Khảo sát một số phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI KHAMLOY KEOMONGSA KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ơ ĐỎ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI KHAMLOY KEOMONGSA Mã sinh viên: 1401325 KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ô ĐỎ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn ThS Phạm Thái Hà Văn Nơi thực Bộ môn Dƣợc học cổ truyền Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này, lời em xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới Đảng Chính phủ nƣớc Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam tạo điều kiện cho em đƣợc học tập có điều kiện tham gia nghiên cứu khoa học, thực đề tài suốt thời gian vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô Bộ môn Dược học cổ truyền, ThS Phạm Thái Hà Văn tận tình trực tiếp bảo hƣớng dẫn em suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô chị kĩ thuật viên Bộ môn Dƣợc học cổ truyền giúp đỡ, bảo đồng hành suốt thời gian tơi làm khóa luận mơn Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh giúp đỡ, ủng hộ suốt thời gian học tập trƣờng, đặc biệt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Khamloy KEOMONGSA MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vị thuốc Hà thủ ô đỏ 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Bộ phận dùng công dụng 1.1.3 Thành phần hóa học rễ củ 1.2 Một số thuốc có vị thuốc Hà thủ đỏ 1.2.1 Chữa tóc rụng bạc sớm, chóng mặt, ù tai, hoa mắt, đau mỏi lƣng khớp, táo bón 1.2.2 Chữa phong thấp đau lƣng, viêm dây thần kinh hơng, vận động khó khăn 1.2.3 Thuốc bổ dùng cho ngƣời già yếu, thần kinh suy nhƣợc, tiêu hóa 1.2.4 Thuốc bổ khí huyết, mạnh gân cốt 1.2.5 Thất bảo mỹ nhiệm đơn 1.2.6 Hà nhân ẩm 1.3 Chế biến Hà thủ ô đỏ 1.3.1 Mục đích 1.3.2 Phƣơng pháp chế biến 1.3.3 Một số phụ liệu dùng chế biến 1.4 Hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 1.5 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 1.5.1 Sắc ký lớp mỏng 1.5.2 Ƣu điểm thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) 11 1.5.3 Ứng dụng TLC nghiên cứu dƣợc liệu 12 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14 2.1.2 Hóa chất dụng cụ 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Chế biến dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ 16 2.3.2 Định tính bán định lƣợng thành phần THSG mẫu Hà thủ ô đỏ chế biến phƣơng pháp TLC-videoscan 17 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Hiệu suất số tiêu cao khô Hà thủ ô đỏ 21 3.1.1 Các tiêu cảm quan định tính hóa học 21 3.1.2 Hiệu suất bào chế cao Hà thủ ô 22 3.2 Kết định tính sắc ký lớp mỏng 23 3.3 Kết định lƣợng 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADP Adenosine-5'-diphosphat DL Dƣợc liệu DM Dung môi DPPH α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl GOT Glutamic oxaloacetic transaminase GPT Glutamic pyruvic transaminase HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography HSCC High-speed countamrent chromatography HTOĐ Hà thủ ô đỏ NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate SKLM Sắc ký lớp mỏng THSG 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β -D-glucosid TLC Thin Layer Chromatography UV Utra Violet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin thuốc Thất bảo mỹ nhiệm đơn Bảng 2.1 Các mẫu thể tích chấm mỏng định tính THSG, mẫu chế Hà thủ đỏ mẫu sống 18 Bảng 2.2 Các mẫu thể tích chấm mỏng định tính, định lƣợng THSG, mẫu chế Hà thủ ô đỏ Và mẫu sống 19 Bảng 3.1 Độ ẩm mẫu cao Hà thủ ô đỏ chế 22 Bảng 3.2 