SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP CÓ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN THU NHẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT MỌT SỐ YẾU TÓ ẢNH HƯỚNG HOẠT TỈNH ENZYME CÓ DỊNH

LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập Các thầy cô môn công nghệ sinh học thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt 4,5 năm qua PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng CN Đỗ Thị Tuyến tạo điều kiện cho thực tập viện tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian thực tập Các anh chị phụ trách phịng chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM Toàn thể bạn sinh viên thực tập phòng chất có hoạt tính sinh học hết lịng giúp đỡ cung cấp nhiều kiến thức quan trọng Cùng toàn thể lớp 08SH1N thân thiện hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Cuối xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ luôn bên cạnh động viên suốt thời gian học tập trường Tháng năm 2009 Nguyễn Hoàng Anh TĨM TẮT NGUYỄN HỒNG, Đại học Tơn Đức Thắng tháng 01/2009 SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN THU NHẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH ENZYME CỐ ĐỊNH GVHD: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG VÀ CN ĐỖ THỊ TUYẾN Phịng chất có hoạt tính sinh học, viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM Chitosan polymer sinh học phân bố rộng rãi tự nhiên, đặc biệt có nhiều vỏ lồi động vật giáp xác tôm, cua, tôm hùm,… Và ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực y, dược cơng nghệ Với đặc tính chitosan, tiến hành thu nhận chitosan từ vỏ tơm sử dụng làm chất mang để cố định enzyme protease Kết thu nhận chitosan phương pháp hóa học cho hiệu suất thu nhận cao (20%) đặc tính tốt (độ hịa tan 98%, độ deacetyl 80%, độ nhớt 0,69 Pa.s) Thực cố định enzyme protease chất mang chitosan hai phương pháp (liên kết đồng hóa trị - covalent binding nhốt gel – entrapment in gel) khảo sát hoạt tính enzyme cố định phương pháp Amano Hiệu suất cố định hàm lượng protein hoạt tính protease là: 89,45% 87,08% (phương pháp liên kết đồng hóa trị); 54,07% 53,55% (phương pháp nhốt gel) Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định cho thấy khả ổn định với nhiệt độ enzyme protease cố định phương pháp liên kết đồng hóa trị cao (sau 100 phút ủ 600C, hoạt tính cịn giữ lại 67,24%), nhiên phương pháp nhốt gel enzyme protease cố định khơng có khả ổn định với nhiệt độ (hoạt tính cịn giữ lại 28,38% sau 100 phút ủ 600C) Từ khóa: chitosan, cố định, protease TÓM TẮT DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 10 Chương 1: MỞ ĐẦU 11 I Đặt vấn đề 11 II Mục tiêu đề tài 12 Mục đích 12 Giới hạn đề tài 12 Nội dung thực 12 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 I Đại cương chitin-chitosan 13 Giới thiệu chitin-chitosan 13 Cấu trúc tính chất chitin 13 2.1 Cấu trúc phân tử chitin 13 2.2 Tính chất chitin 14 3.1 Cấu trúc tính chất chitosan 14 Cấu trúc phân tử chitosan 14 3.2 Tính chất chitosan 15 3.3 Ứng dụng chitosan 15 3.3.1 Trong công nghiệp thực phẩm 15 3.3.2 Trong mỹ phẩm 16 3.3.3 Trong y tế 16 3.3.4 Trong nơng nghiệp 16 3.3.5 Trong cơng nghệ hóa học 16 3.3.6 Trong công nghệ sinh học 16 Đại cương enzyme protease enzyme cố định 16 4.1 Đại cương enzyme protease 16 4.1.1 Định nghĩa 17 4.1.2 Nguồn thu nhận 17 4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân enzyme 18 4.1.4 Ứng dụng 20 Đại cương Enzyme cố định 4.2 21 4.2.1 Định nghĩa Enzyme cố định (Enzyme khơng hịa tan) 21 4.2.2 Đặc điểm Enzyme khơng hịa tan 21 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme khơng hịa tan 22 4.2.4 Phân loại chât mang dùng đê tạo enzyme khơng hịa tan 23 4.2.5 Các phương pháp tạo enzyme khơng hịa tan 25 4.2.6 Ứng dụng Enzyme khơng hịa tan 28 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 4.3 29 4.