Nghiên cứu bào chế gel nhũ tương chứa rutin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG THỊ MINH THU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL NHŨ TƯƠNG CHỨA RUTIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒNG THỊ MINH THU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL NHŨ TƯƠNG CHỨA RUTIN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ HẬU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu nghiên cứu trung thực, chưa công bố nghiên cứu trước Tác giả luận văn Luận văn thạc sĩ – khóa: 2020 – 2022 Chun ngành: Cơng nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 8720202 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL NHŨ TƯƠNG CHỨA RUTIN Hoàng Thị Minh Thu Người hướng dẫn: PGS TS Lê Hậu TÓM TẮT Đặt vấn đề: Rutin flavonoid tự nhiên, gọi vitamin P, dùng đường uống rutin làm bền thành mạch, hạ huyết áp; dạng dùng da cho tác dụng kháng viêm, chống oxy hóa, kháng tia UV Gel nhũ tương dạng bào chế có khả giúp đưa hoạt chất thấm sâu vào da, có độ bền vật lý đem lại cảm giác dễ chịu sử dụng Đối tượng phương pháp: Khảo sát yếu tố độ tan, hệ số phân bố Dầu/Nước rutin, loại chất nhũ hóa để lựa chọn tá dược đưa vào công thức nhũ tương Tối ưu hóa cơng thức nhũ tương thực nghiệm với hỗ trợ phần mềm Design-Expert v12.0 Các biến đầu vào khai báo gồm tỷ lệ pha Dầu, tỷ lệ propylen glycol tỷ lệ chất nhũ hóa Hai biến đầu gồm độ bền pha khả giải phóng hoạt chất nhũ tương qua màng cellulose acetat 0,45 µm Nhũ tương rutin tối ưu gel hóa với tá dược khảo sát gồm poloxamer 407, carbopol 940, acid hyaluronic Đánh giá tính chất vật lý khả giải phóng hoạt chất gel nhũ tương tạo thành Rutin định lượng phương pháp đo phổ hấp thụ UV HPLC thẩm định đầy đủ Kết quả: Công thức nhũ tương tối ưu xây dựng gồm 24,16% pha Dầu (hỗn hợp capryol 90 - isopropyl myristat - dầu bơ - α-tocopherol (50:35:14:1)); 29,51% propylen glycol; 2,95% chất nhũ hóa (hỗn hợp tween 80 – span 80 (1:3)) Nhũ tương tạo thành có cấu trúc D/N, độ bền pha 8,5h, lượng rutin giải phóng 6h 203,5 ± 4,45 µg/cm2 (n=3) Gel nhũ tương chứa carbopol 0,3% đạt thể chất thuốc mềm dùng ngồi, pH khoảng 6,55, kích thước giọt trung bình 9,37 ± 0,229 µm, khả giải phóng hoạt chất qua màng cellulose acetat sau 6h 143,3 ± 3,21 µg/cm2 Kết luận: Gel nhũ tương dùng ngồi chứa rutin bền khả giải phóng hoạt chất cao xây dựng thành cơng Từ khố: rutin, gel nhũ tương Master’s thesis - Academic course: 2020 - 2022 Speciality: Pharmaceutical technology and Pharmaceutics Speciality code: 8720202 FORMULATION OF RUTIN – LOADED EMULGEL FOR TOPICAL APPLICATION Hoang Thi Minh Thu Supervisor: Associate Professor Ph.D Hau Le ABSTRACT Background: Rutin is a nature flavonoid, known as vitamin P Rutin in topical products has anti-inflammatory, antioxidant, UV resistant effects Drugs in these products should release easily from dosage form to permeate into skin Emulgels is a combination of gels and emulsions that delivery of drugs into skin, and easily removable from skin after use Methods: Factors including solubility, logP of rutin and kind of emulsifier had been determined in preformulation stage The formula of emulsion was established and optimized using Design–Expert software version 12.0 The independent variables were percentage of Oil phase, propylene glycol and emulsifier The two response variables were stability and drug release from emulsion through cellulose acetate membrane 0.45 µm The optimal emulsion was gelled by either poloxamer 407 or carbopol 940 or hyaluronic acid Resultant emulgel was evaluated in terms of the physical properties and the drug release Rutin concentration were determined by absorption spectrum UV and high-performance liquid chromatography, which were fully validated Results: The optimized emulsion formulation were including: 24.16 % of a mixture of capryol 90, isopropyl myristate, avocado oil and α-tocopherol at ratio 50:35:14:1 (as Oil phase), 29.51 % propylene glycol and 2.95 % emulsifier (mixture of tween 80 and span 80 at 1:3 ratio The oil in water emulsion stabilized in 8.5 hours and amount release of rutin was 203.2 ± 4.45 µg/cm2 (n=3) from emulsion after hours Carbopol 0.3% creates an emulgel with a smooth and homogeneity texture, pH about 6.55, average droplet size is 9.37 ± 0.229 µm, ability to release rutin through cellulose acetate membrane after hours is 143.3 ± 3.21 µg/cm2 (n=3) Conclusion: The formula of topical emulgel loading rutin was established Keywords: rutin, emulgel, topical i MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT……………………… .………….iv DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………………….v DANH MỤC CÁC HÌNH …………………………………… ………………… vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan rutin .2 1.1.1 Cấu trúc phân tử 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Định tính 1.1.4 Định lượng 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Một số nghiên cứu chế phẩm dùng da niêm mạc chứa rutin 1.1.7 Một số chế phẩm chứa rutin Tổng quan gel nhũ tương 1.2.1 Ưu nhược điểm 1.2.2 Thành phần 1.2.3 Điều chế 1.2.4 Một số tiêu đánh giá gel nhũ tương Tổng quan tá dược sử dụng nghiên cứu 10 1.3.1 Capryol 90 10 1.3.2 Labrafac 10 1.3.3 Acid oleic 10 1.3.4 Isopropyl myristat 10 1.3.5 Dầu thực vật 11 1.3.6 α - tocopherol 11 1.3.7 Propylen glycol .11 1.3.8 Isopropyl alcol 12 ii 1.3.9 Eucalyptol 12 1.3.10 Tween 80 12 1.3.11 Span 80 12 1.3.12 Poloxamer 407 .13 1.3.13 Carbopol 940 13 1.3.14 Hyaluronic acid 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 Đối tượng nghiên cứu 14 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Thẩm định quy trình định lượng rutin 16 2.2.2 Phương pháp đánh giá lượng hoạt chất giải phóng qua màng cellulose acetat 22 2.2.3 Xây dựng công thức nhũ tương chứa rutin .23 2.2.4 Xây dựng cơng thức quy trình điều chế gel nhũ tương chứa rutin 29 Chương KẾT QUẢ .34 Thẩm định quy trình định lượng rutin 34 3.1.1 Thẩm định quy trình định lượng rutin phương pháp quang phổ tử ngoại 34 3.1.2 Thẩm định quy trình định lượng rutin dịch giải phóng hoạt chất gel nhũ tương phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 36 Xây dựng công thức nhũ tương chứa rutin 42 3.2.1 Khảo sát lựa chọn tá dược .42 3.2.2 Xác định tỷ lệ thành phần pha Dầu .45 3.2.3 Khảo sát lựa chọn chất nhũ hóa 47 3.2.4 Tối ưu hóa cơng thức nhũ tương chứa rutin 48 Xây dựng công thức quy trình điều chế gel nhũ tương rutin 58 Chương BÀN LUẬN 64 Về xây dựng công thức nhũ tương chứa rutin 64 Về xây dựng công thức quy trình điều chế gel nhũ tương chứa rutin 65 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .67 Kết luận 67 iii Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Từ viết Nghĩa tiếng Anh tắt Nghĩa tiếng Việt CAP Capryol 90 Capryol 90 CNH Chất nhũ hóa DĐVN Dược điển Việt Nam DMS Dầu mỡ sáp HA Hyaluronic acid Hyaluronic acid HLB Hydrophilic-lipophilic balance Chỉ số cân dầu nước