Khai thác khả năng phòng trừ sinh học của nucleophyhedrosis virus npv để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu khoang ăn tạp spodoptera litura hại rau đậu tại thành phố hồ chí minh

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Khai thác khả phòng trừ sinh học Nucleopolyhedrosis virus (NPV) để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) hại rau, đậu thành phố Hồ Chí Minh THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 6/ 2016 MỤC LỤC Trang DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT V THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT V DANH SÁCH BẢNG VI DANH SÁCH HÌNH VIII PHẦN MỞ ĐẦU 1 TÊN ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CứU NGỒI NƯớCVề LĨNH VựC LIÊN QUAN ĐếN Đề TÀI 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CứU TRONG NƯớC Về CÁC LĨNH VựC LIÊN QUAN ĐếN Đề TÀI 13 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.3 TạO CHế PHẩM NPV SLNPV 23 2.3.1 LựA CHọN CÁC LOạI THảO MộC CÓ KHả NĂNG BảO Vệ NPV KHỏI TÁC ĐộNG CủA CựC TÍM 23 2.3.2 ĐÁNH GIÁ HIệU LựC DIệT SÂU CủA SLNPV KHI PHốI TRộN VớI CHế PHẩM NEEM, ACID BORIC, MậT ĐƢờNG GồM THÍ NGHIệM NHỏ 24 2.3.3 PHƢƠNG PHÁP TINH SạCH NPV 26 2.3.4 LựA CHọN CHấT MANG VÀ PHụ GIA Để TạO CHế PHẩM NPV DạNG BộT 25 2.4 NGHIÊN CứU BIệN PHÁP BảO QUảN NPV 27 2.4.1 XÁC ĐịNH ĐIềU KIệN THÍCH HợP Để BảO QUảN SLNPV 27 2.4.2 BảO QUảN CHế PHẩM NPV 28 2.5 KHảO NGHIệM PHÒNG TRừ SÂU KHOANG HạI RAU, ĐậU BằNG CHế PHẩM SLNPV 29 2.5.1 THử NGHIệM TRÊN CÂY RAU CảI 29 2.5.2 THử NGHIệM TRÊN CÂY ĐậU PHộNG 31 ii CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 PHÂN LậP VÀ ĐịNH DạNG BằNG SINH HọC PHÂN Tử CÁC CHủNG SLNPV (NPV CủA SÂU KHOANG SPODOPTERA LITURA) ĐồNG THờI ĐÁNH GIÁ KHả NĂNG DIệT SÂU CủA CÁC CHủNG THU THậP ĐƯợC 33 3.1.1 PHÂN LậP CÁC CHủNG TạI NPV GÂY CHếT SÂU KHOANG GÂY HạI CÁC VÙNG RAU, ĐậU TạI THÀNH PHố Hồ CHÍ MINHVÀ CÁC VÙNG PHụ CậN 33 3.1.2 KếT QUả ĐịNH DANH CÁC MẫU THU THậP ĐƢợC 35 3.1.3 ĐÁNH GIÁ HIệU LựC DIệT SÂU CủA2 CHủNG NPV SLNPV1 VÀ SLNPV2 42 3.1.4 KHảO SÁT HIệU LựC TRừ SÂU CủA CHủNG SL NPV H2 TRÊN SÂU KHOANG CÁC TUổI 43 3.2 THIếT LậP QUY TRÌNH SảN XUấT SINH KHốI NPV IN VIVO 50 3.2.1 XÁC ĐịNH THÀNH PHầN THứC ĂN THÍCH HợP Để NI SÂU KÝ CHủ 50 3.2.2 XÁC ĐịNH TUổI SÂU VÀ NồNG Độ LÂY NHIễM THÍCH HợP TRONG SảN XUấT SINH KHốI SLNPV 52 3.2.3 ẢNH HƢởNG CủA NHIệT Độ ĐếN Sự NHÂN NHIễM NPV TRONG SÂU KHOANG 59 3.2.4 XÁC ĐịNH THờI GIAN THU NHậN SÂU CHếT 58 3.2.5 ẢNH HƢởNG CủA THờI GIAN LÂY NHIễM ĐếN Tỷ Lệ CHếT VÀ SảN LƢợNG NPV 66 3.3 TạO CHế PHẩM NPVSLNPV 