tài Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Khơng có Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân Tên cá nhân đăng ký theo tham gia Thuyết minh thực Huỳnh Ngọc Huỳnh Ngọc Trinh Trinh Nội dung tham gia Chủ nhiệm nhiệm vụ Cố vấn đề tài, định hướng theo dõi tiến độ thực đề tài Tổng hợp phân tích kết Viết báo cáo tổng Sản phẩm chủ yếu đạt Báo cáo tổng kết đề tài Bài báo khoa học Ghi chú* Nguyễn Thị Thùy Anh Nguyễn Thị Thùy Anh Nguyễn Quốc Thái Nguyễn Quốc Thái Đỗ Thanh Hảo Đỗ Thanh Hảo hợp kết đề tài Viết đề cương nghiên cứu Giám sát thực số nội dung nghiên cứu Thực phản ứng định lượng protein melanin Thực thí nghiệm theo định hướng nghiên cứu Hiệu cao chiết từ tía tơ Hiệu cao chiết từ tía tơ Hiệu cao chiết từ tía tơ - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Khơng có Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Khơng có Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục .của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Chiết xuất cao Tía tơ Thời gian thực từ ngày Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch 10/202012/2020 12/2020 01/12/2020 đến ngày 1/3/2021 Thử nghiệm MTT 01/202103/2021 01/202103/2021 Xác định hàm lượng melanin 04/202110/2021 04/20212/2022 Xác định hoạt độ tyrosinase 04/202110/2021 04/20212/2022 - Lý thay đổi (nếu có): Người, quan thực Nguyễn Thị Thùy Anh Đỗ Thanh Hảo Huỳnh Ngọc Trinh Đỗ Thanh Hảo Nguyễn Quốc Thái Đỗ Thanh Hảo Nguyễn Quốc Thái Đỗ Thanh Hảo III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Khơng có b) Sản phẩm Dạng II: Khơng có c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt trong tạp MedPharmRes chí Herbmed Pharmacology tạp chí chuyên ngành nước Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Journal of Herbmed Pharmacology 2022; 11(1): 48-54 (Q3) d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 0 0 Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp: Khơng có e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Khơng có Đánh giá hiệu đề tài mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: đề tài bước đầu xác định tác dụng ức chế tyrosinase, từ làm giảm hàm lượng melanin từ dòng tế bào hắc tố B16F10 cao chiết từ tía tơ, từ àm tiền đề cho nghiên cứu sâu in vivo để khẳng định tác động làm sáng da cao chiết tiềm b) Hiệu kinh tế xã hội: Kết đề tài góp phần cung cấp chứng khoa học cho việc sử dụng Tía tơ để làm sáng da phát triển sản phẩm chức từ Tía tơ Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra đề tài: Số TT I II Nội dung Thời gian thực Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Báo cáo tiến độ Lần … Báo cáo giám định kỳ Lần … Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình tạo sắc tố da 1.2 Một số thử nghiệm ức chế hoạt tính tyrosinase tổng hợp melanin in vitro 1.3 Dược liệu tía tơ CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất thuốc thử 2.2 Dụng cụ trang thiết bị 2.3 Dược liệu tía tơ 2.4 Thử nghiệm đánh giá tác động ức chế tổng hợp melanin 9 10 11 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 15 3.1 Thử