HPLC Hight Sắc ký lỏng hiệu cao performance liquid chromatography IPA Isopropyl alcol Isopropyl alcol IPM Isopropyl myristate Isopropyl myristat IUPAC International Union of Pure and Liên minh Quốc tế Hóa học Applied Chemistry Hóa học ứng dụng kl/kl Khối lượng / khối lượng logP Hệ số phân bố Dầu/Nước NXB Nhà xuất PEG Polyethylene glycol Polyethylen glycol PG Propylene glycol Propylen glycol Thể tích / thể tích tt/tt RHLB Required hydrophilic-lipophilic Chỉ số cân dầu nước tới hạn balance rpm Revolutions per minute Số vòng quay phút v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số điều kiện HPLC định lượng rutin Bảng 1.2 Một số chế phẩm dùng da niêm mạc chứa rutin Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu .14 Bảng 2.4 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.5 Các tá dược dùng để khảo sát độ tan rutin .23 Bảng 2.6 Các biến khai báo mơ hình tối ưu hóa cơng thức nhũ tương .26 Bảng 2.7 Mơ hình thực nghiệm tối ưu hóa cơng thức nhũ tương 27 Bảng 2.8 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ tá dược tạo gel gel nhũ tương chứa rutin 30 Bảng 3.9 Độ hấp thụ dung dịch rutin chloroform - methanol (6:4, tt/tt) 35 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn rutin 36 Bảng 3.11 Kết khảo sát mối tương quan diện tích pic nồng độ rutin 38 Bảng 3.12 Kết thẩm định độ lặp lại mẫu thử giải phóng hoạt chất mẫu thử gel nhũ tương 40 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ phương pháp HPLC định lượng rutin dịch thử giải phóng hoạt chất 41 Bảng 3.14 Kết thẩm định độ phương pháp HPLC định lượng rutin gel nhũ tương 42 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ tan rutin tá dược thân nước .43 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ tan rutin tá dược thân dầu 44 Bảng 3.17 Kết khảo sát hệ số phân bố D/N rutin .46 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ bền pha nhũ tương trắng 47 Bảng 3.19 Các công thức nhũ tương mơ hình thực nghiệm tối ưu hóa 49 Bảng 3.20 Kết đánh giá số tính chất hóa lý nhũ tương .51 Bảng 3.21 Kết đánh giá biến phụ thuộc mô hình tối ưu hóa 52 Bảng 3.22 Mức độ ảnh hưởng biến độc lập đến độ bền pha nhũ tương 53 vi Bảng 3.23 Mức độ ảnh hưởng biến độc lập đến khả giải phóng hoạt chất nhũ tương 54 Bảng 3.24 Các điều kiện tối ưu hóa cơng thức nhũ tương chứa rutin .56 Bảng 3.25 Giá trị đề xuất, giá trị dự đoán giá trị thực nghiệm 57 Bảng 3.26 Kết tính chất hóa lý gel nhũ tương .58 Bảng 3.27 Kết khả giải phóng hoạt chất nhũ tương từ công thức tối ưu gel nhũ tương khảo sát 59 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo hóa học rutin Hình 1.2 Sơ đồ điều chế gel nhũ tương .9 Hình 2.3 Sơ đồ điều chế nhũ tương trắng 25 Hình 2.4 Sơ đồ điều chế nhũ tương tổng quát 28 Hình 2.5 Sơ đồ điều chế gel nhũ tương rutin tổng quát 31 Hình 3.6 Phổ tử ngoại mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b), mẫu thử chứa rutin (c) 34 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ độ hấp thụ rutin chloroform - methanol (6:4, tt/tt) 35 Hình 3.8 Các sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu phương pháp HPLC 37 Hình 3.9 Đồ thị biễu diễn tương quan diện tích pic nồng độ rutin methanol 39 Hình 3.10 Hình ảnh nhũ tương trắng .50 Hình 3.11 Hình ảnh nhũ tương chứa rutin .50 Hình 3.12 Bề mặt đáp ứng độ bền pha theo biến độc lập thiết kế tối ưu hóa .53 Hình 3.13 Bề mặt đáp ứng khả giải phóng hoạt chất theo biến độc lập thiết kế tối ưu hóa 55 Hình 3.14 Hàm kỳ vọng 56 Hình 3.15 Nhũ tương rutin có cơng thức tối ưu 58 Hình 3.16 Dải phân bố kích thước giọt nhũ tương rutin có cơng thức tối ưu 58 Hình 3.17 Biểu đồ tốc độ giải phóng hoạt chất nhũ tương rutin gel nhũ tương rutin 60 Hình 3.18 Sơ đồ điều chế gel nhũ tương rutin 62 MỞ ĐẦU Rutin flavonoid, biết đến vitamin P tự nhiên, có nhiều tác dụng dược lý chứng minh Rutin sử dụng dạng bơi ngồi da thể tác dụng hỗ trợ điều trị giãn tĩnh mạch ngoại biên, kháng viêm, kháng UV chống oxy hóa 2,3,4 Cơng ty Novartis phát triển chế phẩm Venoruton chứa O - (β - hydroxyl) rutosid, dẫn chất rutin, có tác dụng hỗ trợ điều trị giãn tĩnh mạch chứng minh hiệu lâm sàng Trong nước bắt đầu nghiên cứu dạng bào chế dùng chứa rutin Năm 2020, tác giả Trần Thị Hải Yến cộng công bố “Nghiên cứu đánh giá số đặc tính nano niosome mang rutin dịch chiết gel lô hội” Kết cho thấy, bào chế rutin dạng gel niosome giúp tăng tỷ lệ lưu trữ da so với rutin nguyên liệu Điều chứng tỏ thay đổi khả thấm rutin dựa việc thay đổi cấu trúc hóa học rutin cấu trúc hóa lý dạng bào chế, giúp cải thiện sinh khả dụng rutin Nhũ tương dạng bào chế có khả giúp dược chất thấm sâu vào da, nhiên có nhược điểm độ bền vật lý thấp Sự kết hợp nhũ tương gel giúp cải thiện độ bền vật lý, đem lại cảm giác dễ chịu sử dụng Hiện lưu hành chế phẩm có cấu trúc gel nhũ tương với công dụng giảm đau, kháng viêm, trị mụn 7,8,9,10 Nhận thấy tiềm đó, đề tài thực để phát triển thêm dạng bào chế dùng da có chứa rutin Mục tiêu tổng quát đề tài “Nghiên cứu bào chế gel nhũ tương chứa rutin” xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel nhũ tương chứa rutin Để thực mục tiêu tổng quát trên, mục tiêu cụ thể cần đạt sau: Xây dựng công thức nhũ tương Xây dựng cơng thức quy trình điều chế gel nhũ tương chứa rutin Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan rutin 1.1.1 Cấu trúc phân tử Tên theo danh pháp IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3- [α-L- rhamnopyranosyl-(1-6)-βD-glucopyranosyloxy]-4H-chromen-4-on Tên gọi khác: Quercetin 3-rutinosid, Quercetin 3-rhamnoglucosid, 3,3′,4′,5,7-Pentahydroxyflavon 3-rutinosid, 3-Rutinosylquercetin, Rutosid, Sophorin Công thức phân tử : C27H30O16 Khối lượng phân tử: 610,521 g/mol 11 Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo hóa học rutin 1.1.2 Tính chất hóa lý Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt vàng xanh lục Nhiệt độ nóng chảy: 183 - 194 oC Độ tan: Rutin tan nước, tan methanol, cloroform12 1.1.3 Định tính 1.1.3.1 Định tính hóa học Cân 0,05 g rutin, thêm 20 ml ethanol 90 % nóng Lắc kỹ để hịa tan rutin Lọc Lấy ml dịch lọc, thêm vài giọt acid hydrochloric đậm đặc lượng nhỏ bột kẽm Dung dịch chuyển sang màu đỏ Lấy ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid %, xuất màu nâu lục 12 1.1.3.2 Định tính sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silicagel G Dung môi khai triển: n - butanol - acid acetic khan - nước - methyl ethyl ceton - ethyl acetat (5:10:10:30:50) Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg methanol pha loãng thành 10 ml với dung mơi Dung dịch đối chiếu: Hịa tan 25 mg rutin chuẩn methanol pha loãng thành 10 ml với dung môi Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi 10 cm Để khơ mỏng ngồi khơng khí Phun lên mỏng hỗn hợp gồm 7,5 ml dung dịch kali fericyanid % 2,5 ml dung dịch sắt (III) clorid 10,5 % Quan sát mỏng vịng 10 phút Vết sắc ký đồ thu dung dịch thử tương ứng vị trí, màu sắc kích thước