Nghiên cứu định lượng sắt fumarat trong chế phẩm bằng kỹ thuật cực phổ xung vi phân khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG SẮT FUMARAT TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT CỰC PHỔ XUNG VI PHÂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LOAN MÃ SINH VIÊN: 1801414 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG SẮT FUMARAT TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT CỰC PHỔ XUNG VI PHÂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Đặng Hoàng Ths Nghiêm Thị Thanh Nga Nơi thực hiện: Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Khoá luận thực Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc trường Đại học Dược Hà Nội Với lòng biết ơn kính trọng sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Vũ Đặng Hoàng – Giảng viên Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội Ths Nghiêm Thị Thanh Nga – Giảng viên Khoa Dược – Trường Đại học Thành Đô, dành nhiều thời gian, công sức, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh/chị kỹ thuật viên Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình bảo tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phịng ban, thầy tồn thể cán công nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội trực tiếp giảng dạy giúp đỡ em suốt trình học tập hoạt động trường Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè ln động viên khuyến khích em trình học tập thời gian em thực đề tài Hà Nội, tháng 05 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Loan i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật cực phổ 1.1.1 Kỹ thuật cực phổ xung vi phân 1.1.2 Trạng thái giọt thuỷ ngân 1.2 Sắt fumarat số phương pháp định lượng sắt chế phẩm bổ sung sắt CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng – nguyên liệu thiết bị 10 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 10 2.1.2 Nguyên liệu thiết bị 10 2.2 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3 Xử lý kết thực nghiệm 11 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12 3.1 Thực nghiệm, kết 12 3.1.1 Chuẩn bị thuốc thử 12 3.1.2 Chuẩn bị mẫu 12 3.1.3 Xây dựng phương pháp định lượng sắt fumarat kĩ thuật cực phổ xung vi phân 13 3.2 Ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân để định lượng sắt fumarat chế phẩm 26 3.2.1 Xử lý mẫu 26 3.2.2 Kết định lượng 26 3.3 Bàn luận 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt C Concentration Nồng độ DME Dropping mecury electrode Điện cực thủy ngân nhỏ giọt DPV Differential-pulse voltammetry Cực phổ xung vi phân E Electric Potential Điện Hb Hemoglobin Huyết sắc tố HMDE Hanging mercury drop electrode Điện cực giọt thủy ngân treo I Current intensity Cường độ dòng điện RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SMDE Static mercury drop electrode Điện cực giọt thủy ngân tĩnh iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các tính chất lý hóa chung sắt fumara Bảng 1.2: Một số phương pháp định lượng sắt chế phẩm bổ sung sắt hóa chất Bảng 3.1: Các thông số máy đo cực phổ xung vi phân 