Nguyễn thị thu hương bước đầu tinh chế daidzein từ bột isoflavon làm nguyên liệu thiết lập chuẩn khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG BƯỚC ĐẦU TINH CHẾ DAIDZEIN TỪ BỘT ISOFLAVON LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1801290 BƯỚC ĐẦU TINH CHẾ DAIDZEIN TỪ BỘT ISOFLAVON LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Thanh Thủy ThS Mạc Thị Thanh Hoa Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Thanh Thủy – Giảng viên mơn Hóa dược - Khoa Cơng nghệ Hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội ThS Mạc Thị Thanh Hoa – Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia – người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới: Ban Giám hiệu, phịng ban, khoa, mơn thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt kiến thức, kỹ tạo điều kiện cho em học tập, rèn luyện, tích lũy suốt trình năm học tập trường Các cán nhân viên Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, bạn nhóm nghiên cứu cô Thanh Thủy động viên hỗ trợ giúp đỡ em nhiều Cuối em xin dành biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, người thân bạn bè ủng hộ, chia sẻ khích lệ em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em mong nhận nhận xét ý kiến đóng góp thầy để khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hương MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhóm hợp chất isoflavon 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc 1.1.2 Đặc tính lý hóa 1.1.3 Tác dụng sinh học 1.2 Tổng quan daidzein .4 1.2.1 Đặc điểm tính chất 1.2.2 Đặc điểm chuyển hóa 1.2.3 Tác dụng sinh học 1.2.4 Một số chế phẩm chứa daidzein thị trường 1.3 Một số phương pháp tinh chế hợp chất hữu 1.3.1 Phương pháp chưng cất 1.3.2 Phương pháp kết tinh lại 1.3.3 Phương pháp chiết 1.3.4 Phương pháp thăng hoa 1.3.5 Phương pháp sắc ký cột 1.4 Tổng quan phương pháp phân tích daidzein mẫu 1.5 Một số phương pháp hóa lý sử dụng đề tài 10 1.5.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 10 1.5.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 10 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 10 1.5.4 Khối phổ (MS) 11 1.5.5 Phổ hồng ngoại (IR) 11 1.6 Tổng quan chất đối chiếu (chất chuẩn) .11 1.6.1 Khái niệm 11 1.6.2 Phân loại chất chuẩn 11 1.6.3 Ứng dụng 12 1.7 Tình hình tinh chế thiết lập chuẩn daidzein .12 1.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 12 1.7.2 Tình hình nghiên cứu nước 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Chất chuẩn 14 2.1.3 Dung mơi, hóa chất 14 2.2 Dụng cụ, thiết bị 15 2.3 Nội dung nghiên cứu .16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp kết tinh lại 16 2.4.2 Phương pháp sắc ký cột điều chế 17 2.4.3 Các phương pháp phổ xác định cấu trúc sản phẩm 17 2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xác định hàm lượng daidzein 17 2.4.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng đánh giá độ tinh khiết sản phẩm 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 19 3.1 Đánh giá nguyên liệu isoflavon ban đầu 19 3.1.1 Định tính nguyên liệu ban đầu TLC 19 3.1.2 Định lượng nguyên liệu ban đầu HPLC 19 3.2 Xây dựng quy trình tinh chế daidzein từ nguyên liệu isoflavon 21 3.2.1 Phương pháp kết tinh lại 21 3.2.2 Kiểm tra sản phẩm kết tinh trước tinh chế sắc ký cột điều chế 23 3.2.3 Tinh chế sắc ký cột điều chế 27 3.3 Kiểm tra sơ độ tinh khiết sản phẩm thu TLC 28 3.4 Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế 29 3.4.1 Phổ IR sản phẩm 29 3.4.2 Phổ MS sản phẩm 30 3.4.3 Phổ NMR sản phẩm 30 3.5 Xác định hàm lượng sản phẩm tinh chế 33 3.5.1 Các dung dịch sắc ký 33 3.5.2 Tính thích hợp hệ thống sắc ký 33 3.5.3 Đường chuẩn 33 3.5.4 Định lượng sản phẩm tinh chế 34 3.6 Bàn luận .35 3.6.1 Về quy trình tinh chế daidzein từ nguyên liệu bột isoflavon 35 3.6.2 Về đánh giá độ tinh khiết sản phẩm tinh chế TLC 35 3.6.3 Về xác định cấu trúc sản phẩm daidzein tinh chế 35 3.6.4 Về xác định hàm lượng daidzein HPLC 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol ESI (electrospray ionization) Ion hóa phun điện tử HPLC (High performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu cao IR (Infrared) Tia hồng ngoại MeOH Methanol MS (Mass spectrometry) Khối phổ NMR (Nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ TLC (Thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe UV (Ultraviolet) Tia tử ngoại VKN ATVSTPQG Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích kỹ thuật HPLC Bảng 2.1 Dung mơi, hóa chất sử dụng cho đề tài 14 Bảng 2.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 15 Bảng 2.3 Chương trình gradient pha động cho định lượng 17 Bảng 3.1 Kết tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng daidzein nguyên liệu ban đầu 20 Bảng 3.2 Đường chuẩn định lượng daidzein nguyên liệu ban đầu 21 Bảng 3.3 Kết định lượng daidzein nguyên liệu ban đầu 21 Bảng 3.4 Khảo sát loại dung môi kết tinh lại 22 Bảng 3.5 Kết tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng daidzein sản phẩm kết tinh 25 Bảng 3.6 Đường chuẩn định lượng daidzein sản phẩm kết tinh 26 Bảng 3.7 Kết định lượng daidzein sản phẩm kết tinh 26 Bảng 3.8 Chương trình gradient dung mơi rửa giải sắc ký điều chế 27 Bảng 3.9 Kết phân tích phổ IR sản phẩm 29 Bảng 3.10 Dữ liệu phân tích phổ NMR daidzein (dung mơi: DMSO-d6) 32 Bảng 3.11 Kết tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng daidzein sản phẩm tinh chế 33 Bảng 3.12 Đường chuẩn định lượng daidzein sản phẩm tinh chế 34 Bảng 3.13 Kết định lượng daidzein sản phẩm tinh chế 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo isoflavon Hình 1.2 Cấu trúc hóa học số isoflavon đậu nành Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo daidzein Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hóa daidzein Hình 1.5 Một số chế phẩm chứa daidzein thị trường Hình 2.1 Thiết bị sắc ký điều chế Buchi Pure C-815 Flash 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC đánh giá nguyên liệu ban đầu 19 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình kết tinh lại daidzein 23 Hình 3.3 Trước sau kết tinh lại 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC đánh giá sản phẩm kết tinh lại 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ rửa giải sắc ký điều chế 28 Hình 3.6 Sắc ký đồ TLC đánh giá độ tinh khiết sản phẩm tinh chế 28 Hình 3.7 Phổ IR sản phẩm tinh chế 29 Hình 3.8 Kết chồng phổ IR sản phẩm chất chuẩn daidzein 30 Hình 3.9 Phổ MS sản phẩm tinh chế 30 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR sản phẩm tinh chế 31 Hình 3.11 Phổ 13C-NMR sản phẩm tinh chế 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Isoflavon nhóm hợp chất có cấu trúc tác dụng tương tự estrogen nên sử dụng để hỗ trợ cân nội tiết tố estrogen phụ nữ tiền mãn kinh, làm giảm bốc hỏa, đổ mồ hôi đêm giảm nguy mắc bệnh loãng xương, ung thư vú [7, 31] Hiện nay, người tiêu dùng có xu hướng bổ sung số thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) chứa hợp chất isoflavon có nguồn gốc thực vật thay sử dụng liệu pháp estrogen dài hạn, phổ biến isoflavon chiết xuất từ đậu nành [6] Trên thị trường Việt Nam lưu hành nhiều sản phẩm TPBVSK khác có chứa isoflavon đậu nành chất lượng thực chế phẩm chưa kiểm sốt đầy đủ thiếu chất chuẩn đối chiếu Một số chất chuẩn đối chiếu cần sử dụng kiểm tra chất lượng sản phẩm chứa isoflavon daidzein Tuy nhiên chất chuẩn chưa thiết lập Việt Nam mà phải đặt mua nước với giá thành cao thời gian đặt hàng lâu nên gây khó khăn cho cơng tác kiểm nghiệm Xuất phát từ thực tế nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Bước đầu tinh chế daidzein từ bột isoflavon làm nguyên liệu thiết lập chuẩn” với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình tinh chế daidzein từ bột isoflavon làm nguyên liệu thiết lập chuẩn Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế Xác định hàm lượng sản phẩm tinh chế Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR sản phẩm tinh chế viii Phụ lục 9: Sắc ký đồ kết định lượng daidzein sản phẩm tinh chế ix