nghiệm MTT 3.2 Xác định hoạt độ tyrosinase tế bào 3.3 Xác định hàm lượng melanin 3.4 Bàn luận 15 15 18 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Tài liệu tham khảo 22 23 ĐẶT VẤN ĐỀ Nám da bệnh phổ biến châu Á giới Nám thường khó điều trị ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng sống bệnh nhân Nám gây lắng đọng melanin mạn tính lớp biểu bì, đặc trưng hạt màu nâu khơng phân bố đối xứng khu vực tiếp xúc với ánh nắng mặt trời thể, đặc biệt khuôn mặt [1] Trong năm gần đây, có nhiều cơng trình nghiên cứu giúp hiểu rõ bệnh học yếu tố ảnh hưởng đến nám da Ngồi yếu tố kích hoạt gây nám da (tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, mang thai, hormon sinh dục, trình viêm, sử dụng mỹ phẩm, steroid, thuốc cản quang, thuốc chống trầm cảm) yếu tố di truyền [2],[3] Tỷ lệ nám phổ biến nữ/nam dao động từ 6/1 đến 39/1, cho thấy nữ có tỷ lệ nám cao sử dụng thuốc tránh thai, hormon trị liệu thay trình mang thai [4] Các nghiên cứu cịn cho thấy tỷ lệ nám da giảm đáng kể sau 50 tuổi, mãn kinh, q trình lão hóa làm giảm số lượng hoạt động tế bào sản sinh melanin [5] Việc điều trị nám thường kéo dài, chi phí cao chưa đạt hiệu mong muốn Một số thuốc trị nám bơi ngồi da chứa methimazol, hydroquinon, tretionin liệu pháp laser CO2 thử nghiệm mang đến nhiều kết khả quan [6] Tuy nhiên, sử dụng kéo dài biện pháp dẫn đến nhiều tác dụng không mong muốn dị ứng, ban đỏ, tăng sắc tố sau viêm thứ phát [7],[8] Do đó, nhu cầu phát triển nguồn thuốc an toàn, hiệu để điều trị nám việc cần thiết Ngày nay, thuốc có nguồn gốc dược liệu quan tâm nhằm phát huy tài ngun sẵn có cho tác dụng không mong muốn phải sử dụng thời gian dài Tía tơ (hay tử tơ, tử tơ tử, tô ngạnh) tên khoa học: Perilla frutescens (L.) Britton thuộc họ Hoa mơi Lamiaceae Tía tơ trồng khắp nơi Việt Nam để lấy ăn, làm gia vị làm thuốc Nhiều kinh nghiệm dân gian cho tía tơ có tác dụng trị nám, tàn nhang, tẩy trắng da, mụn nhọt [9] Một số nghiên cứu chứng minh cao chiết từ tía tơ có tác động ức chế tyrosinase, enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp melanin [10],[11] Do đó, đề tài nhằm đánh giá hiệu ức chế trình tổng hợp melanin cao chiết từ tía tơ dịng tế bào hắc tố B16F10 thông qua đánh giá hoạt tính enzyme tyrosinase định lượng hàm lượng melanin sau xử lý với cao chiết từ tía tơ so với chất đối chiếu acid kojic Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình tạo sắc tố da 1.1.1 Các tế bào sản sinh melanin Các tế bào sản xuất melanin thượng bì melanocyte (tế bào hắc tố) Các tế bào có nguồn gốc từ mào thần kinh phôi thai di cư đến thượng bì khoảng thời gian trước sinh Tại đây, melanocyte nằm ranh giới thượng bì trung bì Thân melanocyte có dạng hình bán cầu nằm hai tế bào lớp đáy Các melanocyte tạo thành mạng lưới mặt ranh giới thượng bì trung bì, chúng có mặt nang tóc nang lơng hoạt động theo chu kỳ phát triển lơng tóc [12] Sự phân bố melanocyte: tỷ lệ melanocyte tế bào thượng bì khác lớn vùng da khác cá thể Tỷ lệ cao thượng bì da đầu, da vùng mặt (1/4 đến 1/5) Ở thượng bì đùi cánh tay (1/10 đến 1/12) Thấp thân mình, trung bình có 1560 melanocyte/mm2 [13] Đơn vị melanin thượng bì: hệ thống tổ hợp đa tế bào bao gồm melacoyte tế bào tạo sừng cung cấp melanin Đơn vị melanin thượng bì đơn vị chức hình thái trình nhiễm sắc tố da Sự điều chỉnh nhiễm sắc tố da chịu tác động yếu tố môi trường yếu tố nội sinh [14] 1.1.2 Hình thái tế bào hắc tố Các melanocyte vùng thượng bì nằm lớp đáy, tế bào hình bán nguyệt hình dạng khơng xác định, bào tương sáng, chất nhân bắt màu đậm Từ mặt tế bào có sợi nhánh phân ly vào khe tế bào sừng thượng bì, chủ yếu lớp đáy lớp gai, bên melanocyte có chứa melanosom Trong bào tương, melanocyte có chứa nhiều ribosom tổ hợp ribosom Nhánh bào tương bào tương melanocyte sáng so với tế bào sừng xung quanh Nhân melanocyte khơng có hình dạng định, màng nhân gồ ghề Trong melanocyte chứa nhiều melanosom giai đoạn phát triển khác [15],[16] 1.1.3 Vai trò enzym tạo sắc tố Tyrosinase enzym chịu nhiệm q trình tổng hợp melanin Tyrosinase glycoprotein nằm màng melanosom gồm vùng bên trong, vùng xuyên màng vùng tế bào chất Đây loại enzym phụ thuộc vào đồng (Cu), xúc tác trình 2.4.2 Thử nghiệm MTT ❖ Nguyên tắc Thử nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng cao tía tơ trình tăng sinh tế bào B16F10 dựa đổi màu MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl2H-tetrazolium bromide) MTT (màu tím) chuyển thành formazan (màu vàng) enzym ty thể tế bào sống Lượng formazan hình thành tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống [27] ❖ Chuẩn bị thành phần phản ứng Đệm natri phosphat 0,1M pH 6,8: cân xác 3,982g NaH2PO4.2H2O 8,767g Na2HPO4.12H2O Lấy 450 mL nước khử khoáng vào becher 500 mL, cho NaH2PO4.2H2O khuấy đến muối tan hoàn toàn Cho tiếp Na2HPO4.12H2O khuấy muối hịa tan hồn tồn thành dung dịch suốt Dùng máy đo pH chuẩn dung dịch NaOH 1N để pH 6,8, sau cho vào bình định mức thêm nước khử khoáng vào vừa đủ 500 mL, bảo quản 2-8°C Thuốc thử MTT mg/mL : cân xác 50 mg MTT cho vào bình định mức 10 mL, thêm dung dịch đệm NaPi 0,1M pH 6,8 vừa tới vạch Votex đến tan hoàn toàn, bảo quản 2-8 °C Tiến hành Sau 24 tiếp xúc với cao hay acid kojic, cho 10 μL thuốc thử MTT với nồng độ mg/mL vào giếng tiếp tục ủ nhiệt độ 37 °C, 5% CO2 Sau giờ, hút bỏ môi trường giếng, hòa tan kết tủa formazan 100 μL DMSO đo độ hấp thu bước sóng 550 nm Mỗi mẫu tiến hành giếng lặp lại lần Ảnh hưởng cao (%) = (OD mẫu thử / OD mẫu đối chứng âm) × 100 2.4.3 Xác định hoạt độ tyrosinase tế bào ❖ Nguyên tắc Tyrosinase xúc tác hình thành dopachrom từ L-dopa Dopachrom sản phẩm trung gian trình hình thành melanin Dopachrom có màu đỏ cam có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 470 nm [27] 12 ❖ Chuẩn bị thành phần phản ứng Dung dịch L-DOPA 5mM: cân xác 9,98 mg L-DOPA, cho vào bình định mức 10 mL, thêm dung dịch đệm NaPi 0,1M pH 6,8 vừa tới vạch Lắc đều, siêu âm đến tan hoàn toàn thành dung dịch suốt Bảo quản 2-8 °C dùng ngày Thuốc thử Bradford: cân xác 2,5 mg Coomassie Brilliant Blue, hòa tan 2,5 mL methanol, thêm mL acid phosphric, cho vào bình định mức 10 mL