67 3.3.1 LựA CHọN CÁC PHụ GIA CÓ NGUồN GốC THảO MộC Để BảO Vệ NPV KHỏI TÁC ĐộNG CủA TIA CựC TÍM 67 3.3.5 ẢNH HƢởNG CủA PHụ GIA VÀ CHấT MANG ĐếN HIệU LựC DIệT SÂU CủA NPV 70 3.3.2 ĐÁNH GIÁ HIệU LựC DIệT SÂU CủA SLNPV KHI PHốI TRộN VớI NEEM, ACID BORIC, MậT ĐƢờNG 73 3.3.3 ẢNH HƢởNG CủA VIệC PHốI TRộN VớI ACID BORIC VÀ Rỉ ĐƢờNG ĐếN HIệU LựC DIệT SÂU KHOANG CủA NPV 76 3.3.4 XÁC ĐịNH PHƢƠNG PHÁP TINH SạCH NPV 79 3.4 NGHIÊN CứU BIệN PHÁP BảO QUảN NPV 84 3.4.1 XÁC ĐịNH ĐIềU KIệN THÍCH HợP Để BảO QUảN SINH KHốI NPV 84 3.4.2 XÁC ĐịNH THờI GIAN BảO QUảN CHế PHảM NPV 86 iii 3.5 THựC NGHIệM QUảN LÝ SÂU KHOANG HạI RAU, ĐậU BằNG CHế PHẩM SLNPV 87 3.5.1 KếT QUả THử NGHIệM TRÊN CÂY RAU CảI 87 3.5.2 KHảO NGHIệM HIệU LựC TRừ SÂU CủA CHế PHẩM SLNPV TRÊN CÂY ĐậU PHộNG 96 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 4.1 KẾT LUẬN 98 4.2 ĐỀ NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT NPV SLNPV THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT NPV đa diện cư trú nhân tế bào (Nucleopolyhedrosis NPV) Nuclear polyhedrosis NPV gây chết sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) PIB Thể vùi (Polyhedral inclusion bodies) LT Thời gian gây chết (Lethal Time) LC Nồng độ gây chết (Lethal concentration) UV Tia cực tím (Ultraviolet) v DANH SÁCH BẢNG Bảng Kết thu thập tác nhân gây chết sâu khoang gây hại trồng 33 Bảng Đặc điểm chủng NPV thu thập 34 Bảng 3 Kết nhiễm lại chủng NPV số loài sâu ký chủ 35 Bảng Trình tự polh gene NPV thu thập TP HCM Bà Rịa Vũng Tàu 36 Bảng Kết so sánh trình tự polh gene amino acid polyhedrin protein số chủng NPV 39 Bảng Định lượng DNA NPV mẫu NPV từ hai nguồn phân lập 41 Bảng Giá trị LC50 chủng NPVSLNPV1 SLNPV2 sâu khoang43 Bảng Hiệu lực diệt sâu chủng SLNPV H2 44 Bảng Giá trị LT50 LT90 sâu tuổi nồng độ nhân nhiễm 45 Bảng 10 Giá trị LT50 LT90 sâu tuổi nồng độ nhân nhiễm 46 Bảng 11 Giá trị LT50 LT90 sâu tuổi nồng độ nhân nhiễm 494 Bảng 12 Giá trị LT50 LT90 sâu tuổi nồng độ nhân nhiễm 45 Bảng 13 Giá trị LT50 LT90 sâu tuổi 46 Bảng 14 Thời gian sống sâu khoang nuôi loại thức ăn nhân tạo 51 Bảng 15 Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng nhộng vũ hóa sâu khoang nuôi loại thức ăn nhân tạo 51 Bảng 16: Chi phí thức ăn cơng thức (tính sâu) 52 Bảng 17 Ảnh hưởng nồng độ nhiễm NPV đến tỷ lệ sâu chết 51 Bảng 18 Tỷ lệ sâu chết tuổi với nồng độ lây nhiễm khác 542 Bảng 19 Ảnh hưởng tuổi sâu nhiễm đến số lượng NPV sâu chết553 Bảng 20 Ảnh hưởng tuổi sâu nồng độ dịch NPV lây nhiễm đến sản lượng NPV 564 Bảng 21 Ảnh hưởng tuổi sâu đến hiệu sản xuất NPV sâu khoang575 Bảng 22 Ảnh hưởng nồng độ nhiễm tuổi sâu đến sản lượng NPV 586 Bảng 23 Ảnh hưởng nhiệt độ đến thời gian gây chết sâu khoang NPV 60 Bảng 24 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sản lượng NPV nhân lên thể sâu 61 Bảng 25 Ảnh hưởng nồng độ nhiễm đến lượng NPV nhân lên sân ký chủ 62 Bảng 26.