với vết sắc ký đồ thu dung dịch đối chiếu 12 1.1.4 Định lượng Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại Trong DĐVN V nghiên cứu, rutin định lượng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại, khoảng bước sóng từ bước sóng 210 nm đến 450 nm Rutin có hai cực đại hấp thụ 257 nm 358 nm12 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Theo DĐVN số nghiên cứu, phương pháp HPLC sử dụng để định lượng rutin chế phẩm dược liệu Các nghiên cứu sử dụng pha tĩnh cột C18 (5 µm), pha động bước sóng phát thay đổi trình bày Bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số điều kiện HPLC định lượng rutin Pha động Bước sóng phát Methanol - dung dịch đệm phosphat pH 3,0 - tetrahydrofuran (10:70:20, tt/tt/tt) 12 254 nm Methanol - nước (55:45, tt/tt) 13 356 nm Methanol - nước cất chứa % acid phosphoric (44:56, tt/tt) 14 360 nm Acetonitril - đệm acid acetic pH 4,8 (8:2, tt/tt) 15 255 nm Methanol - acetonitril - nước cất chứa 1% acid acetic (45:15:45, tt/tt/tt) 16 257 nm 1.1.5 Tác dụng dược lý Theo y học cổ truyền, rutin dùng đường uống, có tác dụng tăng cường sức chịu đựng mao mạch, hạ huyết áp, nhiệt Ngoài ra, có nghiên cứu chứng minh rutin có tác dụng hạ đường huyết 2,11 Khi dùng da, rutin thể tác dụng kháng tia UV, kháng viêm ức chế hoạt hóa cyclo oxygenase 2, chống oxy hóa 3… 1.1.6 Một số nghiên cứu chế phẩm dùng da niêm mạc chứa rutin Năm 2014, Bhupen Kalita Malay K Das tiến hành nghiên cứu dạng phytosome chứa rutin, tạo rutin phosphatidylcholine, cải thiện độ tan, độ ổn định tính thấm qua da chuột so với rutin thông thường 17 Năm 2017, Bhupen Kalita Malay K Das thực nghiên cứu khác, điều chế miếng dán chứa phức hợp rutin - phospholipid, đánh giá tính thấm qua da chuột, so sánh với miếng dán chứa rutin tự gel diclofenac % Kết cho thấy phức hợp rutin - phospholipid có khả thấm qua da chuột tốt so với miếng dán chứa rutin tự do, khả chống viêm tăng so với gel diclofenac % 18 Một dạng tiền nhũ tương kép dầu/dầu/nước điều chế qua hai bước nhũ hóa, sử dụng chất ổn định hạt silica kỵ nước; pha dầu gồm cetostearyl alcol, polyglycerol polyricinoleat, dầu hoa anh thảo; pha nước chứa glycerol; hỗn hợp chất nhũ hóa (CNH) tween 20, tween 40, tween 60, tween 80, cremophor RH 40 Tiền nhũ tương kép có tỷ lệ hoạt chất thấm qua da tích tụ da cao so với dung dịch rutin ethanol 14 Năm 2021, Azar Kajbafvala Alireza Salabat nghiên cứu điều chế gel vi nhũ tương chứa rutin, sử dụng hỗn hợp chất diện hoạt span 20 tween 80 Các chất đồng diện hoạt gồm transcutol, ethylen glycol, n-butanol Các loại dầu sử dụng dầu mè, acid oleic, isopropyl myristat Carbopol 940 sử dụng làm chất tạo gel Gel vi nhũ tương chứa rutin 0,3 % có khả kháng tia UV 19 Một dạng cấu trúc chứa rutin proniosomal gel nghiên cứu Iulia Pinzaru cộng vào năm 2021 Proniosomal điều chế phương pháp tách pha đông tụ, sử dụng tá dược span 80, lecithin cholesterol Gel chứa 0,3 % rutin, khơng gây kích ứng da có tác dụng độc tế bào với dòng tế bào ung thư 20 Cũng năm 2021, Jing Li cộng nghiên cứu điều chế tinh thể nano rutin đông khô, phân tán gel carbopol Gel nanorutin tăng khả thấm gấp lần gel rutin nguyên liệu 21 Ở Việt Nam, có nghiên cứu gel lơ hội chứa niosome rutin, việc tạo cấu trúc niosome làm cho rutin thấm tốt gấp lần rutin nguyên liệu Các nghiên cứu chứng tỏ tăng tính thấm rutin cách giảm kích thước thay đổi cấu trúc hóa lý chế phẩm, từ tăng tác dụng dược lý rutin 1.1.7 Một số chế phẩm chứa rutin Một số chế phẩm dùng da niêm mạc chứa rutin trình bày Bảng 1.2 Bảng 1.2 Một số chế phẩm dùng da niêm mạc chứa rutin Tên chế Dạng bào Thành phần Cơng dụng phẩm chế Vietlife Sol - gel Skincare Nano Nano Curcumin Trị thâm, mờ sẹo Venoruton Gel O - (β - hydroxyl) rutosid Hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch chân Varikosette Kem Troxerutin, chiết xuất hạt phỉ, bạch Hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch chân Nano Rutin Tổng quan gel nhũ tương Gel nhũ tương dạng bào chế kết hợp nhũ tương gel, mang ưu điểm hai dạng bào chế gel nhũ tương 1.2.1 Ưu nhược điểm Ưu điểm Có thể áp dụng với dược chất tan nước Rào cản lớn dược chất kỵ nước điều chế gel khơng thể hịa tan thành phần gel thân nước Khi điều chế gel nhũ tương, chất kỵ nước hòa tan pha Dầu, sau tạo nhũ tương, cuối phân tán vào gel thân nước cách dễ dàng Tính ổn định: Do thể chất đặc, gel nhũ tương ngăn cản tượng kết bông, kem, tách pha, đảo pha nhũ tương Khả thấm: Những chất có hệ số phân bố dầu nước khác khó thấm bào chế dạng gel thân nước Việc tạo cấu trúc nhũ tương giúp dược chất dễ thấm sâu vào da Tính khả thi sản xuất: Quy trình điều chế gel nhũ tương sử dụng thiết bị đơn giản, đạt độ lặp lại cách dễ dàng Dễ tuân thủ điều trị: Do có gel nên chế phẩm cho cảm giác dễ chịu, khơng nhờn rít, dễ rửa sạch, giúp bệnh nhân dễ tuân thủ dùng thuốc Nhược điểm: Kích thước giọt: Mặc dù gel nhũ tương có khả thấm tốt so với dạng gel, kích thước giọt lớn nên khả thấm cấu trúc Cần nghiên cứu cải tiến công thức để tăng khả dẫn thuốc vào da Khả giải phóng hoạt chất: Khi gel hóa nhũ tương làm chậm q trình phóng thích dược chất Lợi dụng điểm này, kéo dài thời gian bán thải thuốc, áp dụng cho thuốc tác dụng kéo dài 7,8,9 1.2.2 Thành phần Gel nhũ tương có thành phần sau: Pha Dầu: Pha Dầu gồm dung môi phân cực, chia thành ba nhóm lớn dầu mỡ sáp (DMS), hydrocarbon silicon Trong nhóm DMS, thường dùng loại dầu thực vật dầu lạc, dầu vừng, dầu thầu dầu, dầu hướng dương… Dầu cá loại dầu động vật dùng làm tá dược dạng thuốc dùng da Các loại sáp thường dùng sáp ong, lanolin, spermaceti, chúng chất rắn mềm nên thường phối hợp để điều chỉnh thể chất Các chất phân lập từ DMS acid stearic, acid oleic, acol cetylic, alcol cetostearilic, cholesterol ester chúng isopropyl myristat, isopropyl palmitat…Ưu điểm dịu nhẹ với da, số chất thấm sâu Nhược điểm dễ bị ôi khét Hydrocarbon sản phẩm tinh chế từ dư phẩm trình chưng cất dầu hỏa, bền vững trơ mặt hóa học Gồm có vaselin, parafin dạng lỏng rắn, plastibase Nhóm hydrocarbon DMS có nhược điểm chung trơn, nhờn, gây bẩn, cản trở hoạt động sinh lý bình thường da khó giải phóng hoạt chất Các silicon bền vững, khơng gây kích ứng da, nên thường dùng làm tá dược cho thuốc bảo vệ da 22 Pha Nước: Thường dùng dung môi nước alcol Nước dung môi phù hợp với sinh lý, giải phóng dược chất hồn tồn Tuy nhiên nhiều dược chất khó tan nước, nên cần kết hợp với alcol để tăng độ tan Các alcol thường dùng ethanol, isopropyl alcol (IPA), propylen glycol (PG), glycerol Ethanol chất dẫn tốt, giúp hấp thụ nhanh, nồng độ 10 % bảo quản chế phẩm, dễ bay hơi, gây ức chế thần kinh độc với gan IPA thay ethanol chế phẩm dùng Ở dạng thuốc dùng thường thêm glycerol để giúp giữ ẩm bám dính tốt PG hịa tan nhiều loại dược chất, ức chế phát triển vi khuẩn tăng tính thấm dược chất 22 Chất nhũ hóa (CNH): Là chất diện hoạt có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt liên pha, giúp hình thành ổn định cấu trúc nhũ tương, tăng độ tan khả thấm chất Thường dùng loại chất diện hoạt khơng ion hóa tween, span … hỗn hợp chúng Chất tạo gel: Các nhóm tá dược tạo gel thường dùng gồm nhóm gel polysaccarid tinh bột biến tính, thạch, alginat; nhóm dẫn chất cellulose methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxylpropyl methylcellulose, natri carboxymethyl cellulose…; nhóm carbomer carbopol, carboxypolymethylen, carboxyvinyl polymer… 22 Chất tăng thấm: Các chất tăng thấm hoạt động theo nhiều chế tăng độ tan dược chất làm tăng nồng độ thuốc, hòa tan acid béo bề mặt da, làm bề mặt da, tăng hydrat hóa lớp sừng, thay đổi hệ số phân bố thuốc… Các chất tăng thấm bao gồm: Alcol (ethanol, IPA, PG…), ester (IPM, isopropyl palmytat, sorbital monoleat…), ether (transcutol® …), acid béo (acid oleic, acid lauric…), terpen tinh dầu (menthol, eucalyptol…), sulfoxid dẫn chất (dimethyl sulfoxide, decylmethyl sulphoxid…), amid (ure, azol…), chất hoạt động bề mặt (tween, span, benzalkonium clorid, natri laurylsulfat…) 24,25,26 1.2.3 Điều chế Quy trình điều chế gel nhũ tương gồm giai đoạn chính, trình bày sơ đồ Hình 1.2 Pha Nước Pha Dầu Nhũ hóa Nhũ tương Gel Phân tán Gel nhũ tương Hình 1.2 Sơ đồ điều chế gel nhũ tương Giai đoạn 1: Điều chế gel Các tá dược tạo gel phân tán nước, để gel trương nở hoàn toàn Giai đoạn 2: Điều chế nhũ tương Nhũ tương điều chế phương pháp khác nhau, tùy theo tính chất dược chất tá dược Giai đoạn 3: Phối hợp nhũ tương vào gel 1.2.4 Một số tiêu đánh giá gel nhũ tương Đánh giá cảm quan: Kiểm tra màu sắc, tính đồng nhất, tách pha Độ dàn mỏng: Cân lượng chế phẩm lên hai kính, đặt nặng lên kính Tính diện tích tản ra, so sánh với diện tích trước cho nặng Khả tản ra: Được đo khả trượt kéo nhũ tương Thiết bị bao gồm khối gỗ gắn với ròng rọc, bên khối gỗ gắn tính Cân lượng gel nhũ tương lên kính, đặt kính khác lên, đặt thêm nặng lên phút để loại bọt khí, loại hết phần gel nhũ tương dư Kéo kính 10 với lực với quãng đường Ghi nhận thời gian kéo Mẫu có thời gian kéo ngắn khả tản tốt Độ nhớt: Kiểm tra độ nhớt chế phẩm 25 oC pH: Kiểm tra pH chế phẩm Khả giải phóng hoạt chất: Sử dụng hệ thống tế bào khuếch tán Franz để đánh giá khả giải phóng hoạt chất từ chế phẩm8,9 Tổng quan tá dược sử dụng nghiên cứu 1.3.1 Capryol 90 Capryol 90 (CAP) hay gọi propylen glycol monocaprylat (type II), ester PG caprylic acid (C8), phần lớn monoester, có chứa lượng nhỏ diester CAP dạng dung dịch dầu, suốt không màu, có khả nhũ hóa yếu HLB 5, RHLB 15 27 CAP sử dụng nhiều nghiên cứu vi nhũ tương, hệ vi tự nhũ với vai trị pha Dầu, dung mơi hịa tan chất, chất đồng diện hoạt 1.3.2 Labrafac Labrafac hỗn hợp ester PG với acid caprylic acid capric Đây dung dịch dầu, không độc, thường sử dụng với vai trò pha Dầu nhũ tương, vi nhũ tương, thuốc mềm dùng da niêm mạc 1.3.3 Acid oleic Acid oleic acid béo có tự nhiên, chất lỏng màu vàng đến nâu, đóng vai trị dung mơi pha Dầu, chất nhũ hóa, chất tăng tính thấm 28 1.3.4 Isopropyl myristat Isopropyl myristat (IPM) ester IPA acid myristic, chất lỏng suốt, không màu, tan trong dầu, aceton, cloroform, ethyl acetat, ethanol, dầu khống, gần khơng tan glycerol, PG, nước cất 28 11 Trong thuốc mềm dùng ngồi, IPM đóng vai trị chất giữ ẩm tăng tính thấm dược chất Trong nghiên cứu điều chế gel diclofenac, sử dụng IPM nồng độ % %, lượng dược chất giải phóng qua màng cellulose acetat khơng tăng, thử nghiệm tính thấm qua da bụng chuột lượng diclofenac thấm qua tăng mạnh, tăng nồng độ IPM tính thấm tăng theo Khi phối hợp PG 40 % IPM % khả thấm tối đa 29 1.3.5 Dầu thực vật Dầu thực vật loại chất béo chiết xuất từ thực vật, dạng lỏng, chứa nhiều acid béo, không tan nước, methanol, tan cloroform, aceton Các loại dầu thực vật thường an tồn, khơng gây độc (trừ số loại có tác dụng dược lý) có tác dụng dưỡng ẩm, êm dịu với da Các loại dầu thực vật thường dùng dầu bơ, dầu mè, dầu hướng dương, dầu cám gạo… 1.3.6 α - tocopherol α - tocopherol chất chống oxy hóa tự nhiên, nhờ khả vơ hiệu hóa gốc tự do, có nhiều loại ngũ cốc, rau có xanh, trái cây… α - tocopherol thể lỏng, màu vàng, không tan nước, tan chất béo Tocopherol thường sử dụng chế phẩm với vai trị chất chống oxy hóa, với nồng độ % 30 1.3.7 Propylen glycol PG chất lỏng suốt, không màu, nhớt, không mùi, vị chát Nhiệt độ sôi 184 - 198 oC PG có vai trị dung mơi hịa tan chất, kháng khuẩn, chất bảo quản, chất giữ ẩm, chất làm dẻo, chất ổn định PG thường dùng dạng dùng với tỷ lệ - 80 %, nồng độ khoảng 15 % PG đóng vai trị chất làm ẩm da, kháng khuẩn 12 Ở dạng dùng ngồi, PG êm dịu với da, khơng glycerol 28 1.3.8 Isopropyl alcol IPA chất lỏng khơng màu, dễ bay hơi, có độ độc thấp mùi nhẹ, dễ chịu, thường sử dụng làm dung mơi thuốc mềm dùng ngồi da, mỹ phẩm, tẩy rửa, sát trùng y tế 31 IPA không tan dung dịch muối, hỗn hịa với nước, alcol, ether, cloroform, hòa tan nhiều loại dầu, nhựa, gơm Ở nồng độ 70 % IPA có tác dụng sát trùng, tác dụng sát khuẩn mạnh ethanol Trong chế phẩm dùng da, IPA thường dùng nồng độ - 20 %32,32 1.3.9 Eucalyptol Eucalyptol gọi 1,8 - cineol, monoterpen, chất lỏng, suốt, khơng màu, có mùi thơm đặc trưng, thành phần tinh dầu tràm Eucalyptol có cơng dụng kháng khuẩn, kháng viêm, tăng tính thấm dược chất qua da Eucalyptol giống terpen khác, phát huy tác dụng tăng thấm cách phá vỡ lớp lipid kép lớp sừng, kết thay đổi hệ số phân bố dược chất Nồng độ thường dùng thử nghiệm từ 0,25 - 10 % 33,34,35,36,37 1.3.10 Tween 80 Tween 80 hay gọi polysorbat 80, polyoxyethylen sorbitan monooleat, chất diện hoạt khơng ion hóa, HLB 15 Tween 80 tồn thể lỏng, màu vàng, có độ nhớt cao, tan nước, ethanol, không tan dầu Trong bào chế nhũ tương, tween 80 đóng vai trị chất nhũ hóa, tăng tính thấm, tăng độ tan chất, nồng độ sử dụng - 15 % 28 Nếu dùng riêng tween 80, nhũ tương tạo thành có cấu trúc D/N 1.3.11 Span 80 Span 80 hay gọi sorbitan monooleate, chất diện hoạt khơng ion hóa, HLB 4,3 13 Span 80 tồn thể lỏng, màu vàng, không tan nước, tan dầu Span 80 sử dụng nhũ tương với vai trị chất nhũ hóa, chất hịa tan chất gây thấm với nồng độ 1-10 %28 Nếu dùng riêng span 80, nhũ tương tạo thành có cấu trúc D/N 1.3.12 Poloxamer 407 Poloxamer gọi pluronic, copolymer, có đặc tính tạo gel thuận nghịch phụ thuộc nhiệt độ, môi trường nước nhiệt độ thường, poloxamer dạng gel, chuyển sang dạng lỏng hạ nhiệt độ tới - oC Poloxamer tạo gel nồng độ từ %, nồng độ sử dụng lên tới 35 % 38 1.3.13 Carbopol 940 Carbopol 940 hay gọi carbomer, acrypol, polyvinyl carboxy polymer, không độc không gây kích ứng, thường sử dụng làm tá dược tạo gel, tăng độ nhớt chế phẩm, kể chế phẩm nhỏ mắt Ưu điểm bật carbopol tạo gel nồng độ thấp, từ 0,1 % Nồng độ thường dùng 0,5 đến % 39 Độ đặc gel carbopol phụ thuộc vào pH, pH acid carbopol tồn dạng dung dịch cao phân tử lỏng lẻo, trung hòa chất kiềm hình thành ma trận liên kết, tạo thành khối gel đặc 39 1.3.14 Hyaluronic acid Hyaluronic acid (HA) mucopolysaccharide đại phân tử, bao gồm hai đơn vị saccharide liên kết xen kẽ acid glucuronic N-acetylglucosamine HA thành phần thiết yếu chất ngoại bào tự nhiên, có khả tương thích sinh học tốt, khả phân hủy sinh học, độ nhớt cao HA có khả hút nước mạnh nên thường sử dụng làm chất giữ ẩm cho da, làm hydrat hóa lớp sừng, giúp đưa thuốc thấm sâu vào da Trong nghiên gel, thường dùng HA với nồng độ 0,5 -2 % 40 Với nồng độ 0,2 %, HA có dạng dung dịch nhớt, thường dùng thuốc nhỏ mắt, mỹ phẩm dưỡng da 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Gel nhũ tương chứa rutin Các thiết bị sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.3 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu STT Thiết bị Nhà sản xuất Bể ổn nhiệt Memmert WNB14 Memmert, Đức Cân kỹ thuật Ohaus, Trung Quốc Cân phân tích Ohaus, Trung Quốc Thiết bị đo pH Hannah, Trung Quốc Thiết bị khuấy từ gia nhiệt Benchmark, Trung Quốc Thiết bị phân tích kích cỡ hạt Malvern Panalytical, Anh Malvern Mastersizer 3000 Hệ thống quang phổ hấp thụ UV-vis UH5300 Hitachi, Nhật Bản Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Water, Mỹ Water e2695 Máy ly tâm Labnet Spectrafuge 24D - Mỹ Labnet, Mỹ 15 Các hóa chất, dung mơi sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.4 Bảng 2.4 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu STT Hóa chất, dung môi Tiêu chuẩn Nhà sản xuất Rutin nguyên liệu TC NSX Acros, Mỹ Rutin chuẩn 88,5% USP Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM Acetonitril (HPLC) USP Fisher - Hàn Quốc Methanol (HPLC) USP Macron - Mỹ Acid acetic (HPLC) USP Merk - Đức Nước cất (HPLC) USP Fisher - Hàn Quốc Propylen glycol USP Trung Quốc Ethanol tuyệt đối DĐVN V Chemsol - Việt nam Methanol USP Xilong - Trung Quốc 10 Isopropanol USP Xilong - Trung Quốc 11 Glycerol USP Xilong - Trung Quốc 12 Capryol 90 TC NSX Gattefosé - Pháp 13 Labrafac TC NSX Gattefosé - Pháp 14 Dầu lạc TC NSX Việt Nam 15 Dầu vừng TC NSX Việt Nam 16 Dầu oliu TC NSX Việt Nam 17 Dầu hướng dương TC NSX Việt Nam 18 Dầu bơ TC NSX Press Purity, Australia 19 Acid oleic USP Xilong - Trung Quốc 20 Isopropyl myristat USP Trung Quốc 21 Eucalyptol TC NSX Việt Nam 22 Carbopol USP Trung Quốc 23 Poloxamer USP Trung Quốc 24 Hyaluronic acid USP Trung Quốc 25 Triethanolamin USP Trung Quốc 16 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thẩm định quy trình định lượng rutin 2.2.1.1 Quy trình định lượng rutin phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại dùng để định lượng rutin trình sàng lọc tá dược Dung dịch chuẩn gốc: Cân xác khoảng 20,0 mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml hỗn hợp chloroform - methanol (6:4, tt/tt) vào bình, siêu âm cho tan hồn tồn Tiếp tục thêm hỗn hợp chloroform - methanol (6:4, tt/tt) đến vạch, lắc đều, thu dung dịch chuẩn gốc có nồng độ xác khoảng 200 µg/ml Mẫu chuẩn: Lấy xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc rutin cho vào bình định mức 100 ml, thêm hỗn hợp chloroform - methanol (6:4, tt/tt) đến vạch, lắc đều, thu mẫu chuẩn rutin có nồng độ khoảng 20,0 µg/ml Mẫu thử: Ly tâm mẫu thử chứa rutin để loại cắn, lấy phần dịch trong, lọc qua đầu lọc 0,45 µm Cân xác lượng dịch lọc vào bình định mức 50 ml, thêm hỗn hợp chloroform - methanol (6:4, tt/tt) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ mẫu chuẩn mẫu thử bước sóng 360 nm Lượng rutin mẫu thử tính theo cơng thức: 𝑋= 𝐴𝑡 × 𝐶𝑐 × 𝑎 × 𝑉 (µ𝑔/𝑔) 𝐴𝑐 × 𝑚 Trong đó: X: Nồng độ rutin (µ𝑔/𝑚𝑙) 𝐴𝑡 : Độ hấp thụ mẫu thử 𝐴𝑐 : Độ hấp thụ mẫu chuẩn 𝐶𝑐 : Nồng độ mẫu chuẩn (µ𝑔/𝑚𝑙) 𝑉: Thể tích dung dịch pha mẫu thử (ml) 𝑚: Khối lượng cân mẫu thử (g) 17 𝑎: Độ tinh khiết chuẩn rutin (%) 2.2.1.2 Thẩm định quy trình định lượng rutin phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại Mẫu chuẩn mẫu thử chuẩn bị quy trình định lượng rutin mục 2.2.1.1 Mẫu trắng: Dung dịch chloroform - methanol (6:4, tt/tt) Tính đặc hiệu Quét phổ tử ngoại xác định max rutin mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử khoảng bước sóng 230 - 450 nm Ghi nhận sắc ký đồ Yêu cầu: Trong sắc ký đồ, mẫu thử phải có max tương tự max mẫu chuẩn; mẫu trắng khơng có độ hấp thụ max Tính tuyến tính Pha lỗng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp chloroform - methanol (6:4, tt/tt) để thu dung dịch có nồng độ khoảng - 30 µg/ml Đo độ hấp thụ dung dịch chứa rutin Xác định tương quan nồng độ độ hấp thụ rutin Xây dựng phương trình hồi quy nồng độ diện tích pic, xác định hệ số tương quan Yêu cầu: Hệ số tương quan R2 > 0,999 Sử dụng phân tích hồi quy với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy trắc nghiệm F để kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy 2.2.1.3 Quy trình định lượng rutin dịch thử nghiệm giải phóng hoạt chất qua màng cellulose acetat Chuẩn bị mẫu chuẩn 18 Dung dịch chuẩn gốc rutin: Cân xác khoảng 20,0 mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, lắc đều, siêu âm cho tan hoàn toàn Thêm methanol đến vạch, lắc đều, thu dung dịch chuẩn gốc rutin có nồng độ khoảng 200 µg/ml Mẫu chuẩn rutin: Lấy xác 20 ml dung dịch chuẩn gốc rutin pha lỗng bình định mức 50 ml với methanol, thu dung dịch chuẩn rutin có nồng độ khoảng 80 µg/ml Mẫu thử nghiệm giải phóng hoạt chất: Dịch thu từ khoang nhận tế bào khuếch tán Franz thử nghiệm giải phóng hoạt chất, trình bày mục 2.2.2 Mẫu chuẩn mẫu thử giải phóng hoạt chất định lượng phương pháp HPLC Nồng độ rutin dịch thử giải phóng hoạt chất tính theo cơng thức: Ct = S t ì Cc ì a (àg/ml) Sc Trong đó: 𝐶𝑡 : Nồng độ mẫu thử (µg/ml) 𝑆𝑡 : Diện tích pic mẫu thử (µAU.s) 𝑆𝑐 : Diện tích pic mẫu chuẩn (µAU.s) 𝐶𝑐 : Nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml) 𝑎: Độ tinh khiết chuẩn (%) Từ tính lượng rutin giải phóng đơn vị diện tích màng theo cơng thức: 𝐶𝑇 = (𝐶𝑡 𝑉+ 𝑣 ∑𝑡−1 𝑖=1 𝐶𝑖 ) 𝑆 (µg/cm2) Trong đó: CT : Lượng rutin giải phóng qua đơn vị diện tích màng thời điểm t (µg/ cm2) Ct : Nồng độ mẫu thử thời điểm t (µg/ ml) 19 Ci : Nồng độ mẫu thử thời điểm i (µg/ ml) V: Thể tích dung mơi khoang nhận tế bào khuếch tán Franz (ml) v : Thể tích lấy mẫu thời điểm i (ml) S: Diện tích màng cellulose acetat (cm2) 2.2.1.4 Quy trình định lượng rutin gel nhũ tương Mẫu chuẩn: Dung dịch rutin chuẩn có nồng độ 80 µg/ml, chuẩn bị mục 2.2.1.3 Mẫu thử gel nhũ tương: Cân xác khoảng 1g gel nhũ tương chứa rutin, cho vào ống falcon, thêm 5ml methanol, lắc kỹ Ly tâm, gạn lấy phần methanol Lặp lại việc chiết methanol lần Tập trung dịch chiết methanol cho vào chén sứ lấy cắn Hịa tan cắn vừa đủ 10 ml methanol Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử Hàm lượng rutin gel nhũ tương tính theo cơng thức: 𝑋= 𝑆𝑡 × 𝐶𝑐 × 𝑎 × 𝑉 (%) 𝑆𝑐 × 𝑚 × 10 Trong đó: 𝑋: Hàm lượng rutin gel nhũ tương (%) 𝑆𝑡 : Diện tích pic mẫu thử (µAU.s) 𝑆𝑐 : Diện tích pic mẫu chuẩn (µAU.s) 𝐶𝑐 : Nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml) 𝑚: Khối lượng gel nhũ tương cân (g) 𝑎: Độ tinh khiết chuẩn (%) 𝑉: Thể tích dung mơi dùng