Khảo sát tác động trị nám da của cao chiết từ lá tía tô perilla frutescens trên mô hình thỏ gây nám da bằng tia uv và progesteron

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRỊ NÁM DA CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TƠ (PERILLA FRUTESCENS) TRÊN MƠ HÌNH THỎ GÂY NÁM DA BẰNG TIA UV VÀ PROGESTERON Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: Ths Nguyễn Ngọc Phúc Chí Minh - 2022 Thành phố Hồ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRỊ NÁM DA CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ TÍA TƠ (PERILLA FRUTESCENS) TRÊN MƠ HÌNH THỎ GÂY NÁM DA BẰNG TIA UV VÀ PROGESTERON (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 05/05/2022) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) Nguyễn Văn B CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP HCM, ngày tháng năm 20 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Khảo sát tác động trị nám da cao chiết từ Tía tơ (Perilla frutescens) mơ hình thỏ gây nám da tia UV progesteron Thuộc lĩnh vực (tên lĩnh vực): Dược lý Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: NGUYỄN NGỌC PHÚC Ngày, tháng, năm sinh: 21/02/1991 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Thạc sĩ Chức vụ: Giảng viên Điện thoại: Tổ chức: (028) 38 295641 Mobile: 0946334909 Fax: E-mail: nnphuc@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Khoa Dược – Đại học Y Dược TP HCM Địa tổ chức: 41 Đinh Tiên Hoàng, P Bến Nghé, Q1, TP Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: Căn hộ B24.01, block B, chung cư Dragon Hill 1, 15A1 Nguyễn Hữu Thọ, Phước Kiển, Nhà Bè, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1): Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Điện thoại: (028) 38 295641 Fax: (028) 38 225435 E-mail: Website: ump.edu.vn Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hồng, P Bến Nghé, Q1, TP Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 10 năm 2021 Tên Khoa Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài - Thực tế thực hiện: từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 04 năm 2022 - Được gia hạn (nếu có): Được gia hạn Từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 04 năm 2022 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 29,9061 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học nhà trường: 29,9061 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 10/2020 11,275 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 12/2021 11,275 12/2020 11/2021 2,057 02/2022 2,000 Số TT 5,000 10/2021 0,800 12/2021 0,800 08/2021 12,4266 08/2021 12,4266 10/2021 0,2 12/2021 0,2 10/2021 0,2 Ghi (Số đề nghị tốn) Thanh tốn tiền mua hố chất (khơng khốn chi) Thanh tốn tiền mua thỏ (khơng khốn chi) Thanh tốn tiền mua thức ăn cho động vật thí nghiệm (khơng khốn chi) Chi khác: photo, in ấn tài liệu (khốn chi) Trả cơng lao động (khốn chi) Chi khác: điều tra thu thập số liệu (khoán chi) Chi khác: chi đánh giá, kiểm tra nội (khoán chi) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 12,4266 Tổng NSKH 12,4266 12,4266 12,4266 16,275 16,275 15,332 25,552 1,2 29,9016 1,2 29,9016 1,0 28,7586 1,0 28,7586 Nguồn khác Thực tế đạt Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): + Khơng sử dụng kinh phí cho khoản chi đánh giá, kiểm tra nội + Không sử dụng hết khoản chi cho nội dung mua nguyên, vật liệu lượng theo kế hoạch đề Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Nguyễn Ngọc Phúc Tên cá nhân tham gia thực Nguyễn Ngọc Phúc Huỳnh Ngọc Trinh Huỳnh Ngọc Trinh Sản phẩm chủ yếu đạt Chiết xuất cao, Thu cao gây mơ hình phân đoạn nám thỏ, đo ethyl acetat diện tích vết tía tơ đánh