Ảnh hưởng nồng độ nhiễm đến sinh trưởng NPV thể sâu khoang ký chủ 64 vi Bảng 27 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ chết sản lượng NPV 66 Bảng 28 Ảnh hưởng ánh nắng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu NPV sau 5h (từ sáng đến 14 chiều) phơi nắng trực tiếp 69 Bảng 29.Mật độ sâu đậu công thức vào thời điểm trước sau xử lý thuốc 7467 Bảng 30 Hiệu lực diệt sâu NPV công thức 69 Bảng 31 Hiệu lực diệt sâu NPV trộn với neem công thức 71 Bảng 32 Ảnh hưởng việc phối trộn Neem đến thời gian gây chết sâu khoang NPV 763 Bảng 33 Hiệu lực diệt sâu NPV công thức 74 Bảng 34 Giá trị LT50 LT90 cơng thức thí nghiệm 78 Bảng 35: Tổng vi sinh vật hiếu khí dịch NPV sau li tâm 80 Bảng 36 Số PIB hiệu lực trừ sâu dịch NPV chế độ li tâm 82 Bảng 37 Mật độ sâu đậu công thức vào thời điểm trước sau xử lý thuốc 82 Bảng 38 Hiệu lực diệt sâu dạng chế phẩm sau thời gian bảo quản nhiệt độ phòng 87 Bảng 39 Mật số sâu khoang sống nghiệm thức thí nghiệm 88 Bảng 40 So sánh mật số sâu khoang sốngtrên NTTN ngày sau phu0 89 Bảng 41 So sánh mật số sâu khoang sốngtrên NTTN ngày sau phun 89 Bảng 42 So sánh mật số sâu khoang sốngtrên NTTN ngày sau phun 90 Bảng 43 So sánh mật sâu khoang sốngtrên NTTN 14 ngày sau phun908 Bảng 44 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang chế phẩm NPV 92 Bảng 45 Năng suất rau cải NTTN 93 Bảng 46 Hiệu kinh tế nghiệm thức thí nghiệm 92 Bảng 47 Diễn biến mật độ sâu khoang nghiệm thức thí nghiệm 97 Bảng 48 Hiệu lực trừ sâu khoang thuốc thí nghiệm lần quan sát97 Bảng 49 Độc tính thuốc đậu phộng (cấp) 98 vii DANH SÁCH HÌNH Hình Kết điện di gel agarose đoạn gene khuếch đại PCRvới mồi đặc hiệu polh gene (750bp), A) chủng SLNPV H1, B) Chủng SLNPV H2 36 Hình 3.2 Cây phát sinh loài thiết lập theo giải thuật NJ (neighbor joining) xác định mối quan hệ SLNPV H1 SLNPVH2 với chủng NPV khác dựa trình tự amino acid polyhedrin protein 40 Hình 3 Trọng lượng sâu cơng thức vào ngày ni 51 Hình Biến thiên sản lượng NPV thể sâu bị nhiễm/chết nồng độ lây nhiễm 65 Hình Ảnh hưởng việc phối trộn neem đến khả diệt sâu NPV 75 Hình Hiệu lực diệt sâu, số PIB tổng vi sinh vật hiếu khí công thức 81 Hình So sánh tổng vi sinh vật hiếu khí, số PIB hiệu lực diệt sâu công thức li tâm so với đối chứng 83 viii PHẦN MỞ ĐẦU TÊN ĐỀ TÀI KHAI THÁC KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ SINH HỌC CỦA NUCLEOPOLYHEDROSIS NPV (NPV) ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC TRỪ SÂU KHOANG ĂN TẠP (SPODOPTERA LITURA) HẠI RAU, ĐẬU TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN THỊ HAI CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THỜI GIAN THỰC HIỆN 24 THÁNG KINH PHÍ ĐƢỢC DUYỆT: 550 triệu KINH PHÍ ĐÃ CẤP: 500 triệu THEO TB SỐ: TB-SKHCN ngày / / MỤC TIÊU Thu thập, tuyển chọn chủng Nucleopolyhedrosis NPV (NPV) thành phố Hồ Chí Minh để nhân sinh khối, tạo chế phẩm sử dụng phòng trừ sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) hại rau, đậu thành phố Hồ Chí Minh NỘI DUNG: 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ĐÃ ĐƯỢC DUYỆT Phân lập định danh sinh học phân tử chủng SLNPV (NPV sâu khoang Spodoptera litura) thành phố Hồ Chí Minh đồng thời đánh giá khả diệt sâu chủng thu thập Thiết lập quy trình sản xuất sinh khối NPV in vivo Tạo chế phẩm NPV SL NPV Nghiên cứu biện pháp bảo quản NPV Thực nghiệm mơ hình quản lý sâu khoang hại rau, đậu chế phẩm SLNPV 3.2.NỘI DUNG ĐÃ THỰC HIỆN (đối chiếu với hợp đồng ký) STT NỘI DUNG ĐƯỢC DUYỆT CÔNG VIỆC ĐÃ THỰC HIỆN Nội dung 1: Phân lập - Đã thu thập chủng NPV gây định danh sinh học chết sâu khoang ăn tạp phân tử chủng SLNPV Kết định danh sinh học phân (NPV sâu khoang tử cho thấy chủng có độ tương Spodoptera litura) thành đồng với chủng NPV sâu khoang phố Hồ Chí Minh đồng thời tác giả giới đánh giá khả diệt sâu Vì vậy, hai chủng đặt tên chủng thu thập SLNPV H1 SLNPV H2 đƣợc - Kết kiểm tra cho thấy, chủng có khả gây chết > 90% sâu khoang ăn tạp tuổi Nội dung Thiết lập quy - Đã xác định cơng thức thức ăn trình sản xuất sinh khối nhân tạo để nhân nuôi sâu khoang số NPV in vivo lượng lớn - Đã xác định tuổi sâu thích hợp để đưa vào sản xuất NPV đầu tuổi với nồng độ lây nhiễm 107 PIB/ml - Thu sâu chết có sinh khối NPV cao - Nhiệt độ 260C cho hiệu nhân snh khối tốt Nội dung Tạo chế phẩm - Đã xác định số loại thảo NPV SL NPV mộc có hiệu lọc tia cực tím tốt như: trà xanh, bã cà phê, ớt, rỉ đường - Trộn rỉ đường acid boric 0,5 – 1% có khả tăng hiệu lực trừ sâu 2A: 314,200,000,000 copies/ml 2B: 648,000,000,000 copies/ml 2C: 660,100,000,000 copies/ml TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 06 năm 2013 Trưởng phịng TS BS Phạm Hùng Vân 116 PHỤ LỤC QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SlNPV TRỪ SÂU KHOANG ĂN TẠP 1.1 