ĐỖ bá đại NGHIÊN cứu điều CHẾ và KHẢO sát một số CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO KHÔ lá PHÈN ĐEN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ BÁ ĐẠI Mã sinh viên: 1701070 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO KHƠ LÁ PHÈN ĐEN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Thái Hà Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội – người trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tơi từ ngày đầu nghiên cứu, giúp tơi hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới: ThS Phạm Thị Linh Giang – Bộ môn Thực Vật TS Phạm Lê Minh – Bộ mơn Hóa phân tích độc chất, người thầy sẵn sàng giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn mà tơi gặp phải Ban Giám Hiệu phòng ban, thầy cô giáo, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy bảo với nhiều kiến thức suốt năm học Các anh chị cao học làm thực nghiệm mơn Dược học cổ truyền ln nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình làm nghiên cứu thực nghiệm Các bạn làm khóa luận khóa 72, bạn Đào Thị Hà Lan em Ngô Thị Kim Ngân, Trần Văn Đức, Phạm Ngọc Châu, Đỗ Trang Ngân, Lý Phương Linh nhóm nghiên cứu mơn Dược học cổ truyền, tất giúp đỡ, động viên, hỗ trợ nhiều Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè ln khích lệ, giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Do kiến thức thân giới hạn nên luận văn khơng tránh khỏi hạn chế thiếu sót Tơi mong nhận góp ý, chỉnh sửa quý thầy cô, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2022 Sinh viên Đỗ Bá Đại MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Phèn đen 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại .2 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm thực vật 1.2 Tổng quan Phèn đen 1.2.1 Thành phần hóa học .3 1.2.2 Tác dụng sinh học 1.2.3 Công dụng y học cổ truyền dân gian .10 1.3 Tổng quan cao khô .11 1.3.1 Định nghĩa 11 1.3.2 Phương pháp điều chế cao khô 11 1.3.3 Yêu cầu chất lượng với cao khô 12 1.4 Các phương pháp định lượng acid gallic 12 1.4.1 Phương pháp sắc ký khí .12 1.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) .12 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .14 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 14 2.1.2 Thiết bị, máy móc 14 2.1.3 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen 15 2.3.2 Quy trình chiết xuất định lượng acid gallic toàn phần chiết dược liệu Phèn đen 17 2.3.3 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất cao khơ giàu acid gallic tồn phần từ Phèn đen .18 2.3.4 Phương pháp tối ưu hóa q trình chiết xuất cao khơ giàu acid gallic toàn phần từ Phèn đen .18 2.3.5 Điều chế cao khơ giàu acid gallic tồn phần theo thơng số quy trình chiết xuất tối ưu hóa 19 2.3.6 Khảo sát số tiêu chất lượng cao khô Phèn đen 20 2.3.7 Phương pháp xử lí số liệu 21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .22 3.1 Kết xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen .22 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 22 3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen .23 3.2 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 26 3.2.1 Nhiệt độ chiết xuất .27 3.2.2 Thời gian chiết xuất .28 3.2.3 Nồng độ EtOH (tt/tt) 28 3.3 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu .29 3.3.1 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm .29 3.3.2 Kết tối ưu hóa q trình chiết xuất .31 3.4 Kết điều chế cao khơ giàu acid gallic tồn phần theo thơng số quy trình chiết xuất tối ưu 33 3.5 Kết khảo sát số tiêu chất lượng cao khô điều chế 34 3.5.1 Cảm quan, thể chất, màu sắc, mùi vị 34 3.5.2 Mất khối lượng làm khô 34 3.5.3 Định tính sắc ký lớp mỏng 34 3.5.4 Định lượng acid gallic toàn phần 35 3.6 Bàn luận 36 3.6.1 Về phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen 36 3.6.2 Về thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao khô Phèn đen giàu acid gallic toàn phần 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 4.1 Kết luận .40 4.1.1 Về xây dựng phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 40 4.1.2 Về tối ưu hóa quy trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Phèn đen .40 4.1.3 Về khảo sát số tiêu chất lượng cao khô Phèn đen giàu acid gallic toàn phần điều chế 40 4.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKLM Sắc kí lớp mỏng TT Thuốc thử YHCT Y học cổ truyền OFAT One factor at the time CCD Mơ hình phức hợp trung tâm STT Số thứ tự tt/tt Thể tích/thể tích EtOH Ethanol MeOH Methanol EtOAc Ethylacetat GA Acid gallic DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết tính phù hợp hệ thống phương pháp định lượng .23 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng acid gallic 25 Bảng 3.3 Kết thẩm định độ xác phương pháp định lượng 25 Bảng 3.4 Kết thẩm định độ phương pháp định lượng 26 Bảng 3.5 Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm 30 Bảng 3.6 Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình biểu thị mối tương quan hàm lượng acid gallic toàn phần chiết dược liệu với biến đầu vào .32 Bảng 3.7 Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm (n=3) 33 Bảng 3.8 Kết khảo sát tiêu khối lượng làm khô 34 Bảng 3.9 Kết định lượng acid gallic tồn phần cao khơ điều chế .35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức tanin nhóm pyrogallic .3 Hình 1.2 Cơng thức tanin nhóm pyrocatechic Hình 1.3 Cơng thức acid gallic .4 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo số flavonoid Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo triterpenoid Phèn đen Hình 1.6 Công thức cấu tạo số sterol Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo p-coumaric Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo số thành phần khác Hình 2.1 Quy trình điều chế cao khơ Phèn đen giàu acid gallic toàn phần 20 Hình 3.1 Hình ảnh phổ acid gallic khoảng 230 – 350 nm 22 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu mẫu thử 23 Hình 3.3 Kết khảo sát tính đặc hiệu phương pháp định lượng GA .24 Hình Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 27 Hình 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 28 Hình 3.6 Kết khảo sát nồng độ ethanol (tt/tt) 29 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan hàm lượng acid gallic toàn phần chiết dược liệu với biến đầu vào 31 Hình 3.8 Hình ảnh cao khơ điều chế 34 Hình 3.9 Sắc ký đồ TLC cao khô Phèn đen (T) chất đối chiếu acid gallic (C).35 ĐẶT VẤN ĐỀ Phèn đen loài mọc hoang phổ biến Việt Nam, dân gian Phèn đen biết đến dược liệu quý với tác dụng nhiệt, giải độc, sát khuẩn, tiêu viêm, chữa mụn nhọn, chữa tiêu chảy, giun sán, Các nghiên cứu thực nghiệm đại tác dụng sinh học tiềm Phèn đen tính kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa Điều cho thấy Phèn đen loại dược liệu tiềm để phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa từ thiên nhiên với giá thành rẻ Tuy nhiên loại dược liệu có số lượng dồi giá thành rẻ lại chưa khai thác tiềm Thành phần hóa học Phèn đen xác định chứa nhóm chất tanin, flavonoid, đường khử, sterol Trong đó, tanin gallic acid gallic thành phần mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm cho Phèn đen Tiêu chí để đánh giá hàm lượng thành phần dựa vào hàm lượng acid gallic toàn phần Phèn đen Để hướng tới phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn, kháng viêm từ Phèn đen, việc nghiên cứu điều chế dạng bào chế cho dịch chiết dược liệu cần thiết, cao khơ dạng bán thành phẩm trung gian để tiếp tục chuyển sang dạng bào chế khác dung dịch, viên nang, viên nén, kem, gel, Việc chiết xuất để thu hàm lượng acid gallic tồn phần tối ưu đóng vai trò quan trọng định chất lượng cao khô Đồng thời việc xây dựng số tiêu chất lượng cho cao khô cần thiết để đảm bảo chất lượng cho chế phẩm trình lưu hành thị trường Từ lý trên, đề tài: “Nghiên cứu điều chế khảo sát số tiêu chất lượng cao khô Phèn đen” đề xuất nghiên cứu với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tối ưu hóa quy trình chiết xuất theo hướng tối ưu hàm lượng acid gallic toàn phần chiết dược liệu Phèn đen Điều chế cao khô Phèn đen giàu acid gallic theo thơng số quy trình chiết xuất tối ưu hóa Khảo sát số tiêu: cảm quan, khối lượng làm khơ, định tính, định lượng acid gallic tồn phần cao khô Phèn đen giàu acid gallic điều chế CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Phèn đen 1.1.1 Tên khoa học vị trí phân loại Tên khoa học: Phyllanthus reticulatus Poir [4] Tên đồng nghĩa: Phyllanthus multiforus Willd [11] Anisonema multiflora (Willd.) Wight [40] Kirganelia reticulata (Poir.) Baillon [40] Cicca microcarpa Benth [40] Kirganelia multiflora Baillon ex Thw [40] Kirganelia lineata (Willd.) Alston [40] Theo hệ thống phân loại Takhtajan “Flowering Plants” (2009), Phèn đen thuộc chi Diệp hạ châu (Phyllanthus), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), Sơ ri (Malpighiales), lớp thực vật hai mầm (Magnoliopisida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae) 1.1.2 Phân bố Phèn đen loài nhiệt đới, phân bố phổ biến nước vùng Đông – Nam Á Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, mọc khắp tỉnh, từ vùng đồng đến trung du vùng núi thấp độ cao 500m Song tỉnh có Phèn đen mọc tập trung lại vào vùng trung du Bắc Bộ, gồm Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Tây, Hịa Bình [4] Phèn đen ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc thành bụi lớn dọc theo bờ nước, ven rừng núi đá vôi, bờ nương rẫy lẩn lùm bụi quanh làng Cây có khả phân cành nhiều từ gốc, hoa nhiều hàng năm Nước chim tác nhân phát tán hạt giống khắp nơi Cây có khả tái sinh chồi khỏe sau bị chặt [4] 1.1.3 Đặc điểm thực vật [4], [16] Cây nhỏ, mọc thành bụi, cao 2-4m Cành mềm, màu nâu nhạt, lúc đầu có lơng màu xám, sau nhẵn Lá mọc so le, phiến mỏng, hình trái xoan bầu dục, gốc đầu tù nhọn, dài 1,5-3 cm, rộng 0,6-1,2 cm, hai mặt nhẵn, gần màu mặt sẫm mặt sau; cuống ngắn 2-5mm; kèm hình tam giác hẹp quy trình chiết Điều cho thấy nâng quy mơ quy trình lên 20 lần hàm lượng acid gallic tồn phần chiết khơng bị ảnh hưởng q nhiều 3.6 Bàn luận 3.6.1 Về phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen Hiện giới chưa có nghiên cứu việc xác định hoạt chất Phèn đen, đồng thời chưa có nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất Phèn đen Dựa vào nghiên cứu khoa học công bố chất phân lập từ Phèn đen nghiên cứu tác dụng sinh học Phèn đen, nhóm nghiên cứu nhận thấy có phù hợp nghiên cứu khoa học đại với cơng dụng đặc tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Phèn đen biết đến dân gian Trong đó, nhóm nghiên cứu nhận thấy thành phần acid gallic tannin gallic hợp chất có đặc tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa mạnh phân lập từ Phèn đen Trong khóa luận “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học cao chiết từ Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir thu hái Bắc Giang” dược sĩ Hoàng Thị Mỹ Linh – Đại học Dược Hà Nội, sử dụng phương pháp sắc ký điều chế phân lập chất HL-65 (chất cho vết rõ đậm mỏng silicagel) Chất HL-65 sau xác định acid gallic Những lý cho thấy, acid gallic tannin gallic hoạt chất mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Phèn đen Chỉ tiêu để đánh giá hàm lượng hoạt chất dựa vào hàm lượng acid gallic toàn phần Phèn đen Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng phương pháp định lượng acid gallic tồn phần Phèn đen Chúng tơi lựa chọn phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để tiến hành nghiên cứu phương pháp phổ biến sử dụng để định lượng acid gallic, đồng thời phương pháp có độ nhạy cao, cho kết xác Tham khảo quy trình định lượng acid gallic toàn phần dược liệu Ngũ Bội tử Dược điển Trung Quốc 2015 Dược điển Việt Nam V nhóm nghiên cứu lựa chọn hệ dung Methanol : dung dịch acid phosphoric 0,1% để tiến hành khảo sát kết điều kiện sắc ký lựa chọn sau:  Cột: C18 (250  4,6 mm; m)  Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% = 10 : 90  Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút  Dectector DAD với bước sóng 273 nm  Thể tích tiêm: 20 µl 36 Q trình thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen nhóm nghiên cứu tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ xác (độ lặp lại, độ xác trung gian), độ đạt giới hạn yêu cầu Điều cho thấy điều kiện sắc ký lựa chọn nhóm nghiên cứu hồn tồn xác Tiến hành định lượng acid gallic tự Phèn đen, cao khô Phèn đen điều chế định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen, dịch chiết tối ưu cao khô điều chế cho kết quả: - Hàm lượng acid gallic tự hàm lượng acid gallic toàn phần Phèn đen 0,42 g/100 g dược liệu 1,98 g/100 g dược liệu, cho thấy hàm lượng acid gallic tự chiếm 21,21% hàm lượng acid gallic toàn phần Phèn đen - Hàm lượng acid gallic tự hàm lượng acid gallic tồn phần cao khơ điều chế 0,31 g/100 g dược liệu 0,99 g/100 g dược liệu, cho thấy hàm lượng acid gallic tự chiếm 31,31% hàm lượng acid gallic toàn phần cao khô Phèn đen điều chế Tỷ lệ acid gallic tự do/acid gallic tồn phần cao khơ cao dược liệu dung mơi chiết lựa chọn có khả chiết tốt acid gallic tự thành phần tanin gallic (do - acid gallic tanin gallic có độ phân cực khác nhau) Hàm lượng acid gallic toàn phần chiết dược liệu tối ưu 1,05 g/100 g dược liệu Hàm lượng thấp hàm lượng acid gallic toàn phần Phèn đen 1,98 g/100 g dược liệu Hiệu suất chiết acid gallic toàn phần tối ưu 53,03% Điều lý giải acid gallic tanin gallic có cấu trúc phân tử khác nhau, dẫn đến độ phân cực khác (acid gallic có độ phân cực lớn tanin gallic có độ phân cực hơn) Dung mơi ethanol 35% đươc lựa chọn dung mơi có độ phân cực vừa phải, dung mơi phù hợp để chiết nhiều acid gallic tanin gallic khơng chiết hết hồn tồn khơng có độ phân cực phù hợp với tất hợp chất cần chiết 3.6.2 Về thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao khơ Phèn đen giàu acid gallic toàn phần Về việc lựa chọn phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) kết hợp với phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) thiết kế thí nghiệm theo mơ hình CCD: Các yếu tố nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất nồng độ ethanol dung môi biến liên tục Do đó, khảo sát lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố cần làm nhiều thí nghiệm, gây tốn Vì 37 vậy, phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng kết hợp để rút gọn thí nghiệm cho kết có độ xác, tin cậy cao Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình CCD cho phép đánh giá đầy đủ xác vai trị yếu tố tới biến đầu với số lượng thí nghiệm giảm đáng kể so với mơ hình khác phương pháp đáp ứng bề mặt (RSD), giúp tiết kiệm thời gian, cơng sức chi phí [10] Có thể thấy, với biến đầu vào, biến có mức yếu tố, thiết kế theo mơ hình đầy đủ, số thí nghiệm cần thực tối thiểu 3³ = 27 Trong đó, theo mơ hình CCD, cần N = 2³ + 2.3 + = 20 thí nghiệm (6 thí nghiệm tâm nhằm đánh giá khả lặp lại mơ hình) Về việc lựa chọn tối ưu hóa hàm lượng acid gallic tồn phần: Trong Phèn đen, acid gallic tanin gallic thành phần mang lại tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Tiêu chí dùng để đánh giá hàm lượng thành phần Phèn đen hàm lượng acid gallic tồn phần Vì việc nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết xuất acid gallic toàn phần Phèn đen lựa chọn nghiên cứu Về việc lựa chọn yếu tố dung môi chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất để khảo sát:  Lựa chọn dung môi chiết xuất Để ứng dụng bảo quản chế biến thực phẩm, ethanol thường sử dụng dung mơi an tồn [30], [51] Đồng thời, dung mơi ethanol – nước có khả hịa tan tốt chất nhóm polyphenol, dung mơi xanh, sử dụng phổ biến an tồn chiết xuất cơng nghiệp [30] Vì nhóm nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi ethanol – nước làm dung môi chiết xuất khảo sát mức nồng độ ethanol là: 0%, 25%, 50%, 75% 96%  Lựa chọn nhiệt độ chiết xuất Nhiệt độ chiết xuất khác ảnh hưởng đến trình chiết xuất hoạt chất từ dược liệu Khi chiết nhiệt độ cao 80oC làm tăng chi phí sản xuất giảm chất lượng sản phẩm hình thành hợp chất không mong muốn, làm chuyển dạng cấu trúc polyphenol phá hủy số dạng polyphenol có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa [2], [51] Đồng thời nhiệt độ cao gây nguy hiểm chiết xuất ethanol thiết bị khơng đảm bảo độ an tồn Vì vậy, đề tài giới hạn cận yếu tố nhiệt độ 80oC, đồng thời khảo sát thí nghiệm giá trị nhiệt độ 50°C, 60°C, 70°C  Lựa chọn thời gian chiết xuất Thời gian chiết xuất ảnh hưởng đến khả chiết xuất hoạt chất từ dược liệu Thời gian ngắn khiến hoạt chất chưa kịp khuếch tán hết từ dược liệu 38 môi trường, thời gian dài khiến hoạt chất bị phân hủy làm tăng số lượng tạp Vì vậy, cần phải khảo sát thời gian chiết xuất để lựa chọn thời gian chiết xuất thích hợp để thu lượng hoạt chất cao nhất, tạp khoảng thời gian ngắn Trong nghiên cứu nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát khoảng thời gian chiết xuất: 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút Các sai số xây dựng mơ hình: Các sai số giải thích số liệu thực nghiệm cịn có nhiều sai số Phần lớn sai số xảy trình thực nghiệm đến từ bước thủy phân sử dụng nồi nhơm bếp điện (có sử dụng lưới amiang) nên điều nhiệt không đều, dẫn đến mẫu cao khơng thủy phân đồng Ngồi cịn có sai số thiết bị, thao tác người thực 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian làm thực nghiệm, đề tài hoàn thành mục tiêu đề với kết cụ thể sau: 4.1.1 Về xây dựng phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đã khảo sát thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Quy trình xử lý mẫu thử: Cân xác 0,5 g dược liệu phân tán vào bình nón nút mài khơ, thêm xác 25 ml dung dịch HCl 4M, đun cách thủy 3,5 để thủy phân Làm nguội, cân lại thêm dung dịch HCl 4M đến khối lượng ban đầu Lắc đều, lọc Lấy xác 2,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 25 ml, thêm dung môi methanol 50% vào đến vạch Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký khảo sát được:  Cột: C18 (250  4,6 mm; m)  Pha động: MeOH : acid phosphoric 0,1% = 10 : 90  Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút  Dectector DAD với bước sóng 273 nm  Thể tích tiêm: 20 µl Với điều kiện sắc ký này, cho thời gian lưu acid gallic thời điểm phút hàm lượng acid gallic toàn phần Phèn đen xác định 1,98% Thẩm định phương pháp chọn qua độ đặc hiệu, độ phù hợp hệ thống, độ xác, khoảng tuyến tính, độ cho thấy đạt theo quy định AOAC 4.1.2 Về tối ưu hóa quy trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ Phèn đen Đã tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Phèn đen phương pháp thay đổi số yếu tố (OFAT) kết hợp với phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Từ lựa chọn kiều kiện chiết xuất tối ưu sau:  Nhiệt độ chiết xuất: 70oC  Thời gian chiết xuất: 40 phút  Nồng độ EtOH (tt/tt): 35% 4.1.3 Về khảo sát số tiêu chất lượng cao khô Phèn đen giàu acid gallic tồn phần điều chế Cảm quan: Cao khơ chất dạng bột mịn, khơ, dễ hút ẩm để ngồi khơng khí Màu nâu vàng, thơm, mùi thơm đặc trưng, vị đắng, chát 40 Độ ẩm: 2,76% Định tính acid gallic sắc ký lớp mỏng (TLC): Đã khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thử, chất đối chiếu điều kiện sắc ký sau:  Chuẩn bị mẫu thử: Lấy khoảng 0,1 g cao, thêm 30 ml MeOH, siêu âm 30 phút Lọc, dịch lọc đến cịn 10 ml, lấy dịch làm dung dịch chấm sắc ký  Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan acid gallic chuẩn MeOH để dung dịch có nồng độ khoảng mg/ml  Pha động: CHCl3: EtOAc: Acid formic = 5:5:1 Định lượng acid gallic toàn phần sắc lý lỏng hiệu cao (HPLC): hàm lượng acid gallic toàn phần cao khô xác định 34,298 mg/g 4.2 Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa quy trình loại tạp trình điều chế cao khơ để thu quy trình điều chế cao khơ Phèn đen giàu acid gallic toàn phần tối ưu - Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa cao khơ giàu acid gallic tồn phần điều chế - Nghiên cứu quy trình quy mô pilot quy mô công nghiệp - Bào chế sản phẩm có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa từ cao khơ giàu acid gallic tồn phần điều chế 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thượng Dong, Kỹ thuật chiết xuất dược liệu 2008, Khoa học Kỹ thuật Đỗ Thị Hà, Phạm Thị Thúy, Bùi Thị Bình, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi, (2012), "Thành phần flavanoid Phèn đen", Tạp chí Dược liệu, 17, pp 189 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất y học, Hà Nội Tiếng Anh Aarthi C, Ramesh Babu PB (2017), "Studies on the antibacterial activities of the shoot extracts of Phyllanthus species commonly found in Tamil Nadu", Journal of Innovative Research and Solutions, 3(1), pp 66-76 Akhtar Most Mauluda, Sharmin Shamima Akhtar, et al (2013), "Md Soriful Islam1, 2", International Journal of Pharmaceutical Research and Development, 5(04), pp 88-94 Akhter Shammi, Simom Hasan Md, et al (2018), "Investigation of in vivo analgesic and anti-inflammatory activities of methanol extracts of Phyllanthus reticulatus and Mimosa pigra", J Pharmacog Phytochem, 7, pp 2378-2385 Bagul Milind, Srinivasa H, et al (2005), "A rapid densitometric method for simultaneous quantification of gallic acid and ellagic acid in herbal raw materials using HPTLC", Journal of separation science, 28(6), pp 581-584 10 Bhattacharya Sankha (2021), "Central composite design for response surface methodology and its application in pharmacy", Response surface methodology in engineering science, IntechOpen 11 Chakrabarty T, Balakrishnan NP (2009), "The family Euphorbiaceae in Sikkim State, India", Journal of Economic and Taxonomic Botany, 33(3), pp 483-539 12 Chandler R Frank, Hooper Shirley N (1979), "Friedelin and associated triterpenoids", Phytochemistry, 18(5), pp 711-724 13 Chhabra SC, Mahunnah RLA, et al (1990), "Plants used in traditional medicine in Eastern Tanzania III Angiosperms (Euphorbiaceae to Menispermaceae)", Journal of Ethnopharmacology, 28(3), pp 255-283 14 Chu Tzu-Yun, Chang Chi-Hua, et al (2001), "Microwave-accelerated derivatization processes for the determination of phenolic acids by gas chromatography–mass spectrometry", Talanta, 54(6), pp 1163-1171 15 Das Biplab K, Bepary Sukumar, et al (2008), "Hepatoprotective activity of Phyllanthus reticulatus", Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 21(4) 16 Department Fisheries and Conservation, in Flora of China 2009, A Checklist for the South China Botanical Garden p 183 17 Gajera F (2009), "Movalia d and Gajera K: Quantitation of Rutin in methanolic leaf extract of Phyllanthus reticulatus Poir by high performance thin layer chromatography", Journal of Pharmaceutical Research and Development, 5(1) 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 H.N Aswatha Ram C.S Shreedhara, P Falguni Gajera, B Sachin Zanwar (2008), "Antioxidant studies of aqueous extract of Phyllanthus reticulatus Poir", Pharmacologyonline, 1, pp 351-364 Haque Tahmina, Muhsin Mohammad Didare Alam, et al (2016), "Antimicrobial and analgesic activity of leaf extracts of Phyllanthus reticulatus Poir.(FamilyEuphorbiaceae)", Jahangirnagar University Journal of Biological Sciences, 5(1), pp 81-85 Hedberg Inga, Hedberg Olov, et al (1983), "Inventory of plants used in traditional medicine in Tanzania II Plants of the families Dilleniaceae— Opiliaceae", Journal of Ethnopharmacology, 9(1), pp 105-127 Horwitz William (2010), Official methods of analysis of AOAC International Volume I, agricultural chemicals, contaminants, drugs/edited by William Horwitz, Gaithersburg (Maryland): AOAC International, 1997 Hui Wai-Haan, Li Man-Moon, et al (1976), "A new compound, 21αhydroxyfriedel-4 (23)-en-3-one and other triterpenoids from Phyllanthus reticulatus", Phytochemistry, 15(5), pp 797-798 Izhar Hafsa, Shabbir Arham, et al (2021), "Phyllanthus reticulatus Prevents Ethanol-Induced Gastric Ulcer via Downregulation of IL-8 and TNF-α Levels", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2021 Jamal AK, Yaacob WA, et al (2008), "A chemical study on Phyllanthus reticulatus", Journal of Physical Science, 19(2), pp 45-50 James Jess Mary, Neethu PC, et al (2020), "Morpho-anatomical, fluorescence, phytochemical and antibacterial studies of Phyllanthus myrtifolius Moon and Phyllanthus reticulatus Poir of Kerala" Jaya Patel, Rashmi Gaudani (2011), "Evaluation of Anti-inflammatory activity of Petroleum ether and Methanolic extract of Phyllanthus reticulatus leaves", Journal of Advanced Pharmacy Education & Research, 1(6), pp 266-270 Kapur SK, Sarin YK (1984), "Medico-botanic survey of medicinal and aromatic plants of katra valley (J & K STATE) India", Indian drugs, 22(1), pp 4-10 Khan MR (2001), "Antibacterial activity of some Tanzanian medicinal plants", Pharmaceutical biology, 39(3), pp 206-212 Khan MR, Ndaalio G, et al (1980), "Studies on African medicinal plants", Planta Medica, 40(S 1), pp 91-97 Khan Muhammad Kamran, Abert-Vian Maryline, et al (2010), "Ultrasoundassisted extraction of polyphenols (flavanone glycosides) from orange (Citrus sinensis L.) peel", Food chemistry, 119(2), pp 851-858 Khatun Hajera, Nesa Luthfun, et al (2013), "Anti-Inflammatory, Antinociceptive and CNS Depressant Activities of the Methanolic Extract of Phyllanthus reticulatus Leaves", Global Journal of Pharmacology, 7(2), pp 172-178 Khatun Mahbuba, Billah Mirajum, et al (2012), "Sterols and sterol glucoside from Phyllanthus species", Dhaka University Journal of Science, 60(1), pp 5-10 Khatun Mst Hajera, Nesa Mst Luthfun, et al (2014), "Antidiabetic and antidiarrheal effects of the methanolic extract of Phyllanthus reticulatus leaves in mice", Asian Pacific Journal of Reproduction, 3(2), pp 121-127 Lam S H., Wang C Y., et al (2007), "Chemical investigation of Phyllanthus reticulatus by HPLC-SPE-NMR and conventional methods", Phytochem Anal, 18(3), pp 251-5 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Lam Sio‐Hong, Wang Chen‐Yu, et al (2007), "Chemical investigation of Phyllanthus reticulatus by HPLC‐SPE‐NMR and conventional methods", Phytochemical Analysis: An International Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques, 18(3), pp 251-255 Maruthappan V, Shree K Sakthi (2010), "Effects of Phyllanthus reticulatus on lipid profile and oxidative stress in hypercholesterolemic albino rats", Indian journal of pharmacology, 42(6), pp 388 Maruthappan V, Shree K Sakthi (2010), "A report on the antioxidant activity of the powder of the entire plant of Phyllanthus reticulatus Poir", International Journal of Green Pharmacy (IJGP), 4(4), pp Neves AC, Neves MTC (1966), "Some determinations on the leaves of Phyllanthus reticulatus Poir of Mozambique", Bol Esc Farm Univ Coimbra, 25, pp 22 Omulokoli E, Khan B, et al (1997), "Antiplasmodial activity of four Kenyan medicinal plants", Journal of ethnopharmacology, 56(2), pp 133-137 Pojchaijongdee Nuch (2006), Chemical constituents and biological activity of Phyllanthus reticulatus Poir leaves, Thesis Pojchaijongdee Nuch, Sotanaphun Uthai, et al (2010), "Geraniinic acid derivative from the leaves of Phyllanthus reticulatus", Pharmaceutical Biology, 48(7), pp 740-744 Rahmatullah Mohammed, Rahman Md Ashikur, et al (2010), "A Pharmacological Study on Antinociceptive and Anti-hyperglycemic Effects of Methanol Extract of Leaves of Phyllanthus", Advances in Natural and Applied Sciences, 4(3), pp 229-232 Ram HNA, Shreedhara CS, et al (2009), "Hypolipidemic activity of Phyllanthus reticulatus extracts in poloxamer-407 induced hyperlipidemic rats", Biomed, 4(4), pp 366-371 Ripa Farhana Alam, Khatun Mst, et al (2014), "Antidiabetic and antidiarrheal effects of the methanolic extract of Phyllanthus reticulatus leaves in mice", pp Saha Achinta, Masud Mohammad A, et al (2007), "The analgesic and antiinflammatory activities of the extracts of Phyllanthus reticulatus In mice model", Pharmaceutical Biology, 45(5), pp 355-359 Sangkasila R (1998), Chemical constituents and some bioactivities of stem of Phyllanthus reticulatus Poir, MS Thesis Bangkok, Ramkhamhaeng University Sharma Shalini, Kumar Sunil (2013), "Phyllanthus reticulatus poir.-An important medicinal plant: A review of its phytochemistry, traditional uses and pharmacological properties", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 4(7), pp 2528 Sharma Shalini, Kumar Sunil (2013), "Phyllanthus reticulatus Poir.—an important medicinal plant: a review of its phytochemistry, traditional uses and pharmacological properties", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 4(7), pp 2528-2534 Shruthi S, Padmalatha Rai S, et al (2010), "In vitro antibacterial activities of Kirganelia reticulata baill against Methicilin-Resistant Staphilococcus aureus", Pharmacophore, 1(2), pp 123-131 Sinan Kouadio Ibrahime, de la Luz Cádiz-Gurrea María, et al (2021), "New insights on Phyllanthus reticulatus Poir leaves and stem bark extracts: UPLC- 51 52 ESI-TOF-MS profiles, and biopharmaceutical and in silico analysis", New Journal of Chemistry, 45(45), pp 21049-21065 Yen Hoang Thi, Linh Trinh Thi Thuy, et al (2015), "Optimization of extraction of phenolic compounds that have high antioxidant activity from Rhodomyrtus tomentosa (ait.) Hassk.(sim) in chi linh, Hai Duong", Academia Journal of Biology, 37(4), pp 509-519 Zokhroof Yeasmin, Sharif Tanvir, et al (2014), "Bioactivities of Malvaviscus arboreus var drummondii and Phyllanthus reticulatus Poir.", Dhaka University Journal of Pharmaceutical Sciences, 13, pp 143-147 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: DƯỢC LIỆU VÀ BỘT DƯỢC LIỆU PHỤ LỤC 2: MẪU TIÊU BẢN PHỤ LỤC 3: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN DƯỢC LIỆU PHỤ LỤC 4: GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ BÁ ĐẠI NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CAO KHÔ LÁ PHÈN ĐEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2022 ... ? ?Nghiên cứu điều chế khảo sát số tiêu chất lượng cao khô Phèn đen? ?? đề xuất nghiên cứu với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Phèn đen sắc ký lỏng hiệu cao. .. có nghiên cứu việc xác định hoạt chất Phèn đen, đồng thời chưa có nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất Phèn đen Dựa vào nghiên cứu khoa học công bố chất phân lập từ Phèn đen nghiên cứu. .. (%) Độ ẩm dược liệu đem chiết 7,35% 2.3.6 Khảo sát số tiêu chất lượng cao khô Phèn đen 2.3.6.1 Cảm quan Mô tả mẫu cao khô Phèn đen thể chất, màu sắc, mùi vị 2.3.6.2 Mất khối lượng làm khô (phụ