chỉnh với nước cất vừa tới vạch Lắc đến tan hoàn toàn, cho vào chai màu, bảo quản 28 °C Dung dịch chuẩn BSA mg/mL: cân xác 10 mg BSA cho vào bình định mức 10 mL, thêm dung dịch đệm NaPi 0,1M pH 6,8 vừa tới vạch Lắc đến tan hoàn toàn thành dung dịch suốt Bảo quản 2-8 °C dùng ngày Xây dựng đường chuẩn BSA: pha loãng dung dịch chuẩn BSA thành dãy nồng độ từ -100 µg/mL với thuốc thử Bradford, ủ Đo độ hấp thu bước sóng 590 nm ❖ Tiến hành Sau 24 tiếp xúc với cao, hút bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào với 100 µL đệm NaPi pH 6,8 ly giải với 100 µL đệm chứa 1% Triton X-100 chứa 5mM EDTA Dung dịch tế bào sau ly giải, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút 15 phút 4°C Thu phần dịch nổi, định lượng protein từ xác định hoạt độ tyrosinase Định lượng protein: cho vào giếng 160 µL dịch 40 µL thuốc thử Bradford, ủ Sản phẩm sau phản ứng đo bước sóng 590 nm, nồng độ protein tính dựa vào đường chuẩn BSA Xác định hoạt độ tyrosinase: cho vào giếng hỗn hợp gồm 40 µg protein 100 µL L-DOPA 5mM tiếp tục ủ 37 °C Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 475 nm [28] Mỗi mẫu tiến hành giếng lập lại lần Hoạt độ tyrosinase (%) = OD mẫu thử/ OD mẫu đối chứng âm 2.4.4 Xác định hàm lượng melanin ❖ Nguyên tắc Melanin hòa tan NaOH 1N chứa 10% DMSO thành dung dịch có màu, hấp thu cực đại bước sóng 405 nm 13 ❖ Chuẩn bị thành phần phản ứng Dung dịch chuẩn melanin mg/mL: cân xác 20 mg melanin vào bình định mức 10 mL, thêm NH4OH 1N vừa đủ đến vạch Lắc đều, vortex đến tan hoàn toàn thành dung dịch đồng Bảo quản 2-8 °C dùng ngày Xây dựng đường chuẩn melanin : pha loãng dung dịch melanin chuẩn thành dãy nồng độ từ -100 µg/mL với mơi trường ni cấy tế bào Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 405 nm ❖ Tiến hành Sau 24 giờ, hút bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào với 100 µL đệm NaPi pH 6,8 ly giải với 200 µL NaOH 1N chứa 10% DMSO 80 °C Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 405 nm Hàm lượng melanin tính dựa vào đường chuẩn melanin [27] 14 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1 Thử nghiệm MTT Kết thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng cao tía tơ q trình tăng sinh tế bào B16F10 trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng cao lên trình tăng sinh tế bào Nồng độ (µg/mL) Phần trăm sống tế bào Cao EA Cao EA/CF 240 29,84 ± 0,23 31,56 ±0,54 120 32,11 ± 0,39 33,19 ± 1,78 60 33,23 ± 0,55 35,36 ± 1,08 30 34,04 ± 0,62 35,31 ± 1,15 15 34,36 ± 0,43 35,40 ± 1,67 7,5 34,56± 0,87 35,93 ± 1,37 Kết cho thấy cao tía tơ phân đoạn EA EA/CF ức chế đáng kể trình tăng sinh melanocyte Ở tất nồng độ khảo sát, phần trăm sống tế bào 50% so với nhóm chứng âm khơng có tiếp xúc với cao Ngồi khơng có khác biệt tác động ức chế nồng độ cao (p>0,05) khơng có khác biệt tác động ức chế tăng sinh tế bào hai cao (p>0,05) 3.2 Xác định hoạt độ tyrosinase tế bào Sau tiếp xúc với cao 24 Nồng độ protein tổng tính vào đường chuẩn BSA tương quan độ hấp thu nồng độ hình 3.1 Sau có nồng độ protein tổng, từ xác định hoạt độ tyrosinase, kết phần trăm hoạt độ tyrosinase tế bào sau tiếp xúc với cao tía tơ so với chứng âm trình bày bảng 3.2 15 Hình 3.1 Đồ thị tương quan độ hấp thu nồng độ BSA chuẩn Kết cho thấy cao phân đoạn EA EA/CF làm giảm hoạt độ tyrosinase rõ rệt Tác động ức chế tyrosinase tăng dần tăng nồng độ cao Bên cạnh đó, nồng độ khảo sát hoạt độ tyrosinase tế bào tiếp xúc với hai cao thấp so với acid kojic chúng tơi tiến hành xác định IC50 Bảng 3.2 Hoạt độ tyrosinase tế bào (% so với chứng âm) Nồng độ (µg/mL) % hoạt độ tyrosinase tế bào Cao EA Cao EA/CF 480 Acid kojic 44,68 ± 1,35 240 42,55 ± 1,48 43,31 ± 4,53 52,13 ± 0,53 120 46,81 ± 1,18 50,00 ± 1,62 58,52 ± 0,94 60 52,13 ± 0,66 53,19 ± 1,20 61,70 ± 1,44 30 59,55 ± 2,35 59,57 ± 2,23 68,09 ± 0,68 15 67,02 ± 2,54 68,09 ± 1,55 71,28 ± 1,82 7,5 71,22 ± 1,69 72,34 ± 0,35 ❖ Cao EA Đồ thị tương quan logC phần trăm ức chế tyrosinase cao EA trình bày hình 3.2 16 Hình 3.2 Đồ thị tương quan logC % ức chế tyrosinase cao EA Từ đồ thị tương quan logC % ức chế tyrosinase, suy phương trình hồi qui tuyến tính sau: y = 16,788x + 15,286 với R² = 0,9322 Từ phương trình tuyến tính, suy giá trị IC 50 cao EA 116,90 µg/mL ❖ Cao EA/CF Đồ thị tương quan logC phần trăm ức chế tyrosinase cao EA/CF trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Đồ thị tương quan logC % ức chế tyrosinase cao EA/CF Từ đồ thị tương quan logC phần trăm ức chế tyrosinase, suy phương trình hồi qui tuyến tính sau: y = 16,001x + 15,153 với R² = 0,956 Từ phương trình tuyến tính, suy giá trị IC 50 cao EA/CF 150,59 µg/mL 17 ❖ Đối chứng dương: acid kojic Hình 3.4 Đồ thị tương quan logC % ức chế tyrosinase acid kojic Từ đồ thị tương quan logC phần trăm ức chế tyrosinase, suy phương trình hồi qui tuyến tính sau: y = 17,670x + 6,2688 với R² = 0,9919 Từ phương trình tuyến tính, suy giá trị IC 50 acid kojic 298,46 µg/mL Tóm tắt khả ức chế tyrosinase cao EA, cao EA/CF đối chứng dương acid kojic trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Giá trị IC 50 cao acid kojic IC 50 (µg/mL) Cao EA 116,90 Cao EA/CF 150,59 Acid kojic 298,46 Như giá trị IC50 cao EA EA/CF thấp so với acid kojic chứng tỏ tác động ức chế tyrosinase mạnh hai cao Khơng có khác biệt tác động ức chế tyrosinase cao EA EA/CF 3.3 Xác định hàm lượng melanin Đồ thị tương quan nồng độ độ hấp thu dung dịch melanin chuẩn trình bày hình 3.5 18 Hình 3.5 Đồ thị tương quan nồng độ độ hấp thu dung dịch melanin chuẩn Từ đồ thị tương quan độ hấp thu nồng độ, suy phương trình hồi qui tuyến tính sau: y = 0,0069x + 0,0137 với giá trị R2 = 0,9928 Từ phương trình tuyến, suy hàm lượng melanin cao acid kojic so với đối chứng âm Kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Hàm lượng melanin (% so với chứng âm) Nồng độ (µg/mL) Hàm lượng melanin (% so với chứng âm) Cao EA Cao EA/CF 480 Acid kojic 52,41 ± 0,38 240 60,95 ± 3,44 55,79 ± 3,39(*) 65,01 ± 1,18 120 63,06 ± 0,73 60,58 ± 6,86 67,70 ± 1,38 60 66,11 ± 1,75 64,87 ± 6,81 70,85 ± 2,35 30 65,17 ± 5.92 62,04 ± 12,69 73,01 ± 3,00 15 71,23 ± 3,12 69,22 ± 8,22 74,75 ± 3,74 (*) p