Sản xuất sâu ký chủ 1.1.1 Nguyên vật liệu dụng cụ Nguyên vật liệu - Đậu trắng - Tinh bột mì - Agar - Ascorbic acid - Methyl paraben - Formalin - Mật ong Dụng cụ - Đĩa petri thủy tinh - Hộp nhựa nuôi sâu - Bông thấm nước - Chổi lông, pine 1.1.2 Phƣơng pháp nhân nuôi sâu ký chủ - Sâu giống Sâu giống nên thu bắt ngồi đồng ruộng khơng phun thuốc ni riêng cá thể hóa nhộng Nên nuôi riêng để tránh lây nhiễm trường hợp có cá thể sâu bị nhiễm virus đồng Khi sâu hóa nhộng, tiến hành xử lý nhộng formalin 5% vòng phút 117 Phân loại nhộng đực/cái cho vào hộp hộp miếng thấm nước để giữ ẩm cho nhộng thay bơng hàng ngày Đặt nhộng vào phịng tối khơng có phịng tối nên che hộp nuôi giấy tối màu - Ghép bướm: Sau – ngày nhộng vũ hóa bướm Tiến hành ghép cặp sau bướm vũ hóa Nên ghép theo tỷ lệ đực: Là 2:3 3:4 1:1 tùy theo lượng bướm đực: vũ hóa ngày Thức ăn cho trưởng thành: thức ăn cho trưởng thành mật ong nước đường 5% Dùng thấm nước, tẩm nước đường cho vào hộp nhỏ, để vào lồng ghép bướm Nên để 01 miếng thấm nước đun sôi để nguội miếng thấm nước đường vào hộp Thức ăn phải thay hàng ngày Dụng cụ ghép bướm bocal hộp giấy cao ≥40 cm để bướm bay lượn, giao phối Xung quanh bên hộp nên lót giấy để dễ lấy trứng Phịng ni bướm nên để tối - Thu trứng: Sau – ngày bướm đẻ trứng Tiến hành thu trứng hàng ngày cách dùng ống nghiệm nhẹ nhàng để bắt bướm, ống nên chứa 01 bướm đậy lại nút - Nhanh chóng cho bướm vào lồng thả trở lại vào lồng cũ sau gỡ giấy để cắt trứng dán giấy Dùng kéo cắt nhẹ nhàng ổ trứng cho vào đĩa petri hộp nhựa nuôi sâu 118 - Xử lý trứng: Cho ổ trứng vào dung dịch formalin 5% vòng phút, lấy rửa lai nước đun sôi để nguội để tránh lây nhiễm virus từ thể bướm mẹ Để khô trứng quạt - Ấp trứng: Trứng thu để chung ngày vào hộp Sau 36h (trong điều kiện nhiệt độ 27-300C), tức chiều vào ngày hôm sau, cho trứng xử lý vào hộp thức ăn Chú ý, đặt trứng nắp hộp úp hộp thức ăn lên nắp hộp Tránh cho trứng trực tiếp lên bề mặt thức ăn Đến đêm, trứng nở, sâu tự bò lên thức ăn để ăn - Nuôi sâu Dụng cụ nuôi sâu: sử dụng nhiều loại dụng cụ để ni sâu Đối với sâu khoang, chúng có tập tính sống tập thể ăn thịt nên ni chung hộp Đối với sâu tuổi nhỏ nên để 01 ổ trứng/hộp Khi sâu đến cuối tuổi 2, mật độ cao tách thành nhiều hộp khác Kinh nghiệm cho thấy, với hộp ni có kích thước 22cm x 14 cm sâu đến cuối tuổi nên sang khoảng 30 sâu/hộp Thức ăn nuôi sâu Bảng: Thành phần thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang ăn tạp Thành phần Số lượng Đậu trắng 400g Agar 8g Tinh bột 60g Men mì 60g Ascorbic acid 