13 Bảng 3.2: Kết đo cực phổ xung vi phân dung dịch sắt fumarat nồng độ 30 ppm theo mô hình 17 Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng biên độ xung bước nhảy xung đến cường độ dòng điện HMDE SMDE 20 Bảng 3.4: Điều kiện đo cực phổ xung vi phân sắt fumarat đệm amoni oxalat 0,1 M pH 6,0 21 Bảng 3.5: Kiểm tra tính thích hợp hệ thống 23 Bảng 3.6: Kết khảo sát khoảng tuyến tính kỹ thuật cực phổ xung vi phân sắt fumarat với chế độ giọt 24 Bảng 3.7: Kết kiểm tra độ độ lặp phương pháp 25 Bảng 3.8: Kết định lượng sắt fumarat chế phẩm thị trường 26 Bảng 3.9: Kết định lượng sắt fumarat chế phẩm thị trường phương pháp thêm đường chuẩn 27 Bảng 3.10: Kiểm tra độ lặp độ phép đo cực phổ xung vi phân định lượng sắt fumarat chế phẩm phương pháp thêm đường chuẩn 28 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Tế bào đo cực phổ .3 Hình 1.2: Vơn-ampe xung vi phân (DPV) .4 Hình 1.3: Ba ví dụ điện cực giọt thủy ngân: HMDE, DME SMDE Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo sắt fumarat Hình 3.1: Cực phổ đồ đệm .15 Hình 3.2: Biểu đồ Pareto mô tả ảnh hưởng thông số đo: 19 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng Fe3+ 1,5ppm lên tín hiệu lên sắt fumarat 30 ppm Hình 3.4: Các cực phổ đồ xung vi phân sắt fumarat đệm Amoni oxalat 0,1M pH 24 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn sắt fumarat 25 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn phương pháp thêm đường chuẩn để định lượng sắt fumarat chế phẩm chế độ HMDE 27 v ĐẶT VẤN ĐỀ Sắt nguyên tố vi lượng cần thiết sống Mặc dù chiếm tỉ lệ 0,004% (so với tổng trọng lượng thể) sắt thành phần cấu tạo nên huyết sắc tố (hemoglobin) hồng cầu Máu có màu đỏ sắt huyết sắc tố kết hợp với oxygen phổi tạo thành oxyhemoglobin oxygen phân phối đến mơ nhờ q trình vận chuyển hồng cầu theo mạch máu thể [4,6,15] Bình thường, 70% lượng sắt lưu thơng thể dạng hemoglobin 30% lại dự trữ dạng ferritin (có cấu tạo lớp vỏ protein; diện chủ yếu gan, lách tủy xương) hemosiderin (thành phần lại ferritin sau loại bớt protein) Ngồi ra, sắt cịn tồn lượng nhỏ thành phần số enzym liên quan đến q trình oxy hóa thể (như cytochrome, catalase, peroxidase .) myoglobin (loại protein có cấu trúc bậc III bao gồm heme chuỗi globin, nắm vai trò mang oxygen tổ chức cơ) Trung bình hồng cầu có chứa khoảng 640 triệu phân tử Hb (Hemoglobin), Hb có 0,34% Fe+2 Khi khơng đủ Fe+2 để tổng hợp lượng Hb cần thiết, kích thước hồng cầu bị nhỏ lại dẫn đến số tình trạng như: thiếu máu (anemia), hồng cầu nhỏ (microcytic), nhược sắc (hypochromic) [4] Thiếu máu thiếu sắt tình trạng thiếu máu thể không đủ sắt cho nhu cầu tạo hồng cầu, đặc biệt trẻ em phụ nữ mang thai (có thể hấp thụ 2030% lượng sắt có thức ăn) Nguyên nhân phổ biến rối loạn Việt Nam thiếu thực phẩm có chứa sắt Trong thức ăn, sắt thường dạng ferric (Fe3+ ) chất hữu cơ, vơ dạng hydroxyd liên hợp với protein Sắt có nhiều thức ăn có nguồn gốc từ thực vật, trứng sữa [13,15] Sau vào thể, q trình hấp thu sắt đường tiêu hóa diễn từ dày qua hành tá tràng kết thúc ruột non Để hấp thu, sắt chuyển từ dạng ferric sang dạng ferrous (Fe2+) nhờ acid hydrocloric dày; sau pepsin tách sắt từ hợp chất hữu để kết hợp với đường acid amin Tác dụng phụ sắt hay xảy gây táo bón; đơi gây tiêu chảy, buồn nơn [3] Ngồi chế độ ăn uống, sắt dùng dạng viên nang, viên nén, viên nhai dung dịch uống dạng ferrous như: sắt sulfat, sắt sucrose, sắt oxalat ferric như: sắt (III) hydroxide polymatose, sắt (III) pyrophosphate Đáng ý, sắt fumarat dạng sắt hữu có ưu điểm bật dễ hấp thu gây táo bón so với dạng sắt vơ (sắt sulfat) [14,15] Để định lượng sắt fumarat chế phẩm, Dược điển Mỹ, Dược điển Việt Nam V sử dụng phương pháp chuẩn độ oxi-hoá khử: chuẩn độ ngược dung dịch chuẩn độ natri thiosulfat với thị hồ tinh bột [12] chuẩn độ trực tiếp dung dịch ceri sulfat với thị feroin sulfat [2], thông qua đổi màu dung dịch quan sát mắt thường Với mong muốn đề xuất phương pháp phân tích để định lượng sắt fumarat chế phẩm, đề tài thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng sắt fumarat chế phẩm kỹ thuật cực phổ xung vi phân Ứng dụng phương pháp thẩm định để định lượng sắt fumarat chế phẩm viên nén lưu hành thị trường CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật cực phổ Phân tích von – ampe nhóm kỹ thuật điện hóa biểu diễn phụ thuộc cường độ dòng điện vào điện tiến hành điện phân dung dịch phân tích [1] Cực phổ kỹ thuật von – ampe (điện cực công tác giọt thủy ngân) nhà bác học người Tiệp Khắc, J Heyrovsky phát minh năm 1922 Điện cực nhỏ giọt thủy ngân tạo thành từ bầu đựng thủy ngân chảy qua mao quản dài khoảng 10 cm, đường kính khoảng 0,05 mm Thời gian nhỏ giọt điều chỉnh chiều cao bầu thủy ngân dao động khoảng – giây, với đường kính giọt thủy ngân 0,1 – mm Dịng điện qua điện cực dao động khoảng – 100 μA (hình 1.1) Hình 1.1: Tế bào đo cực phổ Cơ sở phép đo cực phổ dựa phản ứng oxy hóa khử chất phân tích dung dịch điện li điện cực giọt thuỷ ngân theo phản ứng: Ox + ne → Kh Trong đó: Ox: Dạng oxi hố; Kh: Dạng khử; n: Số e trao đổi Mối quan hệ cường độ dòng diện đo nồng độ chất phân tích mơ tả phương trình Ilkovic: id = 607nD1/2m2/3t1/6C Trong đó: id: Cường độ dịng cực đại giới hạn (μA); (a) (b) Hình 3.2 Biểu đồ Pareto mô tả ảnh hưởng thông số đo: (a) SMDE (b) HMDE Kết khảo sát cho thấy, thông số biên độ xung bước nhảy xung ảnh hưởng đáng kể đến kết tín hiệu cường độ dòng điện đo sắt fumarat c Khảo sát biên độ xung bước nhảy xung Tiến hành khảo sát ảnh hưởng biên độ xung (0,025  0,1V) bước nhảy xung (0,01  0,1s) đến tín hiệu cường độ dịng đo theo mơ hình Central Composite Design Kết trình bày bảng 3.3 cho thấy giá trị cường độ dòng cao biên độ xung 0,1 V bước nhảy xung 0,01s 19 Sự ảnh hưởng biên độ xung, bước nhảy xung đến tín hiệu cường độ dịng điện mơ tả theo phương trình: - Với chế độ SMDE: ▪ Cường độ dịng = 118 + 16836×Biên độ xung – 10068×Bước nhảy xung – 13301×Biên độ xung×Biên độ xung + 98068×Bước nhảy xung×Bước nhảy xung – 125942×Biên độ xung×Bước nhảy xung ( R2 = 0,9692 ) ▪ Theo dự đốn mơ hình, tín hiệu cường độ dịng lên cao –1451 nA biên độ xung 0,1 V, bước nhảy xung 0,01 s với độ tin cậy 95% cho phép kết dao động khoảng ( –1320  –1582 nA) - Với chế độ HMDE: ▪ Cường độ dịng = 72 + 22008×Biên độ xung – 8142×Bước nhảy xung – 64784×Biên độ xung×Biên độ xung + 75409×Bước nhảy xung×Bước nhảy xung – 112634×Biên độ xung×Bước nhảy xung (R2 = 0,9731) ▪ Theo dự đốn mơ hình, tín hiệu cường độ dịng lên cao –1438 nA biên độ xung 0,1 V, bước nhảy xung 0,01 s với độ tin cậy 95% cho phép kết dao động khoảng ( –1324  –1552 nA) Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng biên độ xung bước nhảy xung đến cường độ dòng điện HMDE SMDE Biên độ xung(V) Bước nhảy xung(s) I (nA) - SMDE I (nA) - HMDE 0,025 0,01 –373,2 –458,3 0,0625 0,01 –924,6 –1016 0,1 0,01 –1510 –1493 0,025 0,055 –181,7 –264,5 0,0625 0,055 –430,2 –598,2 0,1 0,055 –613,6 –690,6 0,025 0,1 –142,4 –203,8 0,0625 0,1 –305,2 –426,3 0,1 0,1 –429,1 –478,5 0,0625 0,055 –432,7 –586,7 0,0625 0,055 –434,0 –582,5 0,0625 0,055 –434,1 –604,1 0,0625 0,055 –432,2 –603,6 20 Điều kiện tối ưu cho phép đo cực phổ xung vi phân dung dịch sắt fumarat chế độ giọt trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4: Điều kiện đo cực phổ xung vi phân sắt fumarat đệm amoni oxalat 0,1 M pH 6,0 Các thông số HMDE SMDE Thời gian tích góp 60 s - Biên độ xung 0,1 V 0,1 V Bước nhảy xung 0,01 s 0,01 s Thế bắt đầu 0,12 V –0,3 V Thế kết thúc –0,3 V 0,12 V Bước nhảy mV mV Thời gian nhảy 0,5 s 0,5 s Thời gian cân 5s 5s 10 mV/s 10 mV/s 2000 vòng/phút 2000 vòng/phút Tốc độ quét Tốc độ khuấy *Ghi chú: (-): Khơng có d Khảo sát sơ ảnh hưởng Fe3+ Đo dung dịch chuẩn sắt fumarat 30ppm có mặt Fe3+ 1,5ppm với thông số lựa chọn (bảng 3.4) 21 -350 (A) HMDE -300 I(nA) -250 sắt fumarat -200 thêm Fe3+ -150 -100 -50 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3 -0.4 E(V) -350 (B) SMDE -300 -250 I(nA) sắt fumarat -200 thêm Fe3+ -150 -100 -50 50 0.2 0.1 0.0 -0.1 E(V) -0.2 -0.3 -0.4 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng Fe3+ 1,5ppm lên tín hiệu lên sắt fumarat 30 ppm (A) Chế độ giọt HMDE (B) Chế độ giọt SMDE Kết cho thấy tỉ lệ Fe3+ < 2% khơng ảnh hưởng đến tín hiệu cường độ dịng sắt fumarat 3.1.3.2 Thẩm định phương pháp a Khảo sát tính thích hợp hệ thống Tính thích hợp hệ thống xác định dựa kết phép thử song song dung dịch chuẩn sắt fumarat 30 ppm đệm amoni oxalat pH 6,0 Kết trình bày bảng 3.5, RSD < 2% chế độ đo, phương pháp đạt yêu cầu để tiến hành khảo sát 22 Bảng 3.5: Kiểm tra tính thích hợp hệ thống -Với chế độ HMDE: STT Vị trí peak (V) I(nA) –0,157 –870,2 –0,157 –869,9 –0,157 –889,8 –0,157 –888,5 –0,157 –876,4 –0,157 –899,2 TB –0,157 –882,3 SD 12,0 RSD(%) 1,4 STT Vị trí peak (V) I(nA) –0,147 –849,1 –0,147 –819,8 –0,147 –840,5 –0,147 –811,5 –0,147 –830,2 –0,147 –822,0 TB –0,147 –828,8 SD 14,0 RSD(%) 1,7 -Với chế độ SMDE: b Khảo sát khoảng tuyến tính Tiến hành khảo sát mối liên hệ cường độ dòng điện nồng độ sắt fumarat qua kỹ thuật cực phổ xung vi phân với điều kiện nêu bảng 3.4 Cách tiến hành: Hút xác khoảng 10 ml dung dịch điện ly amoni oxalat 0,1M pH 6,0 vào cốc đo Tiến hành