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 29 4.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 30 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 I Thời gian địa điểm tiến hành 32 Thời gian 32 Địa điểm 32 II Vật liệu 32 III Các phương pháp nghiên cứu 32 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 32 1.1 Nguyên tắc 32 1.2 Hóa chất 33 1.3 Tiến hành thí nghiệm 33 Phương pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phương pháp Amano) 33 2.1 Nguyên tắc 33 2.2 Dụng cụ thiết bị 34 2.3 Hóa chất 34 2.4 Các bước tiến hành 34 2.5 Tính tốn 35 Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số - Kjeldahl 35 3.1 Nguyên tắc 35 3.2 Dụng cụ hóa chất 36 3.3 Cách tiến hành 36 3.4 Tính kết 37 4 Xác định hoạt tính riêng chế phẩm enzyme Xác định hàm lượng protein có 1g chất mang gắn enzyme cố định 37 37 Xác định hiệu suất cố định protein 37 Xác định hiệu suất hoạt tính enzyme cố định 38 Thu nhận chitosan từ vỏ tôm 38 8.1 Sơ đồ tổng quát 38 8.2 Quy trình thu nhận chitosan từ vỏ tơm 39 8.3 Định tính chitosan 40 Phương pháp xác định độ hịa tan 10 Xác định độ deacetyl hóa phương pháp dựa vào hàm lượng 40 đạm tổng số 11 12 13 14 40 Phương pháp xác định độ ẩm: 41 11.1 Thiết bị 41 11.2 Nguyên tắc 41 11.3 Tính tốn 41 Phương pháp xác định phosphor tổng số 42 12.1 Nội dung 42 12.2 Dụng cụ hóa chất 42 Định lượng Canxium 44 13.1 Nguyên tắc 44 13.2 Cách tiến hành 45 13.3 Chuẩn bị mẫu thử 45 13.4 Xác định tổng lượng Ca2+ Mg2+ 45 13.5 Định lượng riêng Mg2+ 45 13.6 Tính kết 45 Phương pháp cố định Enzyme protease lên chất mang chitosan 46 14.1 Phương pháp gắn kết Enzyme protease với chitosan thông qua 15 cầu nối glutaraldehyde (GA) 46 14.2 Phương pháp nhốt Enzyme protease vào chất mang chitosan 47 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố hóa lý đến hoạt tính enzyme protease ban đầu, enzyme protease cố định (E Protease cố định ) 47 15.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 47 15.2 Khảo sát độ bền nhiệt 47 15.3 Khảo sát ảnh hưởng pH 48 16 Phương pháp xác định độ nhớt dung dịch chitosan 17 Khảo sát số lần tái sử dụng Enzyme protease cố định phương pháp nhốt 48 50 Xác định hàm lượng protein hoạt tính protease chế phẩm 18 enzyme protease ban đầu 51 Xác định hàm lượng protein có 1g chất mang gắn enzyme 19 protease cố định, hiệu suất cố định protein, hiệu suất hoạt tính enzyme protease cố định 51 19.1 Cố định chất mang chitosan phương pháp gắn kết thông qua cầu nối glutaraldehyde (GA) 51 19.2 Cố định chất mang chitosan phương pháp nhốt 51 Xác định hoạt tính hoạt tính riêng enzyme protease cố 20 định 21 51 Phương pháp xử lý số liệu 51 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 Chitosan thu nhận từ vỏ tôm 52 Kết trình cố định enzyme protease chất mang chitosan 53 2.1 Kết trình cố định enzyme protease chất mang chitosan phương pháp gắn kết thông qua cầu nối GA (liên kết đồng hóa trị) 2.2 53 Kết trình cố định enzyme protease chất mang chitosan phương pháp nhốt 54 Hàm lượng protein hoạt tính chế phẩm enzyme protease ban đầu 54 Hàm lượng protein có 1g chất mang gắn enzyme protease cố định (E Protease cố định ), hiệu suất cố định protein hiệu suất hoạt tính Enzyme protease 55 Hoạt tính hoạt tính riêng Enzyme protease cố định (E Protease cố định ) 56 6 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố hóa lý đến chế phẩm enzyme protease ban đầu 56 6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 56 6.2 Độ bền nhiệt 57 6.3 Ảnh hưởng pH 59 Ảnh hưởng yếu tố hóa lý đến enzyme protease cố định phương pháp gắn kết 60 7.