nám, đánh giá giá tác vi phẫu, định động điều trị lượng melanin nám da cao chiết Chiết xuất cao, Thu cao gây mơ hình phân đoạn nám thỏ, đo ethyl acetat diện tích vết tía tơ đánh nám, đánh giá giá tác vi phẫu, định động điều trị lượng melanin nám da cao chiết Nội dung tham gia Ghi chú* - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số Theo kế hoạch TT (Nội dung, thời gian, kinh phí, Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, Ghi chú* địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục .của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT 1.1 1.2 2.1 2.2 Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Nội dung Chiết xuất cao Công việc 1: thu cao tồn phần Cơng việc 2: thu cao phân đoạn Nội dung 2: Khảo sát tác động điều trị nám da cao Tía tơ Cơng việc 1: Thu lơ thỏ mơ hình Cơng việc 2: Diện tích vết nám, hình thái vi phẫu, hàm lượng melanin Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế hoạch đạt Người, quan thực 10/2020 – 11/2020 10/2020 – 11/2020 10/2020 – 11/2020 10/2020 – 11/2020 Nguyễn Ngọc Phúc Huỳnh Ngọc Trinh Nguyễn Ngọc Phúc Huỳnh Ngọc Trinh 12/2020 – 04/2021 05/2021 – 10/2021 12/2020 – 04/2021 10/2021 – 03/2022 Nguyễn Ngọc Phúc Huỳnh Ngọc Trinh Nguyễn Ngọc Phúc Huỳnh Ngọc Trinh - Lý thay đổi (nếu có): Ảnh hưởng dịch covid-19 III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Khơng có b) Sản phẩm Dạng II: Khơng có c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Bài báo khoa học Báo cáo Oral Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt MedpharmRes tạp chí chun ngành Khơng có báo khoa học chấp nhận đăng tạp chí quốc tế báo cáo oral HN KHKT Dược lần thứ 38 (04/2022) Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Pharmaceuti cal Science Asia - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ Đánh giá hiệu đề tài mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Đề tài chiết xuất cao chiết phân đoạn ethylacetat từ Tía tơ đánh giá tác động điều trị nám da cao chiết tía tơ 5% so với lơ sinh lý, lô chứng bệnh lô thuốc đối chứng dương mơ hình thỏ gây nám da tia UV progesteron b) Hiệu kinh tế xã hội: Kết đề tài nghiên cứu sơ làm tiền để để phát triển cao chiết Tía tơ thành sản phẩm dược mỹ phẩm điều trị nám da hiệu an tồn Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra đề tài: Số TT I II Nội dung Báo cáo tiến độ Lần Thời gian thực 04/2022 Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Báo cáo tình hình thực đề tài theo kế hoạch thuyết trình Báo cáo giám định kỳ Lần Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương – TỔNG QUAN Y VĂN 1.1 Tổng quan bệnh nám da điều trị 1.2 Tổng quan mơ hình gây tăng sắc tố da động vật thử nghiệm 1.2.1 Mơ hình gây viêm tăng sắc tố tia UV 1.2.2 Mơ hình gây tăng sắc tố hormon 1.2.3 Mơ hình gây tăng sắc tố thuốc 1.3 Tổng quan dược liệu cao Tía tơ Chương – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Động vật thí nghiệm: 2.2 Dược liệu phương pháp chiết xuất: 2.2.1 Thu hái 2.2.2 Phương pháp chiết xuất 2.2.3 Xác định độ ẩm bột dược liệu cao chiết EA 10 2.3 Hoá chất thuốc thử 11 2.5 Dụng cụ trang thiết bị 12 2.6 Đánh giá tác động cao EA mơ hình thỏ gây nám da tia UV progesteron 12 2.7 Đánh giá kết 13 2.7.1 Đánh giá cảm quan 13 2.7.2 Tách mẫu da thỏ 14 2.7.3 Khảo sát vi thể 14 2.7.4 Định lượng melanin 14 2.8 Xử lý số liệu 16 Chương – KẾT QUẢ 16 3.1 Chiết xuất cao 16 3.1.1 Cao toàn phần 16 3.1.2 Cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ Tía tơ 16 3.2 Tác động điều trị nám da cao Tía tơ 17 3.2.1 Thu lô thỏ mơ hình 17 3.2.2 Đánh giá kết điều trị nám da cao Tía tơ 18 3.2 Đánh giá vi thể 19 3.3 Định lượng melanin 20 