để pha mẫu thử (ml) 2.2.1.5 Thẩm định quy trình định lượng rutin dịch thử giải phóng hoạt chất, gel nhũ tương phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Điều kiện sắc ký + Thiết bị: Hệ thống HPLC Waters e2695 + Pha động: Acetonitril - methanol - acid acetic % (10:20:70) 20 + Detector PDA đặt bước sóng 360 nm + Cột: Phenomenex Luna (250 x 4,6 mm; µm) + Nhiệt độ cột: 35 oC + Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 10 µl Mẫu chuẩn: Dung dịch rutin chuẩn có nồng độ 80 µg/ml, chuẩn bị mục 2.2.1.3 Mẫu thử giải phóng hoạt chất: Dịch thu từ khoang nhận tế bào khuếch tán Franz thử nghiệm giải phóng hoạt chất Mẫu thử gel nhũ tương: Cân xác khoảng 1g gel nhũ tương chứa rutin, cho vào ống falcon, thêm 5ml methanol, lắc kỹ Ly tâm, gạn lấy phần methanol Lặp lại việc chiết methanol lần Tập trung dịch chiết methanol cho vào chén sứ lấy cắn Hịa tan cắn vừa đủ 10 ml methanol Mẫu trắng: Dung môi pha động, dung mơi thử giải phóng hoạt chất, dung mơi pha mẫu thử (methanol) Tính phù hợp hệ thống Tiêm lần dung dịch chuẩn rutin vào hệ thống sắc ký Ghi nhận kết thời gian lưu diện tích pic Yêu cầu: Giá trị RSD thời gian lưu diện tích pic phải ≤ 2,0 % Tính đặc hiệu Tiêm mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn Ghi nhận kết Yêu cầu:  Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu rutin mẫu chuẩn 21  Sắc ký đồ mẫu thử xuất pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu rutin sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất pic khác (pic tạp) pic rutin phải tách hoàn toàn pic tạp Trên sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn diện tích pic chiều cao pic rutin phải tăng so với mẫu thử Tính tuyến tính Pha lỗng dung dịch chuẩn gốc rutin với methanol thành dung dịch có nồng độ khoảng 4,0 - 200 µg/ml Tiêm vào hệ thống sắc ký ghi nhận kết Tiến hành: Pha giai mẫu chuẩn với nồng độ: 4; 10; 20; 40; 80; 150; 200 µg/ml Xác định tương quan nồng độ diện tích pic rutin Xây dựng phương trình hồi quy nồng độ diện tích pic, xác định hệ số tương quan Sử dụng phân tích hồi quy với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy trắc nghiệm F để kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy u cầu: Xây dựng phương trình hồi quy nồng độ diện tích pic, xác định hệ số tương quan R2 > 0,999 Độ lặp lại Chuẩn bị mẫu thử riêng biệt tiêm vào hệ thống sắc ký Ghi nhận tính RSD (%) hàm lượng rutin mẫu thử Yêu cầu: Hàm lượng rutin mẫu thử có RSD < 2,0 % Độ Thêm vào mẫu thử lượng rutin chuẩn 80 %, 100 %, 120 % lượng rutin mẫu thử (với mức % chuẩn bị mẫu) Tiến hành sắc ký với mẫu thử thêm chất đối chiếu Tính tỷ lệ thu hồi dựa lượng chất đối chiếu thêm vào lượng tìm theo cơng thức: 22 𝑅 = 𝐶2 − 𝐶1 × 100 (%) 𝐶0 Trong đó: R: Tỷ lệ thu hồi (%) C2: Nồng độ rutin mẫu thử thêm chuẩn (µg/ml) C1: Nồng độ rutin mẫu thử (µg/ml) C0: Nồng độ rutin thêm vào theo lý thuyết (µg/ml) Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi từ 80 - 115 % giá trị RSD tỷ lệ thu hồi không 2,0 % 2.2.2 Phương pháp đánh giá lượng hoạt chất giải phóng qua màng cellulose acetat Để đánh giá giải phóng hoạt chất chế phẩm, sử dụng hệ thống tế bào khuếch tán Franz kiểu đứng với điều kiện sau: Màng sử dụng: Màng cellulose acetat Sartorius 0,45 µm, diện tích 4,906 cm2 Khoang cho chứa g nhũ tương rutin gel nhũ tương rutin Khoang nhận chứa hỗn hợp dung môi PG - đệm salin phosphat pH 6,8 (3:7, tt/tt), thể tích 12,4 ml, trì nhiệt độ 32 ± 0,5 oC Cách tiến hành: Ngâm màng cellulose acetat vào hỗn hợp dung môi PG - đệm salin phosphat pH 6,8 (3:7, tt/tt) 12 Cho khuấy từ vào khoang nhận Lắp cố định màng cellulose acetat khoang cho khoang nhận Dùng kẹp cố định hai khoang Cho môi trường thử vào khoang nhận, xoay tế bào theo nhiều chiều để loại bọt khí màng mơi trường bọt khí mơi trường Gắn tế bào khuếch tán vào máy khuấy từ, vận hành máy khuấy từ với tốc độ 600 vòng/phút (rpm) Lắp đặt tế bào Franz với hệ thống hồi lưu nước 32 oC Khi nhiệt độ môi trường đạt 32 oC, cho mẫu thử vào khoang cho Dùng màng parafilm bịt kín khoang cho để tránh dung môi bay 23 Lấy mẫu thời điểm: 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 Mỗi lần lấy 0,7 ml dịch từ khoang nhận, bổ sung dung môi sau lấy Luôn đảm bảo dung môi khoang nhận tiếp xúc với màng 41 2.2.3 Xây dựng công thức nhũ tương chứa rutin 2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn tá dược Mục đích: Lựa chọn tá dược sử dụng nghiên cứu Khảo sát độ tan rutin tá dược, trình bày Bảng 2.5 Bảng 2.5 Các tá dược dùng để khảo sát độ tan rutin Tá dược thân nước Tá dược thân dầu Nhóm tá dược Tá dược khảo sát Nhóm nước cất dung dịch đệm Nước cất, đệm phosphate 6,8, đệm phosphat 7,4 Nhóm alcol bay Ethanol 96 %, IPA Nhóm polyol PG, PEG 400, glycerol Chất điều chỉnh mùi Eucalytol (được sử dụng dạng dung dịch IPA) Nhóm ester CAP, labrafac, IPM Nhóm dầu thực vật acid béo Dầu bơ, dầu cám gạo, dầu jojoba, dầu hạt nho, acid oleic Chất chống oxy hóa α - tocopherol Cách tiến hành: Cho lượng dư rutin (khoảng g) vào khoảng 10 ml tá dược, khuấy liên tục 48 Ly tâm để loại phần rutin không tan, lọc qua màng 0,45 µm Cân xác lượng dịch lọc, cho vào bình định mức Pha lỗng hỗn hợp chloroform - methanol (6:4, tt/tt) đến nồng độ thích hợp Định lượng rutin phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ tử ngoại UV 24 2.2.3.2 Xác định tỷ lệ thành phần pha Dầu Mục đích: Dựa vào hệ số phân bố D/N (logP) rutin để lựa chọn tỷ lệ thành phần pha Dầu nhũ tương Dược chất có khả thấm sâu vào da có giá trị logP gần Tuy nhiên thực tế, dược chất có logP gần Có thể thay đổi pha Dầu để thay đổi hệ số logP, hướng đến giá trị logP gần Cách tiến hành: Cân 20 g pha Nước 20 g pha Dầu vào bình nón nút mài 100 ml, lắc 24 để bão hịa dung mơi Chuyển hỗn hợp từ bình nón qua bình lắng gạn, tách riêng hai pha thu pha Nước (1) pha Dầu (1) Cân 200 mg rutin vào 15 g pha Nước (1), lắc 24 để hòa tan rutin Ly tâm, gạn lấy phần dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 µm để loại cắn khơng tan, thu pha Nước (2) Cân 15 g pha Nước (2) 15 g pha Dầu (1) vào bình nón nút mài 100 ml, lắc 48 giờ, để rutin tái phân bố vào hai pha Chuyển hỗn hợp qua bình lắng gạn, tách riêng pha Dầu pha Nước 42 Định lượng rutin pha phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ tử ngoại UV Hệ số logP rutin tính theo cơng thức: 𝑙𝑜𝑔𝑃 = log 𝐶𝐷 𝐶𝑁 Trong đó: logP: Hệ số phân bố Dầu/Nước CD: Nồng độ rutin pha Dầu (µg/g) CN: Nồng độ rutin pha Nước (µg/g) 2.2.3.3 Khảo sát lựa chọn chất nhũ hóa Mục đích: Chọn loại CNH hình thành nhũ tương ổn định, có độ bền pha lớn 25 Nghiên cứu thực khảo sát loại CNH sau: Tween 80, span 80, cremophor RH 40, cremophor EL 35, hỗn hợp tween 80 - span 80, hỗn hợp cremophor RH 40 cremophor EL 35 tỷ lệ khác Cách tiến hành: Điều chế nhũ tương trắng có cơng thức sau: Pha Dầu 15 g Propylen glycol 30 g Isopropyl alcol 5g Chất nhũ hóa 2g Nước cất vđ 100 g Điều chế nhũ tương trắng với cỡ mẫu 100 g, tỷ lệ CNH sử dụng %, theo sơ đồ Hình 2.3 PG, CNH, Pha Dầu IPA Khuấy phút Thêm từ từ Nước cất Hỗn hợp Khuấy 350 rpm, 30 phút Nhũ tương Hình 2.3 Sơ đồ điều chế nhũ tương trắng Cân lượng PG, CNH, IPA, pha Dầu theo công thức khuấy phút Thêm từ từ nước cất vào công thức, vừa thêm vừa khuấy Sau cho hết lượng nước cất, tiếp tục khuấy thêm 15 phút 26 Sau nhũ tương trắng hình thành, để nhũ tương ổn định nhiệt độ phòng Cân 20 g nhũ tương trắng vào ống nghiệm có nắp, đậy kín Tiến hành sốc nhiệt nhũ tương cách ngâm ống nghiệm chứa nhũ tương bể cách thủy ổn định nhiệt độ 40 oC Quan sát nhũ tương sau 15 phút, nhũ tương bên ống nghiệm bắt đầu có tượng tách pha, ghi nhận thời gian sốc nhiệt So sánh độ bền pha nhũ tương điều chế Lựa chọn CNH tạo nhũ tương có độ bền pha lớn 2.2.3.4 Tối ưu hóa cơng thức nhũ tương chứa rutin Mục đích: Xác định tỷ lệ pha Dầu, CNH, PG cơng thức để thu nhũ tương có độ bền pha khả giải phóng hoạt chất tốt Cách tiến hành: Bước 1: Xác định biến độc lập (A, B, C) mức giá trị chúng từ kết giai đoạn sàng lọc tá dược Các biến phụ thuộc Yi Các biến khai báo trình bày cụ thể Bảng 2.6 Bảng 2.6 Các biến khai báo mơ hình tối ưu hóa cơng thức nhũ tương Biến độc lập Biến phụ thuộc Biến Đơn vị Mức thấp Mức cao A - Tỷ lệ pha Dầu % 15 25 B - Tỷ lệ CNH % C - Tỷ lệ PG % 20 35 Y1 - Độ bền pha Giờ Y2 - Lượng hoạt chất giải µg/cm2 phóng đơn vị diện tích màng sau Bước 2: Xây dựng mơ hình thực nghiệm tối ưu hóa phần mềm Design-Expert v12.0 Mơ hình thực nghiệm tối ưu hóa thiết kế gồm 15 thí nghiệm trình bày Bảng 2.7 27 Bảng 2.7 Mô hình thực nghiệm tối ưu hóa cơng thức nhũ tương A - Tỷ lệ pha Dầu (%) B - Tỷ lệ CNH (%) C - Tỷ lệ PG 25 27,5 20 3,5 27,5 25 3,5 35 15 3,5 35 15 27,5 25 27,5 20 3,5 27,5 15 27,5 20 35 10 20 3,5 27,5 11 20 20 12 20 35 13 15 3,5 20 14 20 20 15 25 3,5 20 STT (%) Bước 3: Thực thí nghiệm điều chế nhũ tương trắng nhũ tương chứa rutin theo mô hình thiết kế với cỡ mẫu 100 g Điều chế nhũ tương trắng: Cân PG CNH, pha Dầu vào cốc có mỏ, khuấy phút thu hỗn hợp (1) Thêm IPA eucalyptol vào hỗn hợp (1), khuấy phút Thêm nước cất từ từ, vừa thêm vừa khuấy Sau cho hết lượng nước cất, khuấy thêm 15 phút, thu 100 g nhũ tương trắng Điều chế nhũ tương chứa rutin: Cân PG CNH, pha Dầu vào cốc có mỏ, khuấy phút thu hỗn hợp (1) Cân rutin vào hỗn hợp (1), hòa tan nhiệt độ 80 C 10 phút, khuấy đến nguội, thu hỗn hợp (2) Thêm IPA eucalyptol o 28 vào hỗn hợp (2), khuấy phút Thêm từ từ nước cất, vừa cho vừa khuấy 15 phút Sau cho hết lượng nước cất, khuấy thêm 15 phút, thu 100 g nhũ tương chứa rutin Quy trình điều chế nhũ tương chứa rutin trình bày sơ đồ Hình 2.4 Propylen glycol, CNH Khuấy phút Pha Dầu Capryol 90, Dầu bơ Rutin Hỗn hợp bơ Hòa tan 80 oC, 10 phút ropylen glycol Khuấy nguội IPA, Hỗn hợp eucalyptol Khuấy phút Hỗn hợp Thêm từ từ nước cất Khuấy 350 rpm, 30 phút Nhũ tương Hình 2.4 Sơ đồ điều chế nhũ tương tổng quát Bước 4: Đánh giá tính chất nhũ tương trắng nhũ tương chứa rutin thu Các tính chất khảo sát gồm: Cảm quan: Quan sát màu sắc, độ đồng nhũ tương pH: Dùng máy đo pH để ghi nhận giá trị pH nhũ tương Kích thước giọt trung bình nhũ tương: Sử dụng thiết bị đo kích thước hạt Mastersizer 3000 để đo kích thước giọt nhũ tương 29 Định lượng: Định lượng rutin phương pháp HPLC trình bày mục 2.2.1.4, nhũ tương phải đạt nồng độ rutin khoảng 90 - 110 % so với yêu cầu Bước 5: Đánh giá biến phụ thuộc Yi Độ bền pha: Sau nhũ tương chứa rutin tạo thành, để nhũ tương ổn định Cân 20 g nhũ tương chứa rutin vào ống nghiệm có nắp Tiến hành sốc nhiệt nhũ tương chứa rutin cách ngâm ống nghiệm chứa nhũ tương bể cách thủy ổn định nhiệt độ 40 oC Quan sát nhũ tương sau 60 phút, nhũ tương bên ống nghiệm bắt đầu có tượng tách pha, ghi nhận thời gian sốc nhiệt Lượng hoạt chất giải phóng đơn vị diện tích màng sau giờ: Xác định theo phương pháp đánh giá khả giải phóng hoạt chất trình bày mục 2.2.1.3 Bước 6: Phân tích liệu thực nghiệm để tìm quy luật, xu hướng mức độ ảnh hưởng, phương trình tốn học thể mối quan hệ định lượng biến độc lập (A,B,C) biến phụ thuộc Yi Bước 7: Thiết lập ràng buộc mong muốn biến phụ thuộc Yi Sử dụng chức dự đoán phần mềm để đề xuất giá trị biến độc lập dự đoán cho giá trị biến phụ thuộc tối ưu Bước 8: Chọn công thức từ liệu tối ưu bước để thực thí nghiệm kiểm chứng phù hợp giá trị Yi thực tế giá trị Yi dự đốn Từ đó, xác nhận cơng thức nhũ tương tối ưu 2.2.4 Xây dựng cơng thức quy trình điều chế gel nhũ tương chứa rutin 2.2.4.1 Khảo sát lựa chọn tá dược tạo gel Mục tiêu: Chọn loại nồng độ tá dược tạo gel cho gel nhũ tương chất mềm mịn, pH phù hợp với dạng bào chế dùng da, có khả giải phóng hoạt chất cao Đề tài khảo sát tá dược tạo gel sau: Poloxamer 407, carbopol 940, phối hợp carbopol 940 poloxamer 407, phối hợp carbopol 940 HA 30 Đặt tên gel khảo sát G1 đến G8 Các loại lượng tá dược tạo gel cho thí nghiệm khảo sát trình bày Bảng 2.8 Bảng 2.8 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ tá dược tạo gel gel nhũ tương chứa rutin Gel Tỷ lệ tá dược tạo gel (%, kl/kl) Poloxamer 407 Carbopol 940 G1 G2 G3 0,3 G4 0,2 G5 0,1 G6 0,2 G7 0,3 0,2 G8 0,2 0,2 Các gel nhũ tương rutin điều chế theo sơ đồ Hình 2.5 HA 31 Khuấy Propylen glycol, CNH CAP; dầu bơ IPM; α - tocopherol Rutin Khuấy 80 oC, 10 phút Khuấy đến nguội Hỗn hợp Tá dược tạo gel Nước cất Khuấy phút Eucalyptol IPA Nước cất Khuấy 350 rpm, 15 phút Khuấy Gel Nhũ tương A Triethanolamin Khuấy Gel nhũ tương Hình 2.5 Sơ đồ điều chế gel nhũ tương rutin tổng quát 32 Điều chế gel nền: Cân g carbopol 940, phân tán từ từ vào vừa đủ 100 g nước cất, khuấy máy khuấy từ 15 phút Để nhiệt độ phòng để carbopol trương nở hoàn toàn, thu gel carbopol % Cân 24 g poloxamer 407 vào cốc có mỏ, thêm vừa đủ 100 g nước cất Đậy kín màng parafilm, để ngăn mát tủ lạnh 24 để gel trương nở hoàn toàn, thu gel poloxamer 24 % Cân g HA, phân tán vào vừa đủ 100 g nước cất, khuấy nhiệt độ phòng Thu gel HA % Điều chế gel nhũ tương: Cân lượng rutin, pha Dầu, CNH, PG theo cơng thức Đun nóng 80 oC, khuấy 10 phút để hịa tan rutin hồn tồn, khuấy đến nguội Phối hợp thêm hỗn hợp IPA eucalyptol, khuấy phút Tính lượng nước cất cịn thiếu công thức sau trừ lượng nước dùng gel Thêm lượng nước cất thiếu, khuấy 15 phút, thu nhũ tương (A) Cân lượng gel cần thiết cho thí nghiệm, cho vào nhũ tương (A), phân tán đến đồng Điều chỉnh pH triethanolamin thí nghiệm sử dụng carbopol 2.2.4.2 Đánh giá gel nhũ tương chứa rutin Đánh giá cảm quan: Ghi nhận màu sắc, mùi, thể chất gel nhũ tương chứa rutin Độ dàn mỏng: Cân khoảng g gel nhũ tương lên phiến kính, đặt phiến kính khác lên Giữ yên phút Ghi nhận diện tích tản khối gel, đánh giá cảm quan phần gel tản pH: Cân g gel nhũ tương, pha loãng vào vừa đủ 50 ml nước cất Kiểm tra pH máy đo pH Đánh giá khả giải phóng hoạt chất gel nhũ tương theo mục 2.2.1.3 33 Định lượng: Định lượng hàm lượng rutin gel phương pháp HLPC trình bày mục 2.2.1.4 Từ kết khảo sát, chọn gel nhũ tương phù hợp