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 60 7.2 Độ bền nhiệt 61 7.3 Ảnh hưởng pH 63 Ảnh hưởng yếu tố hóa lý đến enzyme protease cố định phương pháp nhốt 64 8.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 64 8.2 Độ bền nhiệt 65 8.3 Ảnh hưởng pH 67 Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme protease cố định 68 9.1 Phương pháp nhốt 68 9.2 Phương pháp gắn 69 10 So sánh độ bền nhiệt chế phẩm enzyme protease ban đầu, enzyme protease cố định phương pháp nhốt cố định phương pháp gắn kết 70 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73 Kết luận 73 Đề nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC 77 PHỤ LỤC 78 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Dựng đường chuẩn albumine 25 Bảng 3.2 Tính hàm lượng % nitơ toàn phần mẫu chitosan theo lý thuyết 33 Bảng 3.3 Tính hàm lượng % nitơ toàn phần mẫu chitosan theo lý thuyết 34 Bảng 4.1 Hiệu suất thu hồi chitosan 44 Bảng 4.2 Hàm lượng protein hoạt tính protease enzyme protease ban đầu 47 Bảng 4.3 Hiệu suất cố định hàm lượng protein có 1g chất mang trang 48 Bảng 4.4 Hoạt tính riêng enzyme protease cố định (E Protease cố định ) 49 Bảng 4.5 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo nhiệt độ 49 Bảng 4.6 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease ban đầu 51 Bảng 4.7 Kết khảo sát hoạt tính enzyme protease ban đầu theo pH 52 Bảng 4.8 Kết ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 55 Bảng 4.9 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease cố định 56 Bảng 4.10 Kết khảo sát hoạt tính enzyme cố định theo pH 57 Bảng 4.11 Kết khảo sát hoạt tính enzyme theo nhiệt độ 59 Bảng 4.12 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease cố định 60 Bảng 4.13 Kết khảo sát hoạt tính enzyme cố định theo pH 61 Bảng 4.14 Kết khảo sát số lần tái sử dụng enzyme protease cố định 63 Bảng 4.15 Kết so sánh độ bền nhiệt enzym protease ban đầu với enzyme protease cố định hai phương pháp 64 DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc phân tử chitin Hình 1.2 Cấu trúc phân tử chitosan Hình 3.1 Cấu tạo nhớt kế mao quản Ostwald 37 Hình 3.2 Nguyên lý gắn kết Enzyme với chtiosan thông qua cầu nối GA 38 Hình 4.1 Chitosan thu nhận từ vỏ tơm 42 Hình 4.2 Kết Enzyme protease cố định phương pháp liên kết đồng hóa trị 44 Hình 4.3 Enzyme protease cố định gel chitosan 44 Biểu đồ Biểu đồ 4.1 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo nhiệt độ 48 Biểu đồ 4.2 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo thời gian ủ 600C 49 Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease ban đầu theo pH 50 Biểu đồ 4.4 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo nhiệt độ 51 Biểu đồ 4.5 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo thời gian ủ 53 Biểu đồ 4.6 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme cố định theo pH 54 Biểu đồ 4.7 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme theo nhiệt độ 55 Biểu đồ 4.8 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme cố định theo thời gian ủ 56 Biểu đồ 4.9 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo pH 57 Biểu đồ 4.10 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng 59 Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng… Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn độ bền nhiệt ba loại enzyme protease 60 Sơ đồ Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát để thu nhận chitosan từ vỏ tôm 32 Sơ đồ 3.2 Quy trình thu nhận chitosan từ vỏ tôm 33 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTPT: Công thức phân tử ELISA: Enzyme link immunosorbent assay HRP: Horseradish Peroxidase Ctv: Cộng tác viên PHEMA: Polyhydroxy ethyl metrhcryla TCA: Tricloroacetic GA: Glutaraldehyde TPP: Tripolyphosphate CBB: Coomassie brilliant blue OD: Optical density UV: Ultraviolet HTR: Hoạt tính riêng DD: Degree of Deacetylation E Protease cố định : Enzyme protease cố định 10 Biểu đồ 4.7 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme theo nhiệt độ Dựa vào đồ thị ta thấy hoạt tính enzyme protease cố định tăng dần từ 30 0C đạt giá trị cao 62 0C Tuy nhiên lại giảm nhanh từ 67 0C đến 77 0C Điều giải thích sau: cố định phương pháp nhốt gel chitosan, enzyme protease bảo vệ hệ gel chịu tác động nhiệt độ, nhiệt độ tối ưu enzyme cố định tăng lên 62 0C so với chế phẩm enzyme ban đầu 57 0C, nhiên tăng nhiệt độ cao (67 0C) làm ảnh hưởng lớn đến lớp gel chitosan (bị mềm nhũn) làm ảnh hưởng đến enzyme bảo vệ phía Tuy nhiên nhận thấy đồ thị từ 30 – 62 0C, hoạt tính enzyme protease cố định phương pháp nhốt tăng ổn định so với chế phẩm enzyme protease ban đầu enzyme protease cố định phương pháp gắn kết 8.2 Độ bền nhiệt Cân 0,3 g enzyme protease cố định hòa 1ml đ ệm phosphate pH Tiến hành thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt lên hoạt tính enzyme protease cố định Kết khảo sát trình bày bảng sau đây: Bảng 4.12 Kết khảo sát độ bền nhiệt enzyme protease cố định 65 Phần trăm Thời gian ủ Hoạt tính hoạt tính giữ 600C (UI/g) lại (%) 45.8 100 10 45.3 98.91 20 44.5 97.16 30 36.8 80.35 40 31 67.69 50 27.5 60.04 60 24.7 53.93 70 19.6 42.79 80 15.5 33.84 90 14.2 31.00 100 13 28.38 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo thời gian ủ 600C Độ bền nhiệt enzyme protease cố định 50 (UI/ ) 45 40 35 30 ảnh hưởng thời gian ủ lên hoạt tính enzyme 25 20 í h 15 Ho 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 o thời gian ủ enzyme 60 C Biểu đồ 4.8 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme cố định theo thời gian ủ Dựa vào đồ thị, ta thấy lần ủ thứ (20 phút) hoạt tính enzyme protease cố định cịn giữ lại cao (98,91 %) Tuy nhiên, lần ủ (40 phút) hoạt tính 66 enzyme protease cố định giảm nhanh chóng (67,69 %) giảm dần lần ủ cuối cịn giữ lại 28,38 % hoạt tính lần ủ thứ (100 phút) Điều dễ hiểu giải thích sau: lần ủ thứ (20 phút) lớp gel chitosan bảo vệ enzyme protease chắn nên enzyme protease bên chịu tác động nhiệt độ hoạt tính enzyme protease cố định giảm khơng đáng kể, lần ủ tác dụng với nhiệt độ thời gian kéo dài lớp gel chitosan mềm khả bảo vệ enzyme protease bên khơng cao hoạt tính enzyme protease cố định giảm dần theo thời gian ủ 8.3 Ảnh hưởng pH Cân 0,3 g enzyme protease cố định hòa 1ml đệm phosphate pH – pH 12 Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme protease cố định Kết khảo sát trình bày bảng sau đây: Bảng 4.13 Kết khảo sát hoạt tính enzyme cố định theo pH pH Hoạt tính (UI/g) 10 11 12 6,2 6,6 7,3 12,6 28,9 34,3 44,4 38,5 36,7 32,7 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo pH Biểu đồ 4.9 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo pH Dựa vào đồ thị ta thấy hoạt tính enzyme protease cố định thấp giá trị từ pH đến pH Trong khoảng pH đến pH 12, hoạt tính enzyme protease cố định ổn định đạt giá trị cao pH Khác với việc cố định phương pháp gắn kết, 67 phương pháp nhốt pH enzyme protease cố định có xu hướng chuyển dịch sang hướng kiềm (tối ưu pH 9) Điều có lẽ việc nhốt enzyme protease bên gel chitosan không ảnh hưởng đến cấu hình enzyme, chất chế phẩm enzyme protease ban đầu hoạt động tốt mơi trường kiềm, enzyme protease cố định có xu hướng chuyển dịch pH sang kiềm Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme protease cố định 9.1 Phương pháp nhốt Cân 0,3 g enzyme protease cố định hòa 1ml đ ệm phosphate pH Tiến hành thí nghiệm khảo sát số lần tái sử dụng lên hoạt tính enzyme protease cố định Kết khảo sát trình bày bảng sau đây: Bảng 4.14 Kết khảo sát số lần tái sử dụng enzyme protease cố định băng phương pháp nhốt Số lần Hoạt tính (UI/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 42,3 100 31,1 73,52 21,2 50,12 20,7 48,94 11,3 26,71 7,7 18,2 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo số lần tái sử dụng 68 Biểu đồ 4.10 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng Việc tái sử dụng nhiều lần enzyme sau cố định ưu điểm có giá trị mặt kinh tế enzyme cố định Tuy nhiên sau lần tái sử dụng hoạt tính enzyme cố định giảm, việc giảm nhiều hay vấn đề Dựa vào kết khảo sát đây, ta nhận thấy việc cố định enzyme protease gel chitosan cho hiệu suất tái sử dụng không cao, lần thứ hoạt tính gi ảm 50% giảm nhiều lần sử dụng Điều d ễ hiểu thực việc khảo sát nhiệt độ độ bền nhiệt nhận thấy việc bảo vệ lớp gel chitosan không tốt, số lần tái sử dụng khơng cao Vấn đề cần nghiên cứu thêm để sử dụng kết hợp chitosan polymer để tăng khả bảo vệ lớp gel 9.2 Phương pháp gắn liên kết Cân 0,3 g enzyme protease cố định hòa 1ml đệm phosphate pH Tiến hành thí nghiệm khảo sát số lần tái sử dụng lên hoạt tính enzyme protease cố định Kết khảo sát trình bày bảng sau đây: Bảng 4.14 Kết khảo sát số lần tái sử dụng enzyme protease cố định phương pháp gắn 69 Phần trăm hoạt Số lần Hoạt tính (UI/g) tính giữ lại % 36.2 100 32.4 89.50 26.6 73.48 22.3 61.60 18.9 52.21 16.8 46.41 14.3 39.50 12.8 35.36 10.9 30.11 10 7.8 21.55 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng Hoạt tính enzyme protease cố định theo số lần tái sử dụng (UI/ ) 40 35 30 hoạt tính enzyme protease cố định theo số lần tái sử dụng t 25 20 15 ho t tí h 10 0 10 số lần tái sử dụng Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng Dựa vào kết khảo sát đây, ta nhận thấy việc cố định enzyme protease phương pháp gắn liên kết cho hiệu suất tái sử dụng cao, tới lần thứ hoạt tính 50% mức độ giảm lần sau thấp 10 So sánh độ bền nhiệt chế phẩm enzyme protease ban đầu, enzyme protease cố định phương pháp nhốt cố định phương pháp gắn kết 70 Tiến hành thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt chế phẩm enzyme protease ban đầu, enzyme protease cố định phương pháp gắn kết enzyme protease cố định phương pháp nhốt Kết trình bày bảng sau đây: Bảng 4.15 Kết so sánh độ bền nhiệt enzym protease ban đầu với enzyme protease cố định hai phương pháp Phần trăm hoạt tính Enzyme giữ lại (%) Thời gian ủ enzyme protease 600C (phút) Chế phẩm enzyme protease ban đầu Enzyme protease Enzyme protease cố định cố định phương pháp phương pháp gắn nhốt kết 100 100 100 10 87.83 98.91 98.29 20 77.59 97.16 95.60 30 67.87 80.35 94.13 40 59.49 67.69 92.42 50 51.76 60.04 87.29 60 42.25 53.93 81.42 70 31.79 42.79 77.26 80 26.07 33.84 72.86 90 24.42 31.00 70.66 100 23.34 28.38 67.24 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme theo thời gian ủ 60 0C loại enzyme protease 71 Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 120 enzyme protease ban đầu 100 enzyme protease cố định bằ ng phương pháp nhốt enzyme protease cố định bằ ng phương pháp gắn 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 thời gian ủ enzyme 60oC Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn độ bền nhiệt ba loại enzyme protease Dựa vào đồ thị ta thấy khả bền với nhiệt độ enzyme protease cố định phương pháp gắn kết cao với lần ủ thứ (100 phút) mà hoạt tính giữ lại tới 67,24 %, enzyme protease cố định phương pháp nhốt giữ lại 28,38 % Tuy nhiên so sánh lần ủ thứ (20 phút) hoạt tính enzyme protease cố định phương pháp nhốt lại cao (98,91 % so với 95,29 %) Rõ ràng việc giữ lại hoạt tính enzyme protease cố định phương pháp nhốt s ẽ cao có biện pháp cải thiện lớp gel chitosan nhốt enzyme protease 72 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Với kết thu được, đưa kết luận sau: Chitosan thu nhận có đặc tính sau: + Hiệu suất thu nhận: 20 % + Màu sắc: màu trắng hồng + Độ hòa tan: 98 % + Độ deacetyl hóa: 80 % + Độ nhớt: 0,69 Pa.s + Độ ẩm: + Khoáng tổng số: + Hàm lượng Canxi: + Hàm lượng phosphor: Enzyme protease cố định chất mang chitosan phương pháp nhốt + Hiệu suất cố định hàm lượng protein: 54,07 % + Hiệu suất cố định hoạt tính protease: 53,55 % + Hàm lượng protein có 1g chất mang: 2,86 mg/g + Hoạt tính riêng: 130 UI/mg + Nhiệt độ tối ưu: 62 0C + pH tối ưu: + Độ bền nhiệt: sau 100 phút ủ 60 0C, phần trăm hoạt tính cịn giữ lại 28,38 % + Số lần tái sử dụng: sau lần tái sử dụng, phần trăm hoạt tính cịn giữ lại 18,2 % Enzyme protease cố định chất mang chitosan phương pháp gắn kết thông qua cầu nối glutaraldehyde (GA) + Hiệu suất cố định hàm lượng protein: 89,45 % + Hiệu suất cố định hoạt tính protease: 87,08 % + Hàm lượng protein có 1g chất mang: 10,42 mg/g + Hoạt tính riêng: 162 UI/mg + Nhiệt độ tối ưu: 62 0C 73 + pH tối ưu: + Độ bền nhiệt: sau 100 phút ủ 60 0C, phần trăm hoạt tính cịn giữ lại 67,24 % + Số lần tái sử dụng: sau 10 lần tái sử dụng phần trăm hoạt tính cịn giữ lại 21,55% Đề nghị Qua q trình thực đề tài, chúng tơi có sô đề nghị sau: + Cần nghiên cứu để tăng hiệu suất cố định protein nh hiệu suất cố định hoạt tính enzyme protease cố định phương pháp nhốt + Cần có biện pháp cải thiện gel chitosan để tăng khả ổn định với nhiệt độ, độ bền nhiệt số lần tái sử dụng enzyme protease cố định + Cần nghiên cứu để tăng hoạt tính enzyme protease cố định cho hoạt động nhiệt độ cao (67-77 0C) phương pháp cố định + Cần có biện pháp để tái sử dụng enzyme protease cố định chất mang chitosan phương pháp liên kết thông qua cầu nối glutaraldehyde (GA) + Sử dụng chitosan để cố định nhiều loại enzyme khác nhau, từ so sánh để hiểu rõ khả cố định enzyme chitosan 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Đức Lượng, 2004, Công nghệ Enzyme, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Đồng Thị Minh Trang, 2002 Nghiên cứu sản xuất chitosan từ phế liệu vỏ tơm Khóa luận tốt nghiệp Kỷ sư Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM Trương Vĩnh, 2006 Xác định độ ẩm độ nhớt Thực tập mơn học: Các q trình học, Đại Học Nông Lâm TpHCM Nguyễn Ngọc Thuần Lê Phạm Thư Quyên,2002 Chiết tách chitosan từ vỏ tôm bước đầu ứng dụng tạo màng bảo quản thực phẩm Khóa luận tốt nghiệp Kỷ sư Cơng Nghệ Thực Phẩm, Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, 2002 Phạm Quốc Thắng, 2007 Cố định Enzyme lipase khảo sát số đặc tính Enzyme cố định Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM Phạm Thị Ánh Hồng, 2003, Kỹ thuật sinh hóa, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Trần Thị Ngọc Hà, 2007 Thử nghiệm khả ứng dụng protease từ nội tạng tôm sản xuất chitin Khóa luận tốt nghiệp Kỷ sư Cơng Nghệ Sinh Học, Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM Lê Thị Khánh Quyên, 2006 Cố định Enzyme protease chất mang khác Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Khoa Học, Đại Học Mở Tp.HCM Phạm Thị Bích Ngọc, 2006 Cố định Enzyme lipase khảo sát số đặc tính Enzyme cố định Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Khoa Học, Đại Học Mở Bán Công Tp.HCM 10 Lê Ngọc Tú, 2005 Hóa sinh cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa Học Kỷ Thuật Hà Nội 75 Tài liệu nước 11 Adriano W S., Filho E H.C., Silva J A., Giordano R L C., and Goncalves L R B., 2005 Stabilization of Penicillin G Acylase by imobilization on glutaraldehyde-activated chitosan Brazilian Journal of Chemical Engineering 04: tr 529 – 538 Chemical Engineering Department, Federal University of São Carlos - SP, Brazil 12 KILINC A., ONAL S., and TELEFONCU A., 2001 Stabilization of Papain by Modification with Chitosan Turk J Chem 26: tr 311 – 316 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Ege University, Turkey 13 Taquieddin E., Lee C., and Amiji M., 2002 Perm – Selective chitosan – alginate hybrid microcapsules for Enzyme immobilization technology Pharmaceutical engineering 06: vol 22 The official journal of ISPE, USA 14 Zubriene A., Budriene S., Gorochovceva N., Romaskevic T., Matulionis E., and Dienys G., 2003 Immobilization of hydrolase onto chitosan microparticles 15 JenHsieh H., Liu P.C., and Liao W.J., 2000 Immobilization of invertase via carbohydrate moiety on chitosan to enhance its thermal stability Biotechnology Letters 22: tr 1459–1464 Department of Chemical Engineering, National Taiwan University, Taipei, Taiwan, Republic of China 16 D.S Yoon et al, 2007 Continuous removal of hydrogen peroxide with immobilised catalase for wastewater reuse, Water Science and Technology 02: tr 27-33 Department of Chemical Engineering, Chungbuk National University, Korea Tài liệu internet http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bb/Chitosan_Synthese.svg/712pxChitosan_Synthese.svg.png http://www.freewebs.com/amtomson/chitosan.bmp http://www.hoahocvietnam.com/Home/Moi-tuan-mot-hoa-chat/index.html http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech 76 PHỤ LỤC Đường chuẩn albumin đường chuẩn tyrosine Hình: Đường chuẩn albumine Hình: Đường chuẩn tyrosine 77 PHỤ LỤC Một số hình ảnh máy móc, thiết bị sử dụng nghiên cứu Hình: Máy Kjeldahl bán tự động cân phân tích số Hình: Tủ ấm 78 Hình: Bể ổn nhiệt Hình: Máy UV - Vis 79 ... sau 100 phút ủ 600C) Từ khóa: chitosan, cố định, protease TĨM TẮT DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 10 Chương 1: MỞ ĐẦU 11 I Đặt vấn đề 11 II... đới như: đu đủ, dứa, sung, articho đậu tương Ví dụ: + Papain có mủ đu đủ, đu đủ xanh + Bromelin có thân thơm thơm xanh + Ficin có mủ sung, sung, vả  Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả... với kháng thể, giúp chẩn đoán nhanh xác (kỹ thuật ELISA) Enzyme L – asparaginase có khả ức chế phát triển u ác tính, đưa trực tiếp enzyme vào thể bị đưa ngồi nhanh chóng gây nên tượng dị ứng,