Hiệu suất mẫu cao khô Hà thủ ô đỏ chế theo quy trình điều chế điều kiện khác (%) 22 Bảng 3.3 Giá trị Rf mỏng định tính 366 nm 23 Bảng 3.4: Nồng độ THSG chuẩn diện tích Pic đáp ứng 27 Bảng 3.5 Kết bán định lƣợng 28 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Hà thủ đỏ Hình 1.2 Cấu trúc hóa học 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucoside Hình 2.1 Nguyên liệu chế Hà thủ ô đỏ chƣa chế 14 Hình 2.2 Máy cất quay thu hồi dung môi IKA 15 Hình 2.3 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC 15 Hình 3.1 Dƣợc liệu Hà Thủ Ô chế 21 Hình 3.2 Hình ảnh cao khơ sau chế biến lần lƣợt với đậu đen lần (1), lần (2), lần (3) 21 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại 24 Hình 3.4.a Sắc ký đồ mẫu quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng λ= 254 nm (A), λ= 366 nm (B) 25 Hình 3.4.b Sắc ký đồ mẫu quan sát dƣới ánh sáng trắng (C) 26 Hình 3.5 Kết xây dựng đƣờng chuẩn THSG (Stilben) từ chiều cao pic sắc ký dãy nồng độ khảo sát 27 Hình 3.6 Kết xây dựng đƣờng chuẩn THSG (Stilben) từ diện tích pic sắc ký dãy nồng độ khảo sát 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Hà thủ ô đỏ dƣợc liệu quý đƣợc nhân dân nƣớc châu Á sử dụng với nhiều tên gọi khác nhƣ hợp, giao đằng,… Bộ phận rễ củ có tác dụng bổ máu, trị di tinh, đới bạ (khí hƣ), thần kinh suy nhƣợc, sốt rét kinh niên, máu, bổ gan thận, làm đen râu tóc Bộ phận mặt đất có tác dụng dƣỡng tâm an thần, dƣỡng huyết hoạt lạc,… [5] Hà thủ đỏ có mặt nhiều thuốc cổ phƣơng [2] Trong đông y vị thuốc nói chung trƣớc dùng để uống phải trải qua chế biến theo nhiều phƣơng pháp cổ truyền khác để đạt đƣợc mục đích việc chữa bệnh: tăng quy kinh, giảm độc tính, tăng tác dụng,… vị thuốc Do đó, với dƣợc liệu cần chọn phƣơng pháp chế biến thích hợp để có hiệu tốt nhất, phù hợp với tình trạng bệnh Theo dƣợc điển Việt Nam IV, Hà thủ ô đỏ chế biến với phụ liệu đậu đen nƣớc vo gạo, dùng phƣơng pháp cửu chƣng cửu sái Tuy nhiên, nhiều thông số kỹ thuật q trình chế biến Hà thủ đỏ chƣa đƣợc làm rõ, cần có nghiên cứu sâu để xây dựng quy trình chuẩn để chế biến Hà thủ ô đỏ đạt hiệu trị bệnh tốt Đặc biệt số lần đồ với đỗ đen quy trình chuẩn [3], sở sản xuất tuân thủ đủ số lần chế biến (9 lần chƣng, lần sái) mà thƣờng rút ngắn số lần chƣng - sái Việc giải toán kinh tế với vấn đề chất lƣợng sản phẩm Hà thủ ô đỏ đƣợc đặt cho nhà khoa học Với mục tiêu nghiên cứu, tiến tới tiêu chuẩn hóa phƣơng pháp chế biến vị thuốc cổ truyền này, đề tài “Cải tiến quy trình chế biến Hà thủ đỏ” đƣợc tiến hành với mục tiêu: - Khảo sát số lần chƣng – sái dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ - Định tính bán định lƣợng hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2O-β-D-glucosid dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ chế sắc ký lớp mỏng, so sánh với mẫu dƣợc liệu sống CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vị thuốc Hà thủ ô đỏ 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thumb.) Haradlson, họ Rau răm (Polygonaceae) Tên gọi khác: Polygonum multiflorum (Thumb.) Haradlson Hà thủ ô đỏ theo dân gian đƣợc hay đƣợc gọi Dạ dao đằng ban đêm hai quấn thân vào [6], [9] Đây loại dây leo, sống nhiều năm Mặt thân màu xanh tía, có vân, nhẵn, khơng có lơng Lá mọc so le, có cuống dài, phiến hình tim hẹp dài 4-8 cm, rộng 2,5- cm, đầu nhọn, gốc hình tim hình mũi tên, mép nguyên lƣợn sóng, mặt nhẵn khơng có lơng Lá kèm mỏng, màu nâu nhạt, ơm lấy thân Hoa mọc thành chùm, nhiều nhánh, cánh hoa màu trắng Hoa nhỏ, đƣờng kính 2mm, có cuống ngắn 1- mm