2465 nghiên cứu bào chế viên nén bao phim hỗ trợ điều trị đái tháo đường từ lá cây sầu đâu ăn lá (azadirachta sp) tại an giang ở quy mô pilot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN KIM NGUYỆT NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NÉN BAO PHIM HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TỪ LÁ CÂY SẦU ĐÂU ĂN LÁ (Azadirachta sp.) TẠI AN GIANG Ở QUY MÔ PILOT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Ths NGUYỄN NGỌC NHÃ THẢO Ths LÊ THỊ CẨM TÚ CẦN THƠ –2018 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn - lời cảm ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô Ths Nguyễn Ngọc Nhã Thảo, ln quan tâm, tận tình hướng dẫn, góp ý giúp đỡ em suốt năm thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Ths Lê Thị Cẩm Tú, cô quan tâm, hỗ trợ em q trình hồn thành tiểu luận Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn chân thành đến thầy PGS.TS Dương Xuân Chữ, cô Ths Huỳnh Thị Mỹ Duyên, cô PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Vân, cô Ths Nguyễn Ngọc Quỳnh, cô Ths Nguyễn Thị Linh Tuyền, chị Nguyễn Ngọc Trúc Phương, chị Nguyễn Thị Bích, anh Nguyễn Hữu Nhân, quan tâm tạo điều kiện giúp em hồn thành luận văn Ngồi ra, em vơ cảm ơn anh chị phòng Nghiên cứu phát triển thuốc công ty DHG, tận tâm hỗ trợ nhiệt tình suốt thời gian thực đề tài Cảm ơn anh Bình Thuận, chị Yến Thanh, chị Minh Thảo, Tư anh chị làm việc phòng Xin cảm ơn bạn thực đề tài mơn Dược liệu, Kiểm nghiệm, Hóa dược Dược lý Cảm ơn bạn Mộng Tuyền, pé Pơ, Văn Dưng, Kiều Anh, Thanh Hào, Nhật Toàn, Thanh Thoảng, Ngọc Xn, Hồng Khang, Thiên Trí, Ngọc Châu, em Hân, em Châu Dược Cảm ơn chị Mai Lan Thanh, chị Trương Thảo Ngọc Nhận hỗ trợ từ người hồn thiện đề tài Hơn hết, biết ơn ba má, biết ba má lo lắng, hoàn thành luận văn lúc ba má nhẹ lòng nhất, thương ba má Lánh Cần Thơ, ngày 14 tháng năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Kim Nguyệt i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược sầu đâu 1.1.1 Hình thái thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học tác dụng sinh học 1.2 Bào chế viên nén bao phim 1.2.1 Khái niệm đặc điểm bào chế viên nén bao phim 1.2.2 Kỹ thuật bào chế viên nén bao phim từ dược liệu 1.3 Nâng cấp cỡ lô 1.4 Kiểm sốt quy trình mặt thống kê 10 1.5 Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần 11 1.6 Một số nghiên cứu liên quan đến đề tài 12 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Chất chuẩn 15 2.1.3 Trang thiết bị 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Khảo sát quy trình chiết ngấm kiệt điều chế cao đặc quy mô 7kg dược liệu khô 17 2.2.2 Khảo sát quy trình bào chế viên nén bao phim 20 2.2.3 Bào chế lô viên nén bao phim từ Sầu đâu quy mô 5000 viên 27 ii 2.2.4 Kiểm nghiệm đánh giá tiêu viên nén bao phim quy mô 5000 viên so với quy mô 200 viên 28 2.2.5 Phương pháp thống kê kết phân tích 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Khảo sát quy trình chiết ngấm kiệt điều chế cao đặc quy mô 7kg dược liệu khô 32 3.1.1 Kết phần trăm chất chiết từ dịch chiết loãng Sầu đâu 32 3.1.2 Kết sắc ký lớp mỏng đồng lượng cao