Chương - BÀN LUẬN 21 Chương - KẾT LUẬN 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT HQ UV PIH HE IM EA Hydroquinon Tia cực tím Tăng sắc tố sau viêm Nhuộm hematoxylin – eosin Tiêm bắp Cao chiết phân đoạn ethylacetat tía tơ 10 phút ngày tiêm progesteron cách ngày liều 5mg/kg 28 ngày Lô thuốc chứng: Thỏ cạo lông vùng da lưng, chiếu tia UV 30 phút ngày, tiêm progesteron liều mg/kg cách ngày 28 ngày Vào ngày xuất vùng da tăng sắc tố, bôi HQ 4% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp lần/ngày đến ngày thứ 28 Lô điều trị: Thỏ cạo lông vùng da lưng, chiếu tia UV 30 phút ngày, tiêm progesteron liều mg/kg cách ngày 28 ngày Vào ngày xuất vùng da tăng sắc tố, bơi cao tía tơ 5% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp lần/ngày đến ngày thứ 28 Gây nám da thỏ: Thỏ cạo lông vùng da lưng Vào ngày thử nghiệm, thỏ cố định hộp thỏ chiếu UV 30 phút lên phần da lưng ngày Progesteron tiêm cách ngày với liều mg/kg Cách bôi cao Tía tơ: dùng que nhựa trải kem lên da chuột đến tồn phần da cạo lơng phủ lớp mỏng cao Tía tơ Đợi đến kem khô hẳn cho chuột trở lại lồng nuôi 2.7 Đánh giá kết 2.7.1 Đánh giá cảm quan Quan sát chụp hình vùng da cạo lông tuần: cố định thỏ hợp, khoảng cách từ máy chụp hình đến vùng da nám 15 cm Đánh giá cảm quan dựa tỷ lệ phần trăm nám tính dựa vào phần mềm MATLAB, ứng dụng có sẵn color Thresholder để đặt ngưỡng phân chia màu sắc nhiều không gian màu khác Hình chụp vùng da gây nám chuyển thành hình trắng/đen (trắng = da chưa nám đen = da nám) Dùng hàm regionprops để tính diện tích vùng nám theo đơn vị pixel, từ quy ra: Tỷ lệ % nám = số đơn vị pixel bị nám/tổng số đơn vị pixel vủa vùng gây nám 13 2.7.2 Tách mẫu da thỏ Cố định thỏ mâm, tiêm bắp (IM) gentamicin liều 12 mg/kg Lấy lượng vừa đủ thuốc tê Lidocain 2,5% thoa thấm hoàn toàn, để tiếp xúc 10 – 15 phút Lau thuốc tê dung dịch NaCl 0,9% Dùng dụng cụ cắt da với diện tích cm x cm, rửa dung dịch NaCl 0,9% lau khô giấy lọc Chia làm phần - Lấy ¼ phần da ngâm vào formol 10% để nhuộm HE - Lấy ¾ da cịn lại ngâm vào formol 10% 10 – 15 phút, cạo loại bỏ mô mỡ, rửa dung dịch NaCl 0,9% - Lau khô mẫu da, cân mảnh mô tiến hành định lượng melanin 2.7.3 Khảo sát vi thể Vào cuối thử nghiệm, dùng dụng cụ bấm da để tách phần da lưng (2 x cm) đối xứng qua xương sống, tách mỡ, mô liên kết bám da, rửa NaCl 0,9% lạnh Chia làm phần để phân tích hình thái tế bào định lượng melanin Da bảo quản formol 10%, cắt tiêu dày 2-3 mm, xử lý, nhuộm hematoxylin – eosin (HE) để phân tích vi thể khoa giải phẫu bệnh, bệnh viện Nhi Đồng 1, TP Hồ Chí Minh 2.7.4 Định lượng melanin Dựa theo phương pháp định lượng Watts KP cộng [34] 2.7.3.1 Xây dựng đường chuẩn melanin Chất chuẩn melanin 0,5 mg/ml: cân xác mg melanin, cho vào bình định mức 10 ml, thêm NH4OH 1N vừa đủ đến vạch Lắc đều, vortex đến tan hoàn toàn thành dung dịch đồng Bảo quản - 80C dùng ngày 14 Xây dựng đường chuẩn melanin: pha loãng dung dịch melanin chuẩn thành dãy nồng độ từ – 14 µg/ml với NaOH 0,1N nước cất Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 405 nm máy UV-vis 2.7.3.2 Phương pháp định lượng Chuẩn bị thành phần phản ứng Dung dịch MgCl2 5mM NaCl 0,5M: cân 2,96g NaCl, cho vào bình định mức 500 mL, thêm nước cất đến vạch Lắc tan hoàn toàn, thêm 0,23 g MgCl2 hoà tan thành dung dịch đồng Đệm Tris HCl 0,05M pH 8: cân xác 606 mg Tris HCl 2,922 g NaCl hoà tan 95 ml nước cất, khuấy tan hoàn toàn Dùng HCl điều chỉnh đến pH 8, cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch Bảo quản – 80C Dung dịch pronase mg/ml: cân xác 200mg pronase cho vào bình định mức 10 ml, thêm nước cất đến vạch Vortex tan hoàn toàn, bảo quản 2-80C dùng tuần Hút xác dung dịch pronase 20 mg/ml cho vơ bình định mức 10 ml, thêm Tris HCl 0,05M pH tới vạch, vortex tan hoàn toàn, pha dùng Tiến hành Nghiền đồng thể mảnh mô với ml nước cất, tráng dụng cụ nghiền với ml nước cất Chia dịch vào eppendorf, tráng cốc với ml nước cất Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút 15 phút, lấy tủa Thêm ml đệm NaPi 0,1 M pH 6,8 lắc ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút 15 phút, lấy tủa Kết tủa ngâm với chloroform: methanol (2:1) phút, hút bỏ dịch Sau đó, kết tử ngâm với ethanol: ether (3:1) phút, hút bỏ dịch để loại lipid Thêm ml dung dịch MgCl2 5mM NaCl 0,15M, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/15 phút, lấy tủa 15 Cho vào tủa dung dịch Pronase mg/ml pha đệm Tris HCl 0,05 M pH8 ủ hỗn hợp 48 300C, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút 15 phút, lấy tủa Thêm ml nước cất, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút 15 phút, lấy tủa Cho vào tủa 0,5 ml nước cất ml NaOH 0,1 N, đun cách thuỷ hỗn hợp 900C 90 phút Để nguội, ly tâm lấy dịch Đo độ hấp thu bước sóng 405 nm Hàm lượng melanin tính dưạ vào đường chuẩn với nồng độ – 14 µg 2.8 Xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm SPSS 20.0 Các giá trị biểu diễn dạng trung bình ± SEM (Standard Error of Mean) Sự khác biệt cặp lô, lô xác định phép kiểm T test Mann Whitney Khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 Chương – KẾT QUẢ 3.1 Chiết xuất cao 3.1.1 Cao toàn phần Từ 1900 g bột dược liệu Tía tơ chiết với ethanol 500 thu khối lượng cao toàn phần 206 gram đạt hiệu suất chiết 12,10% 3.1.2 Cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ Tía tơ Sau thu Cao tồn phần từ Tía tơ với hiệu suất chiết 12,10%, tiến hành lắc phân bố với dung môi phân cực ethylacetat thu cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ Tía tơ (EA) với khối lượng 35,5 gram đạt hiệu suất 2,24% Kết xác định phần trăm (%) khối lượng làm khô bột dược liệu cao trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Mất khối lượng làm khô bột dược liệu cao chiết Chỉ tiêu Độ ẩm (%) Lần Lần Lần Trung bình Bột dược liệu 10,54 10,48 10,51 11,00 ± 0,03 Cao toàn phần 10,23 10,34 10,41 10,33 ± 0,09 Cao EA 4,30 4,15 4,18 4,21 ± 0,08 16 Kết độ ẩm trung bình sau lần thực phương pháp khối lượng làm khô dược liệu 11% đạt tiêu chuẩn DĐVN V theo chun luận tía tơ, cụ thể: khơng q 13% Độ ẩm trung bình cao tồn phần cao EA sau thực lần không 20% đạt tiêu chuẩn DĐVN V 3.2 Tác động điều trị nám da cao Tía tơ 3.2.1 Thu lơ thỏ mơ hình 3.2.1.1 Khảo sát mơ hình thỏ gây nám da tia UV progesteron Các dấu hiệu cảm quan da thỏ giống British Giant thời gian 42 ngày với quy trình chiếu tia UV 30 phút/ngày kết hợp tiêm progesteron liều 5mg/kg cách ngày trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Dấu hiệu cảm quan thỏ gây nám da tia UV progesteron Ngày Dấu hiệu cảm quan Da nhẵn, trơn láng Da ửng đỏ Da đỏ, lớp biểu bì bong tróc 12 Xuất vùng nám lớp biểu bì 14 Vùng nám đậm, lan rộng 16 Vùng nám đậm tiếp tục lan rộng, kèm lông mọc thưa 20-28 Vùng nám đậm, lan rộng, kèm lông mọc dày 32 Vùng nám bắt đầu nhạt sắc tố đẩy lên lông 36-40 42 Vùng nám tiếp tục nhạt dần sắc tố đẩy lên lơng Da dày, lớp biểu bì khơng sắc tố Kết cho thấy vùng nám bắt đầu xuất sau 12 ngày thử nghiệm, đậm vào ngày thứ 14 tăng dần ngày 28 Sau đó, vùng nám nhạt dần Từ kết trên, nhóm nghiên cứu tiến hành chia thỏ thành lô để khảo sát tác động điều trị nám da cao Tía tô sau: 17 Lô sinh lý: Không chiếu UV cho uống nước cất suốt trình thử nghiệm Lô chứng bệnh: Chiếu tia UV 30 phút ngày tiêm progesteron cách ngày liều 5mg/kg 28 ngày Lô thuốc chứng: Chiếu tia UV 30 phút ngày, tiêm progesteron liều mg/kg cách ngày 28 ngày Vào ngày xuất vùng da tăng sắc tố, bôi HQ 4% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp lần/ngày đến ngày thứ 28 Lô điều trị: Chiếu tia UV 30 phút ngày, tiêm progesteron liều mg/kg cách ngày 28 ngày Vào ngày xuất vùng da tăng sắc tố, bơi cao tía tơ 5% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp lần/ngày đến ngày thứ 28 3.2.2 Đánh giá kết điều trị nám da cao Tía tơ 3.2.2.1 Tỷ lệ phần trăm diện tích vết nám Kết tỷ lệ phần trăm nám nhóm thử nghiệm trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Tỷ lệ % nám khảo sát tác động điều trị cao EA 5% Cao EA 5% HQ 4% Chứng bệnh Sinh lý (n=7) (n=10) (n=8) (n=8) 4.66 ± 1.93 3.27 ± 3.21 1.72 ± 2.01 8.78 ± 4.43 7.16 ± 4.51 Day 18.76 ± 5.57 * 14.01 ± 1.76 13.13 ± 5.38 * 90.09 ± 9.11( ) 7.62 ± 3.27 * * 81.85 ± 11.81( ) * 14 92.84 ± 4.49( ) 21 * 69.04 ± 13.16( ) 65.01 ± 19.53( ) 75.12 ± 21.84( ) 8.72 ± 4.92 28 33.54 ± 12.99(*,#) 37.61 ± 21.30(*,#) 56.31 ± 23.60(*) 9.16 ± 3.95 (*) p < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý (#) p < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bệnh Vào ngày thứ 7, vùng da thỏ tiếp xúc với tia UV ửng đỏ, lớp biểu bì bong tróc, da thỏ lơ sinh lý (khơng chiếu tia UV) bình thường q trình thử nghiệm Tiến hành điều trị vùng nám da thỏ cao 18 EA 5% kem HQ 4% vào thời điểm bắt đầu xuất đốm sắc tố ngày thứ 12 thử nghiệm.Vào ngày 14, vùng nám lô cao EA 5%, HQ, chứng bệnh mở rộng, đạt diện tích tối đa lơ khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê Từ ngày 21, vùng nám lô điều trị giảm rõ rệt, đặc biệt vào ngày thứ 28 Tỷ lệ phần trăm vùng nám nhóm điều trị cao EA 5% kem HQ 4% giảm 59,5% 44,2% vào ngày thứ 28 so với ngày thứ 14 thử nghiệm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bệnh Tuy nhiên, khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê lô cao EA 5% HQ 4% thời điểm khác thử nghiệm Hình 3.1 Quy trình xử lý ảnh dựa ứng dụng MATLAB Hình 3.1 Hình ảnh da thỏ xử lý thông qua ứng dụng MATLAB (a) Ảnh thô da lưng thỏ; (b) Hình ảnh khơng bị xóa hiệu ứng “bird eye”; (c) ảnh phóng to với độ phân giải 0,1 mm/pixel; (d) vùng ảnh sau phân chia ngưỡng màu sắv với màu trắng thể vùng không chứa sắc tố màu đen thể vùng có sắc tố 3.2 Đánh giá vi thể Trong điều kiện bình thường, hạt melanin phân bố rải rác lớp hạ bì da thỏ (A), sau tác động tia UV progesteron, số lượng hạt melanin tăng lên (B) bắt đầu co cụm thành đám hạt melanin (C) Phân tích vi thể vào ngày thứ 14 cho thấy phân bố hạt melanin lớp hạ bì vùng da tiếp xúc với tia UV dày đặc, tất vùng mức B C (Hình 3.2) Ngược lại, lơ sinh lý quan sát thấy rải rác vài hạt melanin suốt thí nghiệm Vào ngày 28, mật độ hạt melanin giảm đáng kể 19 phân bố thưa thớt lớp hạ bị vùng da thỏ nhóm điều trị cao EA 5% HQ 4% Mật độ hạt melanin nhóm điều trị tương đương thấp nhóm chứng bệnh có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.4) Hình 3.2 Sự phân bố melanin nang lơng lớp hạ bì da thỏ (A) Cấp độ 1; (B) Cấp độ 2; (C) Cấp độ Bảng 3.4 Mật độ hạt melanin lớp hạ bì da thỏ Lơ Ngày 14 Ngày 28 Cao EA 5% 2.83 ± 0.67 1.00 ± 0.37 (*) Kem HQ 4% 2.67 ± 0.21 1.17 ± 0.31 (*) Chứng bệnh 2.67 ± 0.21 2.17 ± 0.31 Sinh lý 0.75 ± 0.25 0.5 ± 0.29 (*) p < 0,05, so với lơ chứng bệnh 3.3 Định lượng melanin Hình 3.3 Đường chuẩn melanin Từ phương trình tuyến tính thể mối tương quan nồng độ melanin chuẩn độ hấp thu tương ứng y = 0,0564x + 0,0033 với giá trị R² = 0,993 (Hình 3.3), nồng độ melanin chiết xuất từ mảnh da nhóm thí nghiệm khác trình bày Bảng 3.5 20 Vào ngày 14, hàm lượng melanin vùng da tiếp xúc với tia UV tăng lên rõ rệt khơng có khác biệt đáng kể lơ chứng bệnh hai lô điều trị Bôi lên vùng nám cao EA 5% kem HQ 4% làm giảm nồng độ melanin 39,9% 43,2% so với lô chứng bệnh cuối thử nghiệm Hơn nữa, nồng độ melanin hai lô điều trị không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ sinh lý Bảng 3.5 Nồng độ melanin lô điều trị Ngày EA 5% HQ 4% Chứng bệnh Sinh lý 14 13.369 ± 0.744 13.966 ± 1.093 15.509 ± 0.064 5.438 ± 0.025 28 8.049 ± 0.681* 7.601 ± 0.931* 13.386 ± 1.533 7.778 ± 0.226 * p < 0,05, so với lô chứng bệnh Chương - BÀN LUẬN Quá trình tổng hợp Melanin bao gồm q trình hydroxyl hóa L-tyrosine thành DOPA, sau chuyển đổi thành DOPA-quinone Quá trình xúc tác phản ứng enzym tyrosinase Vì vậy, ức chế hoạt động tyrosinase làm giảm tổng hợp melanin [35] Nghiên cứu Hwang cộng khảo sát tác động ức chế tyrosinase ức chế sinh tổng hợp melanin 101 chất chiết xuất tế bào B16 cho thấy tác dụng Tía tơ điều trị nám da Tía tơ xem nguồn dược liệu đầy tiềm để sản xuất dược mỹ phẩm có công dụng làm sáng da da nhạy cảm với tia UV [28] Nghiên cứu in vitro trước cho thấy hiệu ức chế tyrosinase nấm EA5% dựa giá trị IC50 xấp xỉ acid kojic [33] Ngoài ra, nghiên cứu trước đánh giá hiệu điều trị cao chiết tồn phần Tía tơ tác động chống oxy hóa , tác dụng chống viêm ức chế khối u [29], [30], [36] Nghiên cứu thực mơ hình thỏ làm tăng sắc tố da cách cho tiếp xúc với tia UV tiêm progesteron Bức xạ UV giúp tăng cường hoạt hóa tế bào sắc tố, progesteron giúp khuếch đại hiệu ứng tia UV để làm tăng số lượng tế bào sắc tố thông qua số thụ thể hormon 21 steroid sinh dục lớp hạ bì biểu bì, đặc biệt lớp hạ bì Động vật chọn cho thí nghiệm thỏ British Giant, da thỏ cho đáp ứng với tia UV cách tăng hàm lượng melanin lớp biểu bì hạ bì [13] Nghiên cứu sử dụng phần mềm MATLAB để đánh giá cảm quan vùng nám da thỏ Cuối cùng, tiến hành thực việc định lượng hàm lượng melanin Việc đo hàm lượng melanin tạo từ tế bào sắc tố cần thiết để đánh giá hiệu loại thuốc, mỹ phẩm tiềm làm sáng da điều trị rối loạn sắc tố da [37] Nồng độ melanin xác định nhóm điều trị EA 5% so sánh với nhóm điều trị HQ 4%, chất ức chế tyrosinase tiếng [38] Kem HQ 4% chọn làm chất đối chứng chúng có đường dùng với cao EA 5% việc dùng chế phẩm dạng bơi ngồi da phương pháp điều trị nám da [39] Bên cạnh đó, phân tích mơ bệnh học cho thấy phân bố tế bào sắc tố suốt thí nghiệm Kết mơ bệnh học cho thấy số lượng lớn hạt melanin có tế bào sắc tố lớp hạ bì da thỏ, kết tương tự Forrest cộng [12] Nhìn chung, nghiên cứu chúng tơi bước đầu cho thấy kết đầy hứa hẹn cao chiết EA 5% điều trị rối loạn sắc tố Các thí nghiệm sâu dược phẩm mỹ phẩm có thành phần cao EA 5% nên lên kế hoạch để phát triển tương lai gần để góp phần phát triển sản phẩm có chứa chất làm sáng da tự nhiên an toàn hiệu quả, đặc biệt để điều trị nám da lâu dài Chương - KẾT LUẬN Mơ hình gây nám da chiếu tia UV 30 phút/ngày kết hợp tiêm progesteron liều mg/kg cách ngày cho thấy khác biệt rõ rệt lô chứng bệnh lô sinh lý Khảo sát tác động điều trị cho thấy tỷ lệ % nám cao EA 5% tương đương với lô điều trị HQ 4% vào ngày 14, 21, 28 Kết định lượng melanin da thỏ khơng có khác biệt cao EA 5% HQ 4% vào ngày 22 14 28 Mẫu da thỏ nhuộm HE khơng cho thấy có khác biệt cao EA 5% HQ 4% vào ngày 14, 28 Ngoài ra, thời điểm cuối thử nghiệm (ngày 28) nồng độ melanin lô điều trị với cao EA 5% kem HQ 4% không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ sinh lý TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Handel AC, Miot LD, Miot HA Melasma: a clinical and epidemiological review Anais brasileiros de dermatologia 2014; 89: 771-82 [2] Lee AY Recent progress in melasma pathogenesis Pigment cell and melanoma research 2015; 28(6): 648-60 [3] Saade DS, Maymone MB, De La Garza H, Secemsky EA, Kennedy KF, Vashi NA Trends in use of prescription skin lightening creams International Journal of Environmental Research and Public Health 2021; 18(11): 5650 [4] Nordlund JJ, Grimes PE, Ortonne JP The safety of hydroquinone Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2006; 20(7): 781-7 [5] Zolghadri S, Bahrami A, Hassan Khan MT, Munoz-Munoz J, GarciaMolina F, Garcia-Canovas et al A comprehensive review on tyrosinase inhibitors Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 2019; 34(1): 279-309 [6] Do TL Những thuốc vị thuốc Việt Nam Medical Publishing House 2015; 648 [7] Preedalikit W, Pintha K, Tantipaiboonwong P, Aunsri N, Vivattanaseth P, Mungmai L Inhibitory effect of Perilla frutescens L leaves extract on melanogenesis and skin whitening efficacy in the underarm whitening product application Key Engineering Materials 2020; 859: 166-171 [8] Mungmai L, Preedalikit W, Pintha K, Tantipaiboonwong P, Aunsri N Collagenase and melanogenesis inhibitory effects of Perilla frutescens pomace extract and its efficacy in topical cosmetic formulations Cosmetics 2020; 7(3): 69 23 [9] Handel, A C., Miot, L D B., & Miot, H A (2014) Melasma: a clinical and epidemiological review Anais brasileiros de dermatologia, 89(5), 771782 [10] Lee, A Y (2015) Recent progress in melasma pathogenesis Pigment cell & melanoma research, 28(6), 648-660 [11] Bộ Y tế (2015) Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh da liễu 285289 [12] Forrest, I S., Kosek, J C., Aber, R C., & Serra, M T (1970) Rabbit as a model for chlorpromazine-induced hyperpigmentation of the skin Biochemical pharmacology, 19(3), 849-852 [13] Flesch P Inhibitory action of extracts of mammalian skin on pigment formation Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1949;70(1):136-40 [14] Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., & Ansari, K M (2016) UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX- and iNOS through MAP kinases/NF-κB/AP-1 signalling pathways [15] Brun R, Laugier P [Guinea pig nipple as a model for the investigation of melasma (author's transl)] Dermatologica 1979;159(3):210-6 [16] Rieffers J, Maggiora A, Bujard E, Jadassohn W [Effect of contraceptive drugs on the guinea pig teat] Hautarzt 1970 Jan;21(1), pp 33-5 [17] LV, Gao-hong, Hui-qin XU, Pei-liang SHEN, Jing WANG, and Kai-yi ZHOU (2014) Effect and mechanism of Xiaozheng Wan for mouse melasma model Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2242 [18] Saunders, R N., Miya, T S., & Bousquet, W F (1970) Stimulation of DOPA-14C incorporation into melanoma tissue by chlorpromazine and reserpine Toxicology and Applied Pharmacology, 16(2), pp 434–441 24 [19] Murashov, M D., LaLone, V., Rzeczycki, P M., Keswani, R K., Yoon, G S., Sud, S., Rosania, G R (2018) The Physicochemical Basis of Clofazimine-Induced Skin Pigmentation Journal of Investigative Dermatology, 138(3), pp 697–703 [20] Banno, N., Akihisa, T., Tokuda, H., Yasukawa, K., Higashihara, H., Ukiya, M., & Nishino, H (2004) Triterpene acids from the leaves of Perilla frutescens and their anti-inflammatory and antitumor-promoting effects Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 68(1), 85-90 [21] Osakabe, N., Yasuda, A., Natsume, M., & Yoshikawa, T (2004) Rosmarinic acid inhibits epidermal inflammatory responses: anticarcinogenic effect of Perilla frutescens extract in the murine two-stage skin model Carcinogenesis, 25(4), 549-557 [22] Kwak, C S., Yeo, E J., Moon, S C., Kim, Y W., Ahn, H J., & Park, S C (2009) Perilla leaf, Perilla frutescens, induces apoptosis and G1 phase arrest in human leukemia HL-60 cells through the combinations of death receptor-mediated, mitochondrial, and endoplasmic reticulum stress-induced pathways Journal of medicinal food, 12(3), 508-517 [23] Lin, C S., Kuo, C L., Wang, J P., Cheng, J S., Huang, Z W., & Chen, C F (2007) Growth inhibitory and apoptosis inducing effect of Perilla frutescens extract on human hepatoma HepG2 cells Journal of ethnopharmacology, 112(3), 557-567 [24] Lin, E S., Chou, H J., Kuo, P L., & Huang, Y C (2010) Antioxidant and antiproliferative activities of methanolic extracts of Perilla frutescens Journal of Medicinal Plants Research, 4(6), 477-483 [25] Kwak, Y., & Ju, J (2015) Inhibitory activities of Perilla frutescens britton leaf extract against the growth, migration, and adhesion of human cancer cells Nutrition research and practice, 9(1), 11-16 25 [26] Jeon, I H., Kim, H S., Kang, H J., Lee, H S., Jeong, S I., Kim, S J., & Jang, S I (2014) Anti-inflammatory and antipruritic effects of luteolin from Perilla (P frutescens L.) leaves Molecules, 19(6), 6941-6951 [27] Makino, T., Nakamura, T., Ono, T., MUSO, E., & HONDA, G (2001) Suppressive effects of Perilla frutescens on mesangioproliferative glomerulonephritis in rats Biological and Pharmaceutical Bulletin, 24(2), 172-175 [28] Hwang, J H., & Lee, B M (2007) Inhibitory effects of plant extracts on tyrosinase, L-DOPA oxidation, and melanin synthesis Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 70(5), 393-407 [29] Nguyễn Thị Thanh Phương (2012), Khảo sát thành phần hoá học Tía tơ Luận văn dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh [30] Vưu Thanh Tú Quyên, Huỳnh Ngọc Thuỵ, Hà Minh Hiền, Huỳnh Ngọc Trinh Antitumor-Promoting Effect of Ethanolic Extract from Leaves of Perilla frutescens var crispa (Benth.) In Mouse Skin MedpharmRes 2019; 2(3) [31] Tống Minh Tâm, Đỗ Thị Phương Khanh, Huỳnh Ngọc Trinh Mơ hình viêm tai chuột nhắt dầu ba đậu - Khảo sát tác động kháng viêm cao chiết từ Tía tơ (Perilla frutescens L.,) Tạp chí Dược học 2015; 55(476):55-59 [32] Huỳnh Ngọc Trinh, Lê Thị Mưu Huỳnh, Phạm Quỳnh Hương, Huỳnh Ngọc Thuỵ Khảo sát hoạt tính chống oxy hố kháng acetylcholinesterase cao chiết từ Tía tơ Tạp chí Dược học 2019; 59(5) [33] Nguyễn Thị Hạnh Trúc, Nguyễn Thuỳ Dương, Võ Thị Diễm, Nguyễn Quốc Thái, Huỳnh Ngọc Trinh (2020), Khảo sát tác động ức chế tyrosinase chống oxy hố cao chiết từ Tía tơ Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 2020; 24(3): 94-99 26 [34] Watts KP, Fairchild RG, Slatkin DN, Greenberg D, Packer S, Atkins HL et al Melanin content of hamster tissues, human tissues, and various melanomas Cancer research 1981; 41(2): 467-72 [35] Chou TH, Ding HY, Lin RJ, Liang JY, Liang CH Inhibition of melanogenesis and oxidation by protocatechuic acid from Origanum vulgare (oregano) Journal of Natural Products 2010; 73(11): 1767-74 [36] Huynh NT, Le TMH, Pham QH, Huynh NT Study on phytochemical components and antioxidant property in vitro of the leaves of Perilla frutescens (L.) Britt gathered from various provinces of Vietnam Pharmaceutical journal 2019; 517(59): 47-50 [37] Chung S, Lim GJ, Lee JY Quantitative analysis of melanin content in a three-dimensional melanoma cell culture Scientific reports 2019; 28;9(1):1-9 [38] Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G Mechanism of inhibition of melanogenesis by hydroquinone Biochimica et Biophysica Acta (BBA)General Subjects 1991; 1073(1):85-90 [39] Giannotti B, Melli MC Current approaches to the treatment of melasma Clin Drug Invest 1995; (Suppl 2): 57–64 27