Bầu nhụy hình cạnh, vòi nhụy rời, ngắn Quả đóng hình thấu kính [9] (Hình 1.1) Hình 1.1 Cây Hà thủ đỏ(nguồn hình thuốc động vật làm thuốc Việt Nam) Hà thủ ô phân bố rộng khắp quốc gia Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Ở Việt Nam, mọc hoang từ Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang vào Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Tây Ngun Thƣờng gặp dƣới tán tràng bụi, rừng thƣa ven suối hay ven đƣờng râm mát chân núi khe [15] Kimura, Y., Ohminami, H., Okuda, H., Baba, K., Kozawa, M., & Arichi, S (1983), “Effects of Stilbene Components of Roots of Polygonum ssp on Liver Injury in Peroxidized Oil-fed Rats”, Planta Medica, 49(09), 51–54 [16] Ryu, G., Ju, J H., Park, Y J., Ryu, S Y., Choi, B W., & Lee, B H (2002), “The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum”, Archives of Pharmacal Research, 25(5), 636–639 [17] T Wang, J Gu, P Wu et al., “Protection by tetrahydroxystilbene glucoside against cerebral ischemia: involvement of JNK, SIRT1, and NF-𝜅B pathways and inhibition of intracellular ROS RNS generation,” Free Radical Biology & Medicine, vol 47, no 3, pp 229–240, 2009 [18] X Wang, L Zhao, T Han, S Chen, and J Wang, “Protective effects of 2,3,5,4’ -tetrahydroxystilbene-2-O-beta-d-glucoside, an active component of Polygonum multiflorum Thunb, on experimental colitis in mice” , European Journal of Pharmacology, vol 578, no 2-3, pp 339–348, 2008 [19] W Yao, W Fan, C Huang, H Zhong, X Chen, and W Zhang, “Proteomic analysis for anti-atherosclerotic effect of tetrahydroxystilbene glucoside in rats,” Biomedicine & Pharmacotherapy, vol 67, no 2, pp 140–145, 2013 Tài liệu từ internet [20] http://www.camag.com/en/home.cfm PHỤ LỤC HÌNH ẢNH PIC SẮC KÝ CÁC MẪU NGHIÊN CỨU BẰNG TLC CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Image document data File Created by Generated on ID C:\Documents and Settings\Easy XP\Desktop\loy.JPG LOY Tuesday, April 23, 2019 12:16:30 AM 1555953390 Properties User Field User Field User Field User Field User Field Capture Digitizer Settings GLP warning: This image was created from a non GLP source Source file: C:\Documents and Settings\Easy XP\Desktop\loy.JPG Document history Date Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM User: LOY Signature : Author LOY Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Integration parameters Baseline correction method Baseline correction offset Color filtration options Smoothing Type Image dimensions Direction of chromatography Minimum peak height Minimum peak width (pixels) Minimum peak area Number of tracks No of assigned manually integrated peaks LOWEST SLOPE YES NO FILTER SAVITSKY-GOLAY order width 15 Absorption 753 x 574 Up 100 10 100 Table of substances and fractions per track Automatically assigned (*) / Manually detected (v) /No peak detected or peak deleted by operator (.) Fraction Rf Substance 0.09 : v * * * * * v v * Stilben Track index : User: LOY Signature : Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Integration results Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Rf Start H Rf Max H 0.081 127.4 0.102 221.2 Total Height 221.2 Total Area : 2637.22 User: LOY Signature : End [%] Rf 100.00 0.117 area H 115.1 A [%] Subst Name 2637.2 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Start Rf H 0.062 75.3 Total Height 362.765 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.081 362.8 100.00 Total Area : 3588.34 Rf 0.102 area H 57.9 A [%] Subst Name 3588.3 