đặc từ phân đoạn dịch chiết Sầu đâu 33 3.2 Khảo sát quy trình bào chế viên nén bao phim 34 3.2.1 Khảo sát nâng cấp quy mô 1000 viên bào chế viên nén Sầu đâu 34 3.2.2 Khảo sát nâng cấp quy mô 5000 viên bào chế viên nén Sầu đâu 36 3.2.3 Khảo sát quy trình bao phim 38 3.3 Bào chế lô viên nén bao phim từ Sầu đâu quy mô 5000 viên 40 3.3.1 Kết kiểm tra cốm bán thành phẩm 40 3.3.2 Kết kiểm tra tiêu viên nén 40 3.3.3 Kết kiểm tra tiêu viên nén bao phim 44 3.4 Kiểm nghiệm đánh giá tiêu viên nén bao phim quy mô 5000 viên so với quy mô 200 viên 44 3.4.1 Kiểm nghiệm viên nén bao phim từ Sầu đâu quy mô 5000 viên 44 3.4.2 So sánh tiêu viên nén bao phim quy mô 5000 viên quy mô 200 viên 47 Chương BÀN LUẬN 49 4.1 Quy trình điều chế cao đặc Sầu đâu ăn quy mô 7kg dược liệu khô 49 4.2 Quy trình điều chế viên nén bao phim chứa cao đặc sầu đâu 50 4.2.1 Khảo sát nâng cấp quy mô 1000 viên bào chế viên nén Sầu đâu 50 4.2.2 Khảo sát quy trình điều chế viên nén Sầu đâu quy mô 5000 viên 51 4.2.3 Khảo sát quy trình bao phim 53 4.3 Bào chế lô viên nén bao phim từ Sầu đâu quy mô 5000 viên 54 iii 4.4 Kiểm nghiệm đánh giá tiêu viên nén bao phim quy mô 5000 viên so với quy mô 200 viên 54 4.4.1 Kiểm nghiệm viên nén bao phim từ sầu đâu quy mô 5000 viên 56 4.4.2 So sánh tiêu viên nén bao phim quy mô 5000 viên quy mô 200 viên 57 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ nguyên Nghĩa Tiếng Việt Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế AOAC Association of Official Analytical Chemists CT Công thức DĐVN Dược Điển Việt Nam dbiểu kiến Tỷ trọng biểu kiến GHD Giới hạn GHT Giới hạn GTTB Giá trị trung bình ICH International Conference Harmonisation Hiệp hội đồng thuận quốc tế Labo Laboratory Phịng thí nghiệm 10 PEG Polyethylene glycol 11 PVA Polyvinyl Alcohol 12 PVP Polyvinyl Pyrrolidone 13 QTB Quy trình bao 14 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 15 s Second Giây 16 TCCS Tiêu chuẩn sở 17 vchảy Tốc độ chảy 18 vđ Vừa đủ 19 VS Vanillin-Sulfuric v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thông số kỹ thuật bột, hạt cần kiểm soát Bảng 1.2 Các thông số quan trọng nâng cỡ lô cơng đoạn quy trình sản xuất thuốc rắn đường uống 10 Bảng 1.3 Biểu thức đường trung tâm đường giới hạn biễu đồ Shewhart 11 Bảng 2.1 Danh mục tá dược 16 Bảng 2.2 Danh mục hóa chất, dung môi, chất chuẩn 16 Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị 17 Bảng 2.4 Thiết bị sử dụng thông số máy 22 Bảng 2.5 Thành phần công thức viên nén khảo sát quy mô 1000 viên 23 Bảng 2.6 Thành phần cơng thức khảo sát cải thiện đặc tính viên 24 Bảng 2.7 Công thức dịch bao 24 Bảng 2.8 Thơng số quy trình bao phim quy mô 5000 viên 26 Bảng 2.9 Độ tăng khối lượng giai đoạn bao phim 27 Bảng 2.10 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn đo quang 30 Bảng 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi điều chế dịch chiết Sầu đâu 32 Bảng 3.2 Thông số thiết bị đề xuất quy mô 1000 viên 35 Bảng 3.3 Kết tiêu bào chế công thức viên nén 35 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ đồng hỗn hợp bột giai đoạn trộn khô quy mô 5000 viên 36 Bảng 3.5 Kết khảo sát thời gian trộn hoàn tất quy mô 5000 viên 37 Bảng 3.6 Thông số thiết bị đề xuất quy mô 5000 viên 38 vi Bảng 3.7 Kết khảo sát quy trình bao phim 39 Bảng 3.8 Kết độ ẩm cốm lô sau sấy 40 Bảng 3.9 Kết tỷ trọng biểu kiến tốc độ chảy cốm bán thành phẩm 40 Bảng 3.10 Kết khảo sát biểu đồ Shewhart R lô 42 Bảng 3.11 Kết khảo sát biểu đồ Shewhart 𝑋 lô 42 Bảng 3.12 Kết thử độ cứng trình dập viên quy mô 5000 viên 43 Bảng 3.13 Kết thử độ mài mịn q trình dập viên quy mô 5000 viên 43 Bảng 3.14 Kết thử độ rã q trình dập viên quy mơ 5000 viên 44 Bảng 3.15 Kết đánh giá q trình bao phim lơ 5000 viên 44 Bảng 3.16 Kết kiểm độ rã 45 Bảng 3.17 Kết định lượng 46 Bảng 3.18 Kết so sánh tiêu viên nén bao phim quy mô 5000 viên quy mô 200 viên 48 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bao chế viên nén bao phim từ cao đặc Sầu đâu quy mô 5000 viên 25 Hình 3.1 Kết sắc ký lớp mỏng đồng lượng từ phân đoạn dịch chiết 33 Hình 3.2 Hình thức cảm quan viên qua giai đoạn bao phim 39 Hình 3.3 Biểu đồ khối lượng trung bình lơ 41 Hình 3.4 Kết sắc ký lớp mỏng định tính viên nén bao phim từ Sầu đâu 46 PL-5 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 STT Bảng PL 4-1 Khối lượng viên nén lô 1 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 38 38 39 39 39 40 39 40 40 39 39 39 39 39 40 39 39 39 38 39 39 38 39 39 39 40 40 40 40 40 40 39 39 40 40 39 39 39 39 39 39 38 39 40 39 39 40 40 40 40 39 39 39 39 39 38 39 39 39 39 39 38 39 40 39 39 40 40 40 40 40 39 39 39 40 40 40 39 39 39 39 39 39 40 40 40 40 40 40 40 39 39 38 40 40 39 40 39 39 39 38 39 39 39 40 39 40 39 40 39 39 39 38 40 40 38 39 39 39 39 39 38 39 39 40 39 39 39 40 40 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 38 39 40 40 39 39 40 40 40 40 39 38 39 39 39 39 39 39 39 38 38 39 10 39 39 38 40 38 40 40 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 40 40 39 11 39 39 39 40 38 39 40 39 39 39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 39 12 40 40 38 39 38 39 39 39 39 39 39 39 40 39 40 39 40 40 40 39 13 39 39 39 39 38 39 39 39 39 39 39 39 40 39 40 39 40 39 40 39 14 39 39 39 39 38 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 39 40 40 39 15 39 38 38 39 38 39 39 40 39 40 39 39 40 39 40 39 39 40 40 39 16 39 39 39 39 38 39 39 39 39 40 39 39 40 39 40 39 39 39 40 39 17 39 39 39 39 38 39 39 39 39 39 39 39 40 39 40 39 40 40 40 39 18 39 39 39 39 38 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 39 40 40 39 19 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 38 38 39 20 39 39 40 39 40 40 39 39 39 39 39 40 39 39 39 38 39 39 38 39 PL-6 25 20 15 10 5 GTTB GHT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GHD GHCBT GHCBD Hình PL 4-3 Biểu đồ Shewhart R lô 400 399 398 397 396 395 394 393 392 391 GTTB GHD 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GHT GHCBT Hình PL 4-4 Biểu đồ Shewhart 𝑋̅ lô GHCBD PL-7 Bảng PL 4-2 Khối lượng viên nén lô STT 39 39 40 3 39 40 39 40 39 39 39 39 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 39 40 40 40 40 39 39 39 40 40 39 1 9 1 39 40 39 40 39 40 39 39 38 40 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 40 39 40 39 40 40 40 39 40 40 39 39 40 39 40 39 39 39 40 40 40 39 39 39 39 39 39 40 39 38 39 39 40 39 39 39 40 39 40 39 40 40 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 40 39 39 40 39 38 39 40 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 40 39 40 38 40 39 39 39 40 39 39 39 40 39 40 39 39 39 38 39 39 39 39 39 40 39 39 39 40 40 38 40 40 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 10 40 39 39 40 40 38 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 39 11 39 39 39 39 38 39 39 38 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 12 39 39 39 39 38 39 39 38 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 13 40 39 39 39 39 38 39 38 40 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 14 39 40 39 39 38 38 38 38 39 40 39 39 39 40 39 39 40 39 39 39 15 39 39 39 39 38 38 38 38 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 39 39 16 38 40 39 38 38 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 38 39 40 39 17 38 40 39 38 39 39 39 39 38 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 18 38 40 39 38 39 39 39 40 38 39 39 39 39 39 39 38 40 39 39 39 19 38 40 40 38 38 38 39 40 40 39 39 39 40 39 40 39 40 39 39 39 20 39 39 40 38 38 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 PL-8 25 20 15 10 5 GTTB GHT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GHD GHCBT GHCBD Hình PL 4-5 Biểu đồ Shewhart R lô 400 399 398 397 396 395 394 393 392 391 390 GTTB GHT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GHD GHCBT Hình PL 4-6 Biểu đồ Shewhart 𝑋̅ lơ GHCBD PL-9 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 STT Bảng PL 4-3 Khối lượng viên nén lô 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 39 40 39 40 40 39 40 39 40 2 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 40 40 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 40 39 39 39 40 39 40 39 40 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 40 40 39 40 40 39 40 39 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 40 40 40 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 40 39 39 39 39 40 40 39 39 39 39 39 40 39 40 40 39 39 10 39 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 39 40 39 39 39 11 39 39 39 39 40 40 39 39 40 39 38 39 39 39 40 39 40 39 38 39 12 39 39 39 39 40 40 39 39 39 39 39 39 38 39 40 40 39 39 39 39 13 39 39 39 39 39 39 39 39 39 38 39 39 39 39 40 39 39 40 40 39 14 40 39 39 39 40 39 39 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 39 40 40 15 39 39 39 39 40 39 40 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 16 39 40 39 39 39 39 40 39 39 40 39 40 39 40 39 39 39 39 40 40 17 39 38 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 39 18 39 39 40 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 39 39 40 39 19 39 38 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 40 40 39 40 39 39 20 39 39 39 39 40 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 39 40 PL-10 25 20 15 10 5 GTTB GHT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GHCBT GHCBD GHD Hình PL 4-7 Biểu đồ Shewhart R lô 400 399 398 397 396 395 394 393 392 GTTB GHCBT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GHCBD GHT Hình PL 4-8 Biểu đồ Shewhart 𝑋̅ lô GHD PL-11 Phụ lục XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TỒN PHẦN TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM TỪ LÁ SẦU ĐÂU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU a Khảo sát quy trình định lượng Chuẩn bị mẫu: Dung dịch thử gốc: cân xác khoảng lượng bột viên nhân tương đương 200mg cao đặc cho vào erlen nút mài 100mL Chiết hỗ trợ siêu âm với 150mL n-hexan 45oC – khảo sát số lần chiết, lần chiết 15 phút (đánh giá Sắc ký lớp mỏng) Gạn, lọc, bốc n-hexan Thêm vào erlen khoảng 80mL methanol, chiết hỗ trợ siêu âm – khảo sát nhiệt độ (25oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC) thời gian chiết (15 phút, 30 phút, 45 phút, 50 phút) Chuyển dịch cắn vào bình định mức 100mL, bổ sung vừa đủ 100mL methanol Ly tâm, lấy phần dịch phía Dung dịch chuẩn gốc: tiến hành tương tự mục 2.2.4.1 Tiến hành đo quang Dung dịch thử: Tiến hành tương tự mục 2.2.4.1 Trộn kỹ để yên 20 phút Đo độ hấp thu bước sóng λmax khảo sát Dung dịch trắng: tiến hành tương tự mục 2.2.4.1 Dung dịch đối chứng: tiến hành tương tự dung dịch đo thay 1mL dung dịch AlCl3 5% 1mL methanol Dãy dung dịch chuẩn: tiến hành tương tự mục 2.2.4.1 Trộn kỹ để yên 20 phút Tiến hành quét phổ khoảng bước sóng 400-600nm, xác định cực đại hấp thu Tiến hành đo độ hấp thụ dãy chuẩn dung dịch thử bước sóng λmax, xây dựng đường chuẩn rutin Dựa vào phương trình đường chuẩn tính nồng độ flavonoid tồn phần có mẫu tính theo rutin Cách tính kết Hàm lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin viên theo công thức (2.3) PL-12 b Thẩm định quy trình định lượng Độ đặc hiệu Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung dịch trắng trình bày mục 2.2.3.1 Tiến hành quét phổ hấp thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn, dung dịch đối chứng Phương pháp thêm chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch thử gồm nồng độ từ 0,4- 1,4mg/mL (tính theo mg cao đặc) dãy dung dịch thử thêm 810µg rutin chuẩn nồng độ Tiến hành đo độ hấp thu xây dựng đường hồi quy tuyến tính dãy dung dịch thử Yều cầu: đường tuyến tính phải song song với Tính tuyến tính miền giá trị Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch trắng trình bày mục 2.2.3.1 Tiến hành đo độ hấp thu dãy dung dịch chuẩn Xây dựng phương trình đường hồi quy tuyến tính, tính hệ số R2 Yêu cầu: R2 > 0,99 Kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy kiểm định F ý nghĩa hệ số phương trình kiểm định T Độ xác Độ lặp lại: Chuẩn bị mẫu thử nồng độ 100% Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần mẫu thử sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính Yêu cầu: Độ lệch chuẩn (RSD) đạt mức quy định theo Hiệp hội hóa học phân tích quốc tế (AOAC) Độ Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần mẫu thử sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính Cho vào mẫu thử lượng rutin chuẩn có hàm lượng 50%, 100% 150% hàm lượng flavonoid có mẫu thử Mỗi nồng độ chuẩn bị mẫu Tìm lại hàm lượng rutin chuẩn thêm vào dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính u cầu: đạt tỷ lệ hồi phục theo hướng dẫn AOAC II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết sắc ký lớp mỏng xác nhận rutin viên nén bao phim từ Sầu đâu thể hình PL 5-1 PL-13 A B C Hình PL 5-1 Sắc ký lớp mỏng xác nhận rutin viên nén Sầu đâu A - Soi đèn UV 254nm, B - Soi đèn UV 365nm, C - Phun thuốc thử VS (Hệ dung môi pha động: ethyl acetat: methanol: nước: acid formic (100:17:13:1) Chú thích: T- mẫu viên nghiên cứu: chuẩn bị mẫu tương tự mẫu thử tiêu định tính theo mục 2.2.4.1.), C - mẫu rutin chuẩn: dung dịch rutin 400ppm methanol PL-14 a Khảo sát quy trình định lượng Kết khảo sát chiết loại tạp với n-hexan Sau lần chiết loại tạp hỗ trợ siêu âm với n-hexan, lần chiết 50mL, kiểm tra thành phần cắn sau bốc phương pháp sắc ký lớp mỏng Kết sắc ký đồ kiểm tra trình loại tạp sau lần chiết thể hình PL 5-2 Chú thích A: dịch chiết methanol chưa loại tạp B: dịch chiết methanol chiết loại tạp lần với nhexan Hình PL 5-2 Sắc ký đồ kiểm tra trình loại tạp chlorophyll sau lần chiết phát thuốc thử VS (Dung môi pha động: cloroform - methanol (9:1), phát thuốc thử VS) Nhận xét: sau lần chiết loại tạp hỗ trợ siêu âm n-hexan, tạp phân cực đặc biệt thành phần chlorophyll gây ảnh hưởng đến kết phân tích loại bỏ hiệu Số lần chiết với n-hexan cố định lần, tiếp tục khảo sát trình xử lý mẫu PL-15 Kết khảo sát điều kiện chiết xuất với dung môi methanol Nhiệt độ chiết: kết khảo sát sơ ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết flavonoid tồn phần tính theo rutin thể bảng PL 5-1 Bảng PL 5-1 Kết khảo sát nhiệt độ chiết Nhiệt độ (oC) Giá trị Độ hấp thu 25 35 40 45 50 Lần 0,1249 0,1334 0,1926 0,2348 0,2279 Lần 0,1253 0,1326 0,1922 0,2345 0,2265 Lần 0,1252 0,1322 0,1923 0,2348 0,2266 Trung bình 0,1251 0,1327 0,1924 0,2347 0,23 0,5006 0,5005 0,5014 0,5003 0,5009 Khối lượng cân (g) Phương trình đường cong chuẩn: y = 0,0123349x Hàm lượng flavonoid viên (mg) 1,42 1,5 2,17 2,66 2,57 Nhận xét: điều nhiệt độ bình thường 25oC 35oC chiết kiệt flavonoid, nhiệt độ cao khả chiết tăng tăng nhiệt độ đến 50oC hàm lượng flavonoid dịch chiết bị giảm Lựa chọn nhiệt độ chiết flavonoid toàn phần với methanol giai đoạn 45oC, tiến hành khảo sát thời gian chiết Thời gian chiết: kết khảo sát thời gian chiết flavonoid toàn phần thể bảng PL 5-2 Nhận xét: lượng flavonoid chiết sau 45 phút khơng tăng thêm Vì vậy, 45 phút thời gian phù hợp, lựa chọn để tiến hành quy trình định lượng PL-16 Bảng PL 5-2 Kết khảo sát thời gian chiết Thời gian (phút) Giá trị 15 30 45 Độ hấp thu 50 Lần 0,202 0,2348 0,2498 0,245 Lần 0,2028 0,2345 0,2496 0,2454 Lần 0,2018 0,2348 0,2492 0,246 Trung bình 0,2 0,23 0,25 0,25 0,5071 0,5064 0,5008 0,5009 Khối lượng cân (g) Phương trình đường cong chuẩn: y = 0,0123349x Hàm lượng flavonoid viên (mg) b Thẩm định quy trình 2,26 2,62 2,82 2,78 Độ đặc hiệu Kết phổ đồ dung dịch đo thể hình PL 5-3 Nhằm đánh giá độ đặc hiệu phương pháp thêm chuẩn, dung dịch thử pha loãng mức độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính dãy dung dịch thử pha lỗng dãy dung dịch thử thêm 810µg rutin chuẩn bình Kết đường hồi quy tuyến tính dãy dung dịch thử dãy dung dịch thử thêm chuẩn với hệ số R2 thể hình hình PL 5-4 Nhận xét: phổ dung dịch thử dung dịch chuẩn tương đối tương đồng hình dáng cực đại hấp thu, bước sóng 510nm, độ hấp thu dung dịch đối chiếu không đáng kể (có độ hấp thu 0,009) Căn vào hấp thu dung dịch đối chứng, dung dịch thử chuẩn, bước sóng 510nm lựa chọn để đo độ hấp thu Nhận xét: có song song hai đường hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan R2 đường hồi quy mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn 0,9995 0,998 cho thấy đường hồi quy có độ tin cậy cao Kết luận: quy trình phân tích đề xuất đặt u cầu tính đặc hiệu PL-17 Hình PL 5-3 Phổ đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn dung dịch đối chứng Độ hấp thu (A.U.) 0.9 0.8 ŷ = 0,275x + 0,4014 0.7 R² = 0,998 0.6 ŷ = 0,2824x 0.5 R² = 0,9995 0.4 0.3 DD thử DD thử thêm chuẩn 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 Nồng độ cao (mg/mL) Hình PL 5-4 Phương trình đường hồi quy tuyến tính kiểm chứng độ đặc hiệu Tính tuyến tính miền giá trị Kết khảo sát tính tuyến tính thể bảng PL 5-3 hình PL 5-5 Nhận xét: Sử dụng trắc nghiệm F cho thấy phương trình hồi quy tương thích: F = 83512,81 > F0,05 = 7,71 Sử dụng trắc nghiệm t cho thấy hệ số a = 0,0126 có ý nghĩa (|𝑡 | = 288,99 > t0,05 = 2,78); hệ số b = - 0,0162 có ý nghĩa ((|𝑡 | = -6,99 > t0,05 = 2,78) PL-18 Phương trình hồi quy tuyến tính: 𝑦̂ = 0,0126𝑥 − 0,0162 với hệ số tương quan R2 = Kết luận: phương pháp đạt độ tuyến tính, khoảng nồng độ – 96 µg/mL có tương quan độ hấp thu nồng độ rutin chuẩn Độ xác Kết độ lặp lại trình bày bảng PL 5-4 Nhận xét: quy trình có độ lặp lại với RSD = 4,6% < 7,3% Kết luận: quy trình đạt yêu cầu độ xác Độ Kết độ phương pháp định lượng trình bày bảng PL 5-5 Bảng PL 5-3 Kết khảo sát tính tuyến tính miền giá trị Nồng độ mẫu Độ hấp thu chuẩn (µg/mL) 510nm 0,084309 Phương trình hồi quy: 16 0,184498 𝑦̂ = 0,0126𝑥 − 0,0162 32 0,386993 Hệ số tương quan: R2 = 48 0,592095 64 0,784703 96 1,19322 Độ hấp thu (A.U.) 1.4 1.2 ŷ = 0,0126x - 0,0162 R² = 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 16 32 48 64 80 Nồng độ rutin (µg/mL) Hình PL 5-5 Đồ thị tuyến tính rutin 96 112 PL-19 Bảng PL 5-4 Kết khảo sát độ lặp lại Hàm lượng flavonoid toàn phần Xử lý kết thống kê tính theo rutin viên (mg) 3,56 3,53 3,92 3,57 3,8 3,52 Lần đo Mức khảo sát (%) N=6 Trung bình = 3,65 (mg) SD = 0,168 RSD = 4,6% Bảng PL 5-5 Kết khảo sát độ Lượng chất Tỷ lệ Lượng chuẩn chuẩn tìm lại phục hồi thêm vào(mg) (mg) (%) 2,08 1,95 93,75 2,08 2,09 100,48 2,08 2,04 98,08 4,16 4,02 96,63 4,16 3,85 92,55 4,16 3,94 94,71 6,24 6,15 98,56 6,24 5,98 95,83 6,24 5,99 95,99 50 100 150 Trung bình Tỷ lệ phục hồi trung bình (%) 97,44 94,63 96,79 96,29 Nhận xét: khoảng tỷ lệ phục hồi cho phép 80-110%, tỷ lệ phục hồi trung bình phương pháp 96,29% Kết luận: quy trình đạt độ theo quy định AOAC Quy trình định lượng flavonoid tồn phần tính theo rutin phương pháp quang phổ đạt tiêu: độ đặc hiệu, tính tuyến tính miền giá trị, độ xác độ Qui trình phân tích sử dụng để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần viên nén bao phim từ Sầu đâu