đo mẫu, sau dùng micropipet hút xác khoảng 20 µl dung dịch chuẩn gốc sắt fumarat nồng độ 3000 ppm thêm vào cốc đo Tiến hành đo chế độ giọt HMDE, SMDE ghi lại tín hiệu Kết thể bảng 3.6, hình 3.4 3.5 cho thấy có tương quan chặt chẽ cường độ dòng điện I khoảng nồng độ sắt fumarat khảo sát (R2= 0,9981 với chế độ giọt đo) 23 Bảng 3.6: Kết khảo sát khoảng tuyến tính kỹ thuật cực phổ xung vi phân sắt fumarat với chế độ giọt Số µl dung dịch thêm vào cốc đo 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Nồng độ (ppm) I(nA)-HDME I(nA)-SMDE 5,98 11,94 17,88 23,79 29,68 35,55 41,39 47,21 53,01 –113,6 –310,3 –446,4 –584,1 –712,1 –846,4 –956,4 –1063 –1156 –144,2 –281,4 –394,6 –554,4 –679,8 –815,0 –930,4 –1043 –1130 (A) Điện ly 53,01 ppm -1600 SMDE -1400 -1200 (B) -1000 Điện ly I(nA) -800 -600 5,98 -400 -200 0.2 0.1 -0.1 E(V) -0.2 -0.3 -0.4 -0.5 Hình 3.4: Các cực phổ đồ xung vi phân sắt fumarat đệm Amoni oxalat 0,1M pH (A) HMDE 24 (B) SMDE (b) Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn sắt fumarat (a) HMDE (b) SMDE c Kiểm tra độ độ lặp phương pháp Tiến hành đo cường độ dòng mẫu thử thêm 20%, 80%, 100% chất chuẩn so với hàm lượng ghi nhãn Kết giá trị tìm lại thể bảng 3.7 Bảng 3.7: Kết kiểm tra độ độ lặp phương pháp Mẫu thêm chuẩn Thu hồi(%) (Trung bình ±SD) HMDE SMDE 20% (n=3) 69,8 ± 8,2 99,6 ± 0,4 80% (n=3) 74,4 ± 8,4 99,8 ± 1,6 100% (n=3) 78,7 ± 13,3 99,3 ± 1,1 Từ kết cho thấy, chế độ đo HMDE không đạt độ độ lặp 25 3.2 Ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân để định lượng sắt fumarat chế phẩm 3.2.1 Xử lý mẫu Cân xác khối lượng 20 viên thuốc, nghiền mịn thành bột trộn Cân xác lượng bột thuốc tương ứng với 150mg sắt fumarat hoà tan vào khoảng 25ml dung dịch HCl 0,1M, khuấy đều, đun nóng nhẹ, sau bổ sung dung dịch HCl 0,1M vừa đủ vào bình định mức 50 ml Lọc thu lấy dịch có nồng độ xác khoảng 3000 ppm 3.2.2 Kết định lượng Tiến hành định lượng phương pháp đường chuẩn, sử dụng kỹ thuật cực phổ xung vi phân với điều kiện trình bày bảng 3.4 Kết định lượng trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8: Kết định lượng sắt fumarat chế phẩm thị trường Chế phẩm Tarfloz Hàm lượng % so với nhãn (trung bình ± SD, n = 6) Chế độ giọt HMDE Chế độ giọt SMDE 80,1 ± 4,6 97,3 ± 2,7 => Chế độ đo HMDE bị ảnh hưởng mẫu Sử dụng phương pháp thêm đường chuẩn để giảm thiểu ảnh hưởng mẫu Cách tiến hành: Hút xác khoảng 10 ml dung dịch điện ly amoni oxalat 0,1M pH 6,0 vào cốc đo Thêm xác khoảng 100 µl dung dịch mẫu thử nồng độ khoảng 3000 ppm (tính theo sắt fumarat) vào cốc đo, tiến hành đo dung dịch Sau dùng micropipet hút xác khoảng 20 µl dung dịch chuẩn gốc sắt fumarat nồng độ 3000 ppm thêm vào cốc đo Tiến hành đo chế độ giọt HMDE, SMDE ghi lại tín hiệu 26 800 y = 20,913x - 613,94 R² = 0,9981 I(nA) 600 400 200 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 C(ppm) Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn phương pháp thêm đường chuẩn để định lượng sắt fumarat chế phẩm chế độ HMDE Từ đồ thị hình 3.6, tính nồng độ sắt fumarat chế phẩm điểm giao đường chuẩn với trục hoành Kết định lượng chế phẩm khảo sát độ độ lặp phép định lượng trình bày bảng 3.9, bảng 3.10 Bảng 3.9: Kết định lượng sắt fumarat chế phẩm thị trường phương pháp thêm đường chuẩn % HL so với nhãn HMDE SMDE Lần 96,3 95,1 Lần 94,5 98,4 Lần 94,4 98,3 Lần 95,9 95,1 Lần 93,2 93,1 Lần 100,0 96,0 Trung bình (%) 95,7 96,0 SD 2,4 2,1 RSD(%) 2,5 2,1 Theo quy định AOAC, độ lặp phương pháp yêu cầu RSD < 2,8%, chế phẩm đạt yêu cầu độ lặp chế độ đo HMDE SMDE 27 Bảng 3.10: Kiểm tra độ lặp độ phép đo cực phổ xung vi phân định lượng sắt fumarat chế phẩm phương pháp thêm đường chuẩn Mẫu thêm chuẩn % thu hồi -HMDE % thu hồi-SMDE 99,4 99,2 101,4 101,4 98,7 98,8 Trung bình(%) 99,8 99,8 RSD(%) 1,4 1,4 98,4 99,3 98,8 100,3 98,7 100,1 Trung bình(%) 98,6 99,9 RSD(%) 0,2 0,6 101,6 99,0 100,7 98,8 100,3 98,2 Trung bình(%) 100,9 98,7 RSD(%) 0,7 0,4 20% 40% 100% Phân tích phương sai mhân tích (One-way ANOVA) Bartlett so sánh phép đo định lượng: SMDE đường chuẩn với HMDE SMDE thêm đường chuẩn có độ độ lặp khác khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 3.3 Bàn luận Trong khoá luận này, kỹ thuật cực phổ xung vi phân nghiên cứu để định lượng sắt fumarat chế phẩm bổ sung sắt (Tarfloz, CELOGEN PHARMA PVT.LTD) Xây dựng phương pháp bắt đầu với lựa chọn dung dịch điện ly theo nghiên cứu công bố: định lượng Fe(II) chế phẩm sắt sucrose dùng đường tiêm với chế độ SMDE dùng đệm acetat 0,1 M pH 7,0 làm dung dịch điện ly; định lượng sắt acid phosphoric với chế độ SMDE dùng đệm oxalat 0,1 M pH 2,0 làm dung dịch điện ly; định lượng Fe(II) Fe(III) phức sắt sucrose ferric gluconate với chế độ HMDE dùng dung dịch LiClO4 50 g/l làm dung dịch điện ly nền; định lượng sắt acid sulfuric với chế độ HMDE dùng đệm piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) làm dung dịch điện ly [16,17,18,19,20] Kết khảo sát cho thấy tín hiệu cường độ dịng điện ghi ổn định với pic tách rõ ràng, pic sắt fumarat xuất cân đối sử dụng đệm amoni oxalat dung dịch điện ly (hình 3.1) Tối ưu hóa điều kiện phân tích cho phép đo cực phổ xung vi phân đệm amoni oxalat tiến hành với thông số như: thời gian tích góp (30 ÷ 28 90s, HMDE); biên độ xung (0,025 ÷ 0,1V); bước nhảy xung (0,01 ÷ 0,1s); bắt đầu (0,1 ÷ 0,12V, HMDE; –0,5 ÷ –0,3V, SMDE); kết thúc (–0,5 ÷ –0,3V, HMDE; 0,1 ÷ 0,12V, SMDE); bước nhảy (0,005 ÷ 0,05V); thời gian nhảy (5 ÷ 10s); thời gian cân (5 ÷ 10s); pH (2 ÷ 6); nồng độ đệm amoni oxalat (0,1 ÷ 0,3M) Kết khảo sát sàng lọc cho thấy (bảng 3.2) biên độ xung bước nhảy xung có ảnh hưởng đáng kể đến tín hiệu cường độ dịng điện điện phân sắt fumarat (hình 3.2) Qui hoạch hóa thực nghiệm theo hướng xây dựng bề mặt đáp ứng sử dụng mơ hình thiết kế trung tập phức hợp (Central Composite Design) cho hai thông số xác định điều kiện tối ưu cho phép định lượng sắt fumarat dung dịch chuẩn 30 ppm (tương ứng với 100% nồng độ làm việc định lượng sắt fumarat chế phẩm) cực phổ xung vi phân với chế độ đo HMDE SMDE (bảng 3.4) Theo quy định Dược điển Việt Nam V, tỉ lệ Fe3+ / Fe(II) chế phẩm viên nén sắt fumarat không vượt % Kết khảo sát sơ cho thấy cường độ dòng sắt fumarat bị ảnh hưởng có mặt ion Fe3+ hai chế độ đo (hình 3.3) Trên sở điều kiện phân tích lựa chọn trên, phép định lượng sắt fumarat chế phẩm thẩm định theo tiêu chí: tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính (bảng 3.6 hình 3.4, 3.5), độ độ lặp (bảng 3.7) Kết khảo sát với dung dịch chuẩn sắt fumarat 30 ppm cho thấy thông số lựa chọn máy cực phổ Computrate 797 VA hoàn tồn thỏa mãn u cầu tính thích hợp hệ thống (bảng 3.5) Cực phổ đồ xung vi phân dung dịch sắt fumarat cho thấy mối tương quan chặt chẽ cường độ dòng đo nồng độ sắt fumarat khoảng 5,98 ÷ 53,01ppm (R2= 0,9981 chế độ giọt đo) (hình 3.5) Phương pháp định lượng sắt fumarat chế phẩm phương pháp đường chuẩn, có chế độ giọt SMDE có độ lặp (RSD < 2,8%) độ khoảng 98 - 102% đạt yêu cầu cho phép phân tích hoạt chất chế phẩm (bảng 3.7) theo qui định AOAC [6] Với chế độ giọt HMDE, kết định lượng khơng đạt độ (% tìm lại chuẩn thêm vào mẫu thử) độ lặp (n = 6) ảnh hưởng tá dược có viên nén Chế độ giọt HMDE chế độ giọt treo, với thời gian tích góp 60s thành phần khác có mặt cốc đựng mẫu đo đến tích góp bề mặt giọt thuỷ ngân gây cản trở cho trình khử cực sắt fumarat (làm giảm tín hiệu cường độ dịng đo) Chính lý này, phương pháp thêm đường chuẩn nghiên cứu với hai chế độ đo HMDE SMDE Kết khảo sát cho thấy, hàm lượng sắt fumarat chế phẩm viên nén Tarfloz đạt khoảng 96% (bảng 3.9) so với nhãn, đạt giới hạn cho phép theo Dược điển Việt Nam V [2] Các phương pháp định lượng SMDE (bằng đường chuẩn), SMDE HMDE (bằng thêm đường chuẩn) khác khơng có ý nghĩa thống kê độ độ lặp (p > 0,05) 29 KẾT LUẬN Kết nghiên cứu khóa luận giải vấn đề sau: 1- Lựa chọn điều kiện thích hợp để định lượng sắt fumarat kỹ thuật cực phổ xung vi phân sau: - Dung dịch điện ly nền: đệm amoni oxalat 0,1M pH 6,0 - Thông số kỹ thuật phép đo: Các thông số Chế độ giọt HMDE Chế độ giọt SMDE Thời gian tích góp Biên độ xung 60 s 0,1 V 0,1 V Bước nhảy xung 0,01 s 0,01 s Thế bắt đầu 0,12 V –0,3 V Thế kết thúc Bước nhảy –0,3 V mV 0,12 V mV 0,5 s 5s 10 mV/s 2000 vòng/phút 0,5 s 5s 10 mV/s 2000 vòng/phút Thời gian nhảy Thời gian cân Tốc độ quét Tốc độ khuấy Khảo sát sơ ảnh hưởng ion Fe3+ ( tỉ lệ Fe3+/ Fe(II) < %) đến tín hiệu cường độ dòng pic sắt fumarat, kết cho thấy tỉ lệ nhỏ < 2% ion Fe3+ ảnh hưởng đến cường độ dòng sắt fumarat chế độ giọt đo 2- Xây dựng phép định lượng sắt fumarat chế phẩm với khoảng nồng độ tuyến tính 5,98 ÷ 53,01 ppm chế độ giọt HMDE SMDE Chế phẩm Tarfloz lưu hành thị trường khảo sát có hàm lượng sắt fumarat đạt khoảng 96% so với hàm lượng ghi nhãn Độ độ lặp chế độ đo: SMDE (đường chuẩn), SMDE HMDE (thêm đường chuẩn) đạt khoảng giới hạn cho phép độ (98-102%), độ lặp (RSD < 2,8%) 30 ĐỀ XUẤT Trên sở kết đạt được, chúng tơi có đề xuất sau: - Ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân để định lượng sắt fumarat nguyên liệu, chế phẩm lưu hành thị trường sở trang bị máy đo cực phổ đại - Nghiên cứu tìm hiểu chế phản ứng khử cực sắt fumarat điện cực giọt thuỷ ngân chế độ giọt treo (HMDE) giọt tĩnh (SMDE) - Nghiên cứu ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân để định lượng sắt fumarat chế phẩm bổ sung sắt có đa thành phần: chế phẩm sắt fumarat kết hợp với acid folic,… 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hố phân tích, Vol tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 264-287 Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học , Hà Nội, tr 856857 Bộ Y Tế (2022), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 1464-1467 Lê Thị Luyến (2021), Bệnh học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 246-257 Tiếng Anh: AOAC, “Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements”, 2016 Bhagavan NV, Ha Chung-Eun, "Metabolism of iron and heme", Essential of Medical Biochemistry (2015), pp 369–382 Harvey David (2000), “Modern analytical chemistry”, pp 729-732 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), International Conference on Harmonization, Geneva, Switzerland, pp 11-12 Merli Daniele, Profumo Antonella, et al (2012), "An analytical method for Fe (II) and Fe (III) determination in pharmaceutical grade iron sucrose complex and sodium ferric gluconate complex", 2(6), pp 450-453 10 Neiser Susann, Rentsch Daniel, et al (2015), "Physico-chemical properties of the new generation IV iron preparations ferumoxytol, iron isomaltoside 1000 and ferric carboxymaltose", Biometals, 28, pp 615-635 11 Simões Fabio Ruiz, Xavier Miguel Gustavo, et al (2017), "Electrochemical sensors", Nanoscience, 1, pp 155-178 12 The United States Phamacopeial Convention (2020), USP43-NF38, 2020, Vol 1, pp 1855-1856 13 Waldvogel-Abramowski Sophie, Waeber Gérard, et al (2014), "Physiology of iron metabolism", Transfusion Medicine and Hemotherapy, 41(3), pp 213-221 14 Zimmermann, M B., & Hurrell, R F (2007), “Nutritional iron deficiency”, The Lancet, 370(9586), pp 511–520 Trang Web: 15 Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương (2021), Thiếu máu khéo dài dẫn đến suy giảm nhận thức, https://vienhuyethoc.vn/thieu-mau-thieu-sat-keo-dai-danden-suy-giam-nhan-thuc/ ( truy cập ngày 18/05/2023) 16 Metrohm (2021), Fe(II) in iron sucrose injection (USP), https://www.metrohm.com/vi_vn/company/Company-info.html (accessed on 14/10/2022 ) 17 Metrohm, Determination of iron in the µg/L-range by polarography, https://www.metrohm.com/vi_vn/applications/ab-application-bulletins/ab317.html (accessed on 14/10/2022 ) 18 Metrohm, Iron, cadmium, lead and copper in cobalt acetate solution, https://www.metrohm.com/vi_vn/applications/application-notes/aa-v-101200/an-v-001.html (accessed on 15/10/2022 ) 19 Metrohm, Determination of iron in sulfuric acid, https://www.metrohm.com/vi_vn/applications/application-notes/aa-v-101200/an-v-132.html (accessed on 15/10/2022 ) 20 Metrohm, Determination of total iron in the ppm range in phosphoric acid, https://www.metrohm.com/vi_vn/applications/application-notes/aa-v-101200/an-v-129.html (accessed on 15/10/2022 ) 21 https://go.drugbank.com/drugs/DB14491 (accessed on 15/05/2023)