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Rf Start H 0.060 119.5 Total Height 610.606 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.081 610.6 100.00 Total Area : 5669.87 Rf 0.100 area H 18.6 A [%] Subst Name 5669.9 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Rf Start H 0.057 116.9 Total Height 710.213 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.079 710.2 100.00 Total Area : 7093.6 Rf 0.102 area H 58.0 A [%] Subst Name 7093.6 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Start Rf H 0.055 98.5 Total Height 837.278 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.079 837.3 100.00 Total Area : 8176.39 Rf 0.100 area H 65.8 A [%] Subst Name 8176.4 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Start Rf H 0.045 0.0 Total Height 129.555 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.067 129.6 100.00 Total Area : 1156.91 Rf 0.083 area H 9.2 A [%] Subst Name 1156.9 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Start Rf H 0.057 18.5 Total Height 92.7778 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.071 92.8 100.00 Total Area : 726.959 Rf 0.086 H 13.9 A area [%] 727.0 100.00 Subst Name Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Start Rf H 0.057 4.8 Total Height 10.6748 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.062 10.7 100.00 Total Area : 24.3938 Rf 0.064 H 9.5 A area [%] 24.4 100.00 Subst Name Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page 10 CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Track Profile height 1400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Rf distance down track Track Peak # Start Rf H 0.043 0.0 Total Height 492.217 User: LOY Signature : Rf Max H End [%] 0.069 492.2 100.00 Total Area : 6464.06 Rf 0.105 area H 1.8 A [%] Subst Name 6464.1 100.00 Stilben Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page 11 CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Calibration parameters Calibration method REPRODUCIBILITY Internal standard NO Results per track Substance : Stilben Track SI User: LOY Signature : Rf 0.102 0.081 0.081 0.079 0.079 0.067 0.071 0.062 0.069 Height 221.2 362.8 610.6 710.2 837.3 129.6 92.8 10.7 492.2 Area 2637.2 3588.3 5669.9 7093.6 8176.4 1156.9 727.0 24.4 6464.1 Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page 12 CAMAG VideoScan TLC/HPTLC Evaluation Software - Version 1.02.00 - Serial No 1901D001 CAMAG LABORATORIES This heading can be changed by the user Image document data File Created by Generated on ID C:\Documents and Settings\Easy XP\Desktop\loy.JPG LOY Tuesday, April 23, 2019 12:16:30 AM 1555953390 Calibration parameters Calibration method REPRODUCIBILITY Internal standard NO User: LOY Signature : Created: Tuesday, April 23, 2019 12:19:17 AM ID : 905325528 Printed: Wednesday, April 24, 2019 09:21:41 AM : Page 13 ... Tiến hành bào chế dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ với số lần chƣng – sái khác 15 - Kiểm tra tiêu chất lƣợng cao khô Hà thủ ô đỏ - Định tính so sánh thành phần hóa học mẫu dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ đƣợc chế biến. .. định lƣợng THSG, mẫu chế Hà thủ ô đỏ Và mẫu sống 19 Bảng 3.1 Độ ẩm mẫu cao Hà thủ ô đỏ chế 22 Bảng 3.2 Hiệu suất mẫu cao khơ Hà thủ đỏ chế theo quy trình điều chế điều kiện khác (%)... 16 2.3.1 Chế biến dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ 16 2.3.2 Định tính bán định lƣợng thành phần THSG mẫu Hà thủ ô đỏ chế biến phƣơng pháp TLC-videoscan 17 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu