( Nguyễn Như Hoa và tgk ) ( Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM ) KHẢO SÁT MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG RA HOA IN VITRO Ở THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L CV SAMSUN) NGUYỄN NHƯ HOA*, BÙI VĂN LỆ** TÓM TẮT Khả năng hình thàn[.]
Nguyễn Như Hoa tgk Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ KHẢO SÁT MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG RA HOA IN VITRO Ở THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.CV SAMSUN) NGUYỄN NHƯ HOA*, BÙI VĂN LỆ** TÓM TẮT Khả hình thành hoa in vitro mẫu cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố; đó, dinh dưỡng yếu tố có vai trị quan trọng Cảm ứng hoa in vitro lát cắt biểu bì thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun cho thấy paclobutrazol yếu tố có khả kích thích cảm ứng hoa in vitro thuốc lá, việc tăng KH2PO4 giảm Fe MS khơng có khả cảm ứng hoa in vitro thuốc Từ khóa: Nicotiana tabacum L.cv Samsun, hoa invitro, paclobutrazol ABSTRACT A research on some environments for In vitro flowering in tobacco (Nicotiana tabacum L.cv Samsun) The in vitro flowering of the transplantation depends on many factors, among which nutritional factors play an important role The in vitro flowering reaction of thin cell layers epidermal tobacco Nicotiana tabacum L.cv Samsun shows that paclobutrazol can stimulate in vitro flowering in tobacco, whereas increasing KH2PO4 or reducing Fe in MS inhibit this process Keywords: Nicotiana tabacum L.cv Samsun, in vitro flowering, paclobutrazol Mở đầu Sự hoa (flowering) bước chuyển quan trọng đời sống thực vật, kiểm soát nhiều yếu tố nội sinh ngoại sinh Trong yếu tố ngoại sinh, dinh dưỡng yếu tố có vai trị quan trọng cảm ứng hoa, số phải kể đến số hợp chất chứa kali, phospho, nitơ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật… Hiện nay, cảm ứng hoa điều kiện in vitro mảng nghiên cứu thu hút ý nhiều nhà khoa học nhằm có nhìn rõ tượng hoa thực vật bậc cao ứng dụng Nguyên liệu để cảm ứng hoa điều kiện in vitro đa dạng hạt, con, in vitro, mô phân sinh ngọn, quan hoa… Mục đích việc áp dụng kĩ thuật ni cấy in vitro thường để tạo mô hình nghiên cứu hay sản phẩm thương mại Tuy nhiên, nghiên cứu nay, * ** ThS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM PGS TS, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM hoa in vitro thường khơng hồn tồn giống hoa điều kiện tự nhiên hình dạng, màu sắc, kích thước, khả thụ phấn… Cây thuốc công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao Ngồi ra, thuốc cịn có chu trình sinh trưởng, phát triển ngắn, sinh sản nhanh với số lượng lớn, thường dùng làm mơ hình cho nghiên cứu khoa học Do đó, mục đích nghiên cứu “Khảo sát số môi trường hoa in vitro thuốc (Nicotiana tabacum L.cv Samsun)” tìm mơi trường thích hợp cho hoa in vitro hoàn chỉnh thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun từ lát cắt biểu bì cuống hoa, tạo nguyên liệu cho nghiên cứu sinh lí, di truyền sâu Vật liệu, phương pháp 2.1 Đối tượng, vật liệu 2.1.1 Đối tượng Cây thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun từ Phịng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 2.1.2 Vật liệu Để tìm mơi trường thích hợp cho hoa in vitro thuốc lá, sử dụng vật liệu sau: - Cây thuốc in vitro cấy truyền sau – tuần trồng vườn từ – 10 tuần bắt đầu hoa Dùng trục phụ phát hoa khử trùng, lấy phần biểu bì, đem ni mơi trường khảo sát - Môi trường khảo sát hoa in vitro thuốc lá: môi trường MS* (Murashige Skoog 1962) [7]) thay đường sucrose thành glucose có bổ sung thêm Benzyladenine (BA) (0,5μM) α-Naphthaleacetic acid (NAA) (0,5μM) - Tùy theo mục đích thí nghiệm mơi trường bổ sung thêm: Paclobutrazol (PBZ) (2S,3S)-1-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethyl-2-(1,2,4-triazol-1-yl)pentan-3-ol) Fe-EDTA KH2PO4 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nhằm xác định mơi trường thích hợp cảm ứng hoa hồn chỉnh in vitro, chúng tơi tiến hành theo dõi tỉ lệ mẫu hoa nghiệm thức sau 60 ngày - Mẫu cấy: lát cắt dọc (chủ yếu phần biểu bì) trục phụ phát hoa khử trùng - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm gồm 18 nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần, lần 10 mẫu - Quy trình khử mẫu: Trục phát hoa ↓ Rửa nước ↓ Lau lại cồn 700 ↓ Lắc nước tẩy rửa pha loãng, ngâm – 10 phút ↓ Rửa nước cất ↓ Lắc lại nước cất vô trùng ↓ Lắc cồn 700 30 giây – phút ( tủ cấy) ↓ Lắc Javel 10 – 15 phút (tủ cấy) ↓ Rửa Javel nước cất vô trùng ( – lần) (tủ cấy) - Các môi trường khảo sát: Bảng Bảng quy ước môi trường bổ sung PBZ STT Môi trường gốc Nồng độ PBZ bổ sung (mg/l) Kí hiệu MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) P0 MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) 0,5 P1 MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) 1,0 P2 MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) 1,5 P3 MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) 2,0 P4 Số 51 năm 2013 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Bảng Bảng quy ước môi trường giảm Fe STT Lượng Fe MS (%) 10 20 30 40 50 75 Môi trường gốc MS*+ MS*+ MS*+ MS*+ MS*+ MS*+ BA (0,5μM) + BA (0,5μM) + BA (0,5μM) + BA (0,5μM) + BA (0,5μM) + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) NAA (0,5μM) NAA (0,5μM) NAA (0,5μM) NAA (0,5μM) NAA (0,5μM) Kí hiệu F1 F2 F3 F4 F5 F6 Bảng Bảng quy ước môi trường bổ sung KH2PO4 STT Môi trường gốc MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) Nồng độ KH2PO4 bổ sung (% MS) 10 20 MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) 25 50 Kí hiệu K1 K2 K3 K4 Bảng Bảng quy ước môi trường bổ sung KH2PO4, PBZ STT 3 Môi trường gốc MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) MS* + BA (0,5μM) + NAA (0,5μM) KH2PO4 bổ sung (% MS) 10 20 25 PBZ bổ sung (mg/l) 1,0 1,0 1,0 Kí hiệu K1P2 K2P2 K3P2 Kết quả, thảo luận 3.1 Khảo sát ảnh hưởng PBZ lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng PBZ đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường P0 P1 P2 P3 P4 Hàm lượng PBZ (mg/l) 0,5 1,5 Tỉ lệ hoa sau 60 ngày (%) 30 ± 8,59 33,33 ± 8,59 73,33 ± 8,59 36,67 ± 8,59 30 ± 8,59 Kết khảo sát ảnh hưởng PBZ cho thấy mơi trường thí nghiệm có khả kích thích hoa in vitro thuốc khả kích thích có phụ thuộc vào nồng độ PBZ sử dụng Sau 60 ngày, tỉ lệ hoa xuất tăng tăng nồng độ PBZ (0,5 – mg/l) môi trường cho tỉ lệ hoa cao (73,33%) P2 (MS + BA (0,5 μM) + NAA (0,5 μM) + PBZ (1,0 mg/l)) Sau đó, tiếp tục tăng nồng độ PBZ (1,5 – mg/l) tỉ lệ mẫu hoa lại giảm Hoa in vitro mơi trường cảm ứng có hoa mọc trực tiếp từ mơ sẹo, hoa mọc từ chồi Có nhiều dạng hoa, hoa thiếu vài phận, kích thước hoa nhỏ hoa ex vitro Các hoa mọc trực tiếp từ mơ sẹo thường có hình thái bất thường so với hoa mọc từ chồi Ở nghiệm thức khác xuất dạng hoa này, nhiên, tỉ lệ hoa có hình dạng tương đối bình thường nghiệm thức P2 (46,67%) cao nghiệm thức khác Bảng Tỉ lệ mẫu hoa bình thường thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun nghiệm thức bổ sung PBZ sau 60 ngày ni cấy Tỉ lệ mẫu hoa bình thường sau 60 ngày (%) Môi trường Hàm lượng PBZ (mg/l) P0 13,33 ± 6,31 P1 P2 0,5 6,67 ± 4,63 46,67 ± 9,26 P3 P4 1.5 6,67 ± 4,63 16,67 ± 6,92 PBZ có tác dụng chặn đường sinh tổng hợp gibberellin ức chế oxi hóa kaurene thành acid kaurenoic, ức chế gibberellin, ngăn cản q trình phân hủy acid abscisic Chính làm giảm tốc độ phân chia tế bào, giảm chiều cao cây, khiến bị lão hóa nhanh (Christo cộng 1995) [3] PBZ cịn tăng cường q trình quang hợp, làm tăng lượng carbohydrate, tăng lượng N, P, Ca, Mg từ thúc đẩy tăng trưởng hoa giúp tăng số lượng, chất lượng hoa (Fatma cộng 2007) [6] Ngồi ra, thí nghiệm Saposhnikovia divaricata, Euphorbia millii cho thấy liều lượng PBZ đóng vai trị quan trọng việc kích thích hoa in vitro [8,4] Nếu bổ sung PBZ với nồng độ cao dẫn đến ức chế hình thành hoa in vitro, ức chế tăng trưởng, chí làm chết in vitro Với nồng độ thích hợp, tỉ lệ cảm ứng hoa đạt đến 100% xương rồng Bát tiên Euphorbia millii – MS bổ sung mg/l PBZ; nhiên, bị ức chế tăng trưởng nồng độ sử dụng mg/lPBZ [8] Như vậy, PBZ có vai trị việc kích thích hoa in vitro thuốc Mỗi đối tượng có giới hạn nồng độ PBZ liên quan đến hoa in vitro riêng, với thuốc nồng độ PBZ bổ sung thích hợp có lẽ khoảng mg/l Thí nghiệm cho thấy nồng độ hoa in vitro tốt số lượng lẫn chất lượng, tỉ lệ hoa cao hơn, số hoa có dạng bình thường nhiều 0.5cm P0 0.5cm P1 0.5cm 0.5cm P2 0.5cm 0.5cm P3 0.5cm 0.5cm P4 0.5cm 0.5cm Hình Các dạng hoa thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun in vitro môi trường P0, P1, P2, P3, P4 sau 60 ngày nuôi cấy 3.2 Khảo sát ảnh hưởng Fe lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng Fe đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường F1 F2 F3 F4 F5 F6 P0 Hàm lượng Fe MS (%) 10 20 30 40 50 75 100 Tỉ lệ hoa sau 60 ngày (%) 0 0 0 30 ± 8,59 Sau 60 ngày thí nghiệm, 100% mẫu cấy tất môi trường cảm ứng giảm Fe không hoa, không xuất chồi Ở lần lặp lại, kết thu đồng đều, khác lần lặp lại mô sẹo thu lớn hay nhỏ Chất sắt dường cần thiết cho cảm ứng quang kì khơng cần thiết cho trình hoa trao đổi chất thông thường Sự thiếu sắt ngăn cản làm xáo trộn lớn khởi phát hoa Xanthium lúc yếu tố khác cần thiết Tuy nhiên, cách mà nguyên tố sắt can thiệp vào cảm ứng chưa biết (Trần Văn Hâu, 2009) [1] Như vậy, trường hợp thuốc lá, thiếu sắt ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoa in vitro, ngăn chặn khởi phát chồi hoa in vitro 3.3 Khảo sát ảnh hưởng P, K lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng P, K đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun sau 60 ngày nuôi cấy Hàm lượng KH2PO4 Tỉ lệ hoa Tỉ lệ chồi bổ sung (%MS) sau 60 ngày (%) sau 60 ngày (%) P0 30 ± 8,59 77,33 ± 3,43 K1 10 36,67 ± 8,95 K2 20 46,67 ± 9,26 K3 25 56,67 ± 9,20 K4 50 16,67 ± 6,92 Môi trường Sau 60 ngày thí nghiệm, 100% mẫu cấy tất mơi trường cảm ứng không hoa, số mẫu có xuất chồi Một số chồi có tượng thủy tinh Nghiệm thức K1, K2, K3 có tỉ lệ chồi xuất nhiều thời gian quan sát chưa thấy xuất hoa, nồng độ KH2PO4 10%, 20%, 25% chọn để kết hợp với PBZ thí nghiệm Trong số trường hợp, tăng nồng độ P, K môi trường nuôi cấy giúp thúc đẩy hoa in vitro xảy thuận lợi Các nghiên cứu nhân sâm Panax ginseng (Chang Hsing, 1980) [2], cà chua Lycopersicon esculentum Mill (Dielen cộng sự, 2001) [5] chứng minh bổ sung BA, cắt rễ tăng hàm lượng phosphor, kali môi trường nuôi cấy thúc đẩy hoa in vitro xảy nhanh Hay táo, số hoa có tương quan tuyến tính với hàm lượng P, K Hay giống xoài Dashehari, lượng P, K chồi cao thích hợp cho khởi phát hoa (Trần Văn Hâu, 2009) [1] Dù việc tăng nồng độ P, K mơi trường ni cấy có tác động tích cực đến hoa nhiều đối tượng thực vật, thuốc lá, theo kết thu việc điều chỉnh không cho thấy tác dụng kích thích mà cịn ức chế hoa in vitro 3.4 Khảo sát ảnh hưởng PBZ, P, K lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng PBZ, P, K đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường Hàm lượng KH2PO4 Hàm lượng PBZ Tỉ lệ hoa bổ sung (%MS) bổ sung (mg/l) sau 60 ngày (%) P0 0 30 ± 8,59 K1P2 10 1,0 K2P2 20 1,0 K3P2 25 1,0 Sau 60 ngày thí nghiệm, 100% mẫu cấy tất môi trường cảm ứng khơng hoa, số mẫu có xuất chồi Kết cho thấy tương tự thí nghiệm P, K khơng có tác dụng kích thích hoa in vitro thuốc Kết luận, kiến nghị PBZ yếu tố có khả kích thích cảm ứng hoa in vitro thuốc Sau 60 ngày, môi trường cho tỉ lệ hoa cao (73,33%) P2 (MS* + BA (0,5 µM) + NAA (0,5 µM) + PBZ (1,0 mg/l)) Việc tăng hàm lượng KH2PO4 giảm hàm lượng Fe khơng có khả cảm ứng hoa in vitro thuốc Nên tiếp tục khảo sát ảnh hưởng yếu tố khác ánh sáng, giá thể, tăng hàm lượng sắt, đồng… ảnh hưởng việc tương tác yếu tố đến cảm ứng hoa in vitro thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Văn Hâu (2009), Giáo trình xử lí hoa ăn trái, Nxb Đại học Quốc gia TPHCM Chang, W.C., Hsing, Y.I (1980), In vitro fowering of embryoids deriverd from mature root callus of ginseng (Panax ginseng), Nature, 284, pp.341-342 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Nguyễn Như Hoa tgk _ _ _ _ _ _ _ _ Christo, C.,Tsvetkov, I and Kovachev, V (1995), Use of paclobutrazol to control vegetative growth and improve fruiting efficiency of grapevines (Vitis vinifera L.), Plant physiol, 21 (4), pp.64-71 Dewir, Y.H (2006), The effects of paclobutrazol, light emitting diodes (LEDs) and sucrose on flowering of Euphorbia millii plantlets in vitro, European jounal of horticultural science, 71(6), pp.240-244 Dielen, V (2001), In vitro control of floral transition in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.), the model of autonomously flowering plant, using the late flowering uniflora mutant, Journal of experimental botany, 52, pp.715-723 Fatma, E.M (2007), Some studies on the effects of putrescine and paclobutrazol on the growth and chemical composition of Bougainvillea glabra L at Nubaria, American-Eurasian J Agric and Environ Sci., 2(5), pp.552-558 Murashige, T and Skoog, F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures., Physiologia plantarium, 15, pp.473 – 497 Qi Q., Xing, F.W., Xiao, Y.P and Chen, H.F (2009), Somatic embryogenesis and in vitro flowering in Saposhnikovia divaricata J., Plant Growth Regul, 28, pp.81 – 86 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 16-7-2013; ngày phản biện đánh giá: 18-8-2013; ngày chấp nhận đăng: 30-8-2013) 10 ... nghiêm trọng đến hoa in vitro, ngăn chặn khởi phát chồi hoa in vitro 3.3 Khảo sát ảnh hưởng P, K lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng P, K đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun... Nicotiana tabacum L.cv Samsun in vitro môi trường P0, P1, P2, P3, P4 sau 60 ngày nuôi cấy 3.2 Khảo sát ảnh hưởng Fe lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng Fe đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum. .. cịn ức chế hoa in vitro 3.4 Khảo sát ảnh hưởng PBZ, P, K lên hoa in vitro thuốc Bảng Ảnh hưởng PBZ, P, K đến hoa in vitro thuốc Nicotiana tabacum L.cv Samsun sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường Hàm