6g Methyl – paraben 3,8g Sorbic acid 2g Formalin 4ml 119 Nước cất 400ml Trong q trình ni chọn hộp có sâu lớn đều, khỏe để làm giống Phịng nuôi sâu nên che bớt ánh sáng sâu ăn nhiều nhanh lớn 1.2 Sản xuất virus - Tuổi sâu: Tuổi sâu nhiễm tốt đầu tuổi Tuy nhiên, trường hợp có hộp sâu ăn nhiều, hết thức ăn sâu đầu tuổi cuối tuổi linh động tiến hành lây nhiễm để đỡ công thay sâu sang hộp thức ăn phải giảm nồng độ dịch nhiễm so với sâu đầu tuổi - Nồng độ dịch nhiễm: Nồng độ dịch nhiễm thích hợp khoảng x 107PIB/ml, tức 1sâu chết/100ml phun ướt lên bề mặt thức ăn - Thức ăn để lây nhiễm: Thành phần thức ăn nhân tạo sử dụng cho lây nhiễm tương tự nuôi sâu không bổ sung formalin - Phương pháp lây nhiễm: Đổ thức ăn vào hộp nuôi sâu thức ăn nguội Thức ăn nên đổ mỏng đủ cho sâu ăn vịng ngày Đối với hộp có kích thước 22 cm X 14 cm nên đổ 10- 15ml đủ để 20 - 30 sâu ăn vòng ngày Dịch NPV cho vào bình tia phun lên thức ăn nguội hộp để để nhiệt độ phịng cho khơ Tiến hành cho sâu vào hộp thức ăn nhiễm dịch nuôi vòng ngày Sau sâu ăn hết thức ăn nhiễm dịch, tiến hành chuyển sâu sang thức ăn mới, không nhiễm dịch Hộp thức ăn nên đổ dày khoảng 25 ml để sâu đủ ăn chết Có thể đổ thức ăn tráng bề mặt hộp cắt thành miếng để rãi rác hộp cho sâu ăn - Thu sâu chết: Từ ngày thứ sau nhiễm trở đi, tiến hành theo dõi hộp sâu nhiễm Mỗi ngày nên kiểm tra lần để thu sâu kịp thời, tránh để sâu chết bị rã vừa virus vừa dễ bị lây nhiễm vi sinh vật khác 120 - Thu sâu để tạo nguồn virus mới: Sâu chết cho vào lọ có bổ sung nước cất với tỷ lệ sâu/1ml để nhiệt độ phòng cho sâu vỡ Lọc sâu qua lớp vải mỏng để loại bỏ xác sâu tiến hành li tâm tốc độ 1500 vòng/phút vòng 10 phút, bỏ phần lắng, lấy dịch li tâm lần, lần với 500 vòng/phút vòng phút loại phần cặn, lấy dịch lần với tốc độ 5000 vòng/phút, bỏ dịch trong, lấy phần cặn - Trong trường hợp sản xuất hộ gia đình, cần thu sâu chết cho vào lọ tối màu có bổ sung ml nước đun sơi để nguội/sâu để 01 ngày nhiệt độ phòng cho sâu chết vỡ Dùng vải mỏng, loại bỏ xác sâu dùng dịch để phun trực tiếp lên đồng - Bảo quản virus: Cho dịch virus li tâm sâu chết vào tủ đá giữ vịng năm 121 SẢN XUẤT SÂU CHỦ Ni sâu giống phịng thí nghiệm (thức ăn tự nhiên) NPV giống Sản xuất lƣợng lớn sâu non phục vụ công đoạn nhiễm (thức ăn nhân tạo) Lây nhiễm NPV theo tỷ lệ sâu chết/100ml Chọn sâu Sâu đầu tuổi để nhiễm virus Thu sâu tự nhiên - làm giống Thu dịch NPV Thu sâu chết NPV (sau nhiễm 6-7 ngày); Giữ bình kín 1-2 ngày Lọc dịch NPV Lọc bỏ xác sâu thức ăn SẢN XUẤT CHẾ PHẨM (SLNPV) Bảo quản nơi mát tránh ánh nắng trực tiếp Tiêu thụ Phun đồng - Phối chế, làm khơ, đóng gói, - Đóng chai Hình : Sơ đồ sản xuất virus SLNPV 122 Kiểm tra chất lƣợng NPV (xác định lượng PIB) 1.3 Tạo chế phẩm Dạng chế phẩm: Chế phẩm tạo dạng bột dạng nước - Nồng độ PIB: x 109PIB/g chế phẩm dạng bột x 109PIB/ml chế phẩm dạng nước - Chất mang cho dạng bột: Có thể sử dụng bột cao lanh, bột talc bổ sung rỉ đường 10% Tween 80 với lượng 0,5ml/kg - Dang nước: Sử dụng nước đun sôi để nguội nước cất vơ trùng Để bảo vệ virus trì hoạt lực nên bổ sung dịch chiết trà xanh 10% vào chế phẩm nước Cách tạo dịch chiết trà xanh: lấy trà xanh (lá già) phơi khô, cân 10g cho vào 50ml nước đun sơi, ngâm qua đêm, sau đó, lọc lấy nước Ta dịch chiết trà xanh 20% dùng dịch chiết bổ sung vào dịch NPV với tỷ lệ 1:1 Để tăng tính bám dính sản phẩm nên bổ sung thêm 0,5ml Tween 80 vào lít sản phẩm 1.4 Quy trình định lƣợng virus NPV để tạo chế phẩm Cho sâu chết vào nước cất nước đun sôi để nguội để nhiệt độ phòng vòng 01 ngày cho xác sâu rữa Lọc qua lớp vải mỏng để loại bỏ xác sâu tiến hành ly tâm với tốc độ 500 vòng/phút, thời gian phút Loại bỏ phần cặn lắng phía đáy ống, lấy phần nước Ly tâm tiếp với tốc độ 5000 vòng/phút, vòng 30 phút lấy phần tinh thể trắng - Dịch sau li tâm đem pha lỗng đếm kính hiển vi điện tử buồng đếm hồng cầu Đếm PIB: Cho gọt dịch virus vào buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng PIB/sâu Đếm số lượng PIB ô lớn (mỗi ô lớn bao gồm 16 ô nhỏ) buồng đếm, đếm lần nồng độ pha loãng ô lớn khác lấy giá trị trung bình Cơng thức định lƣợng PIB: Số PIB ml mẫu = A x (4000/80) x F x 1000 123 Trong đó: 1 4000 = 400 x 10 ( mm2: diện tích nhỏ; mm: 400 10 chiều cao từ mặt buồng đếm đến lamelle) A tổng số PIB đếm 80 ô nhỏ F hệ số pha lỗng mẫu QUY TRÌNH SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SLNPV TRỪ SÂU KHOANG ĂN TẠP 1) Thành phần - Hoạt chất:NPVsâu khoang ăn tạp (SLNPV: Nuclear polyhedrosis virus gây chết sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura) nồng độ 1x 109 PIB/g hoặc1x 109 PIB/ml - Thuốc trừ sâu SLNPV nên phun vào lúc chiều mát, phun ướt mặt Phun sâu nhỏ, hiệu lực cao Có thể phun kép lần, cách – 10 ngày 2) Liều sử dụng - Pha - 10g thuốc vào bình – 10 lít chế phẩm dạng bột 10 ml vào bình 8-10 lít chế phẩm dạng nước - Lượng nước phun: 500 – 600 lít/ha - Để tăng hiệu quả, bổ sung thêm vào bình - 10ml rỉ đường chất bám dính - Có thể sử dụng phối hợp với Bt thuốc trừ sâu khác để phun 3) Bảo quản - Bảo quản nơi thoáng mát, tránh ánh nắng mặt trời, xa tầm tay trẻ em - Thời hạn bảo quản: tháng kể từ ngày sản xuất 124 Phụ lục YÊU CẦU KỸ THUẬT CỦA DÂY CHUYỀN SẢN XUẤT Nhân Diện Máy móc, trang thiết bị lực tích A Hệ thống phịng ni sâu ký chủ Nấu thức ăn 30m2 Tủ lạnh, máy Quạt trần, bàn nuôi sâu cất nước, máy ghế, cân, tủ quay sinh tố, lưới, kệ Nuôi sâu 25 - Máy phun ẩm - Quạt trần 30m2 - Bàn ghế - Tủ lưới - 10 Kệ tầng 1,4m x 1,5m x 0,5m Phòng ghép 30m Máy phun ẩm Quạt trần, bàn bướm ghế, tủ lưới, kệ Phòng B Hệ thống phòng nhiễm NPV: phải cách hệ thống nuôi ≥ 100m Nấu thức ăn 30m2 Tủ lạnh, máy Quạt trần, bàn nuôi sâu cất nước, máy ghế, cân, tủ lưới, quay sinh tố, kệ Nhiễm sâu 50m Máy điều hịa -15 kệ kích thước 1,4m x 1,5m x 0,5m - Bàn ghế Thu nhận sâu 10 50m- -Tủ lạnh Bàn ghế chết NPV - - Máy điều hịa Tạo chế phẩm Đóng gói, kiểm tra chất lượng bảo quản 50m2 - Tủ lạnh - Máy quay sinh tố - Máy trộn 30m -Tủ đá - Tủ lạnh - Máy li tâm - Kính hiển vi 125 - Bàn ghế - Máy điều hòa - Bàn ghế - Quạt trần - Cân - Máy đóng gói Dụng cụ bếp điện, Autoclave, xoong, chậu, hộp nhựa - Petri thủy tinh: 3000cái - Hộp nhựa: 30000 -100 hộp giấy tròn -400 ống tuýp -Vải bếp điện, Autoclave, xoong, chậu, hộp nhựa - Khay nhựa - Hộp nhựa - Pine, Pipet - Đĩa petri - Xô nhựa - Can nhựa - ống đong - Pine - Khay nhựa - Xô nhựa - Cân - Buồng đếm hồng cầu - Micropipette Hình 1: Thu thập phân lập NPV từ sâu thu đồng Hình 2: Nhiễm sâu với NPV thức ăn nhân tạo Hình 3: Sâu chết nhiễm NPV ni phịng 126 Hình 4: Sâu ngày tuổi cơng thức Hình: Sâu ngày tuổi thức Hình 6: Sâu ngày tuổi cơng thức Hình 7: Thí nghiệm xác định hiệu lực chế phẩm NPV phạm vi chậu 127 Hình 8: Sâu chết bị nhiễm NPV thí nghiệm chậu (trên đậu đen) Hình 9: Mơ hình thực nghiệm trừ sâu Hình 10: Mơ hình thực nghiệm trừ khoang rau cải chế sâu khoang đậu phộng phẩm SlNPV chế phẩm SlNPV 128 Hình 11: Hội thảo sử dụng chế phẩm SlNPV phòng trừ sâu khoang hại trồng Hình 12: Chế phẩm SLNPV tham dự Hội chợ khoa học trẻ 129 PHỤ LỤC 4: GIÁ THÀNH MỘT MẺ THỨC ĂN NHÂN TẠO NUÔI SÂU STT Thành phần Đậu xanh (g) Đậu nành (g) Đậu trắng (g) Tinh bột (g) Agar (g) Methyl paraben (g) Sorbic acid (g) Men mì (g) Ascorbic acid (g) Casein (g) Vitamin tổng hợp (ml) Formalin (ml) Nước cất (ml) Tổng cộng 10 11 12 13 14 Công thức Số Giá lượng thành 150 7500 Công thức Số lượng Giá thành 150 7500 10 600 Công thức Số Giá lượng thành 12 2.5 4560 750 12 2.5 4560 750 375 56 7,5 3,5 1.5 270 1,5 270 1,8 324 15 1950 300 15 1950 300 56 5,6 7280 560 10 2904 11886 10 11886 0 750 150 750 150 750 30.270 27.966 130 22150 700 2850 1050 450 35.364