với mục tiêu đề 34 Chương KẾT QUẢ Thẩm định quy trình định lượng rutin 3.1.1 Thẩm định quy trình định lượng rutin phương pháp quang phổ tử ngoại Tính đặc hiệu Kết thẩm định tính đặc hiệu trình bày Hình 3.6 (a) (b) (c) Hình 3.6 Phổ tử ngoại mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b), mẫu thử chứa rutin (c) Phổ tử ngoại mẫu thử có đỉnh hấp thụ bước sóng cực đại 257 nm 360 nm tương tự mẫu chuẩn Mẫu trắng đỉnh hấp thụ bước sóng 257 nm 360 nm Do quy trình định lượng rutin phương pháp quang phổ tử ngoại đạt tính đặc hiệu Lựa chọn bước sóng 360 nm để thực phép đo quang phổ tử ngoại để định lượng rutin 35 Tính tuyến tính Kết khảo sát tính tuyến tính trình bày Bảng 3.9 Hình 3.7 Bảng 3.9 Độ hấp thụ dung dịch rutin chloroform - methanol (6:4, tt/tt) Nồng độ (g/ml) Độ hấp thụ (AU) 0,1141 10 0,2799 16 0,4498 20 0,5714 24 0,6763 30 0,8491 Đường biểu diễn tương quan nồng độ dung dịch rutin chloroform - Độ hấp thụ methanol (6:4, tt/tt) độ hấp thụ thể Hình 3.7 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 ŷ = 0.0283x R² = 0.9998 10 15 20 25 Nồng độ rutin (µg/ml) 30 35 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ độ hấp thụ rutin chloroform - methanol (6:4, tt/tt) Phương trình hồi quy tuyến tính nồng độ rutin độ hấp thụ dung dịch rutin chuẩn có dạng: ŷ = 0,0283x 36 Sử dụng cơng cụ phân tích hồi quy tương quan biến (Regression MS - Excel 2010) kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy đánh giá ý nghĩa hệ số hồi quy Tính tương thích phương trình hồi quy Ta có: p = < = 0,05 Bác bỏ H0, chấp nhận HA: phương trình hồi quy tương thích Kết thu cho thấy: Có tương quan tuyến tính độ hấp thụ nồng độ dung dịch rutin khoảng nồng độ khảo sát với R2 = 0,9998 > 0,999 Phương trình hồi quy có dạng: ŷ = 0,0283x Vậy quy trình định lượng rutin phương pháp tử ngoại đạt tính đặc hiệu, tính tuyến tính khoảng nồng độ 4,0 - 30,0 g/ml 3.1.2 Thẩm định quy trình định lượng rutin dịch giải phóng hoạt chất gel nhũ tương phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tính phù hợp hệ thống Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống trình bày Bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn rutin Thời gian lưu Diện tích pic (phút) (µAU x giây) 11,071 1800118 11,045 1810052 11,044 1801036 11,056 1822382 11,070 1783321 11,092 1790903 TB 11,063 1801302 RSD 0,165 0,766 37 Nhận xét: RSD thời gian lưu diện tích pic rutin mẫu chuẩn nhỏ % Vậy quy trình định lượng rutin dịch giải phóng hoạt chất có tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu Kết khảo sát tính đặc hiệu minh họa Hình 3.8 (a) Pha động (c) Dung môi pha mẫu thử gel nhũ tương (methanol) (e) Mẫu thử giải phóng hoạt chất (g) Mẫu thử gel nhũ tương (b) Dung môi thử giải phóng hoạt chất (d) Mẫu chuẩn rutin (f) Mẫu thử giải phóng hoạt chất thêm chuẩn (h) Mẫu thử gel nhũ tương thêm chuẩn Hình 3.8 Các sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu phương pháp HPLC 38 Trong điều kiện sắc ký chọn, kết khảo sát tính đặc hiệu cho thấy: - Sắc ký đồ pha động dung mơi thử giải phóng hoạt chất không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu rutin mẫu chuẩn - Sắc ký đồ mẫu thử xuất pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu rutin sắc ký đồ mẫu chuẩn Pic rutin tách hoàn toàn khỏi pic tạp Khi thêm rutin vào mẫu thử, diện tích pic chiều cao pic rutin tăng lên, đồng thời pic tách hồn tồn Vậy quy trình định lượng HPLC rutin dịch thử giải phóng hoạt chất gel nhũ tương đạt tính đặc hiệu Tính tuyến tính Kết khảo sát mối tương quan diện tích pic nồng độ rutin trình bày Bảng 3.11 Hình 3.9 Bảng 3.11 Kết khảo sát mối tương quan diện tích pic nồng độ rutin Nồng độ rutin mẫu Diện tích pic µg/ml - X (µAU.s) - Y 111841 10 174767 20 411613 ŷ =23231x – 55201 40 852272 R² = 0,9991 80 1704544 150 3446478 200 4620463 Phương trình hồi quy Diện tích pic (µAU.s) 39 5000000 4000000 3000000 2000000 ŷ = 23231x - 55201 R² = 0,9991 1000000 0 50 100 150 200 Nồng độ rutin chuẩn (µg/ml) 250 Hình 3.9 Đồ thị biễu diễn tương quan diện tích pic nồng độ rutin methanol Sử dụng cơng cụ phân tích hồi quy tương quan biến (Regression MS Excel 2010) kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy đánh giá ý nghĩa hệ số hồi quy Tính tương thích phương trình hồi quy: Ta có: p = < = 0,05 Vậy bác bỏ H0, chấp nhận HA: phương trình hồi quy tương thích với độ tin cậy 95 % Ý nghĩa hệ số hồi quy Pb < 0,05 Vậy bác bỏ H0, chấp nhận HA, hệ số b có ý nghĩa Pbo > 0,05 Vậy chấp nhận H0, hệ số bo khơng có ý nghĩa Kết thu cho thấy: có tương quan tuyến tính diện tích pic khoảng nồng độ khảo sát với R2 = 0,9991> 0,999 Phương trình hồi quy có dạng: ŷ = 23231x Độ lặp lại Độ lặp lại mẫu thử giải phóng hoạt chất trình bày Bảng 3.12 40 Bảng 3.12 Kết thẩm định độ lặp lại mẫu thử giải phóng hoạt chất mẫu thử gel nhũ tương Mẫu thử giải phóng hoạt chất Mẫu thử gel nhũ tương STT Diện tích pic (Au.s) Hàm lượng rutin định lượng (µg/ml) Diện tích pic (Au.s) Hàm lượng rutin định lượng (µg/ml) 1343203 57,82 2059113 88,64 1344734 57,89 2122056 91,35 1337772 57,59 2091789 90,04 1338430 57,61 2091753 90,04 1335177 57,47 2107254 90,71 1333162 57,39 2137146 92,00 Trung bình 57,63 90,46 RSD (%) 0,19 1,30 Nhận xét: RSD (%) hàm lượng rutin mẫu thử giải phóng hoạt chất mẫu thử gel nhũ tương  2,0 % Vậy quy trình định lượng rutin dịch thử giải phóng hoạt chất gel nhũ tương phương pháp HPLC đạt độ lặp lại Độ Kết thẩm định độ phương pháp HPLC định lượng rutin dịch thử giải phóng hoạt chất trình bày Bảng 3.13 41 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ phương pháp HPLC định lượng rutin dịch thử giải phóng hoạt chất Lượng chất chuẩn thêm vào (µg) Lượng chất định lượng (µg) Tỷ lệ thu hồi (%) 46,2 44,77 97,33 46,3 44,89 97,60 45,0 45,05 97,95 57,3 54,03 94,78 58,1 55,76 95,97 57,1 56,17 98,55 70,0 66,97 95,67 69,2 70,01 101,17 68,5 66,97 97,76 80% 100% 120% Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) 97,62 96,50 98,2 Kết thẩm định độ phương pháp HPLC định lượng rutin gel nhũ tương trình bày Bảng 3.14 42 Bảng 3.14 Kết thẩm định độ phương pháp HPLC định lượng rutin gel nhũ tương Lượng chất chuẩn thêm vào (µg) Lượng chất tìm lại (µg) Tỷ lệ thu hồi (%) 72,2 63,22 87,56 72,5 65,20 90,00 72,0 62,35 86,38 90,1 85,82 95,25 91,0 83,56 91,82 90,3 80,63 89,29 99,1 85,39 86,16 100 91,04 92,61 100 89,83 91,47 80% 100% 120% Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) 87,97 92,12 90,37 Vậy quy trình định lượng rutin dịch thử giải phóng hoạt chất gel nhũ tương phương pháp HPLC đạt độ Xây dựng công thức nhũ tương chứa rutin 3.2.1 Khảo sát lựa chọn tá dược Kết khảo sát độ tan rutin dung mơi trình bày Bảng 3.15 Bảng 3.16 43 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ tan rutin tá dược thân nước Nhóm nước cất dung dịch đệm Nhóm polyol Nhóm alcol bay Nhóm tá dược điều Dung mơi Độ tan (mg/g) Nước cất 0,24 ± 0,02 Đệm phosphat 6,8 0,25 ± 0,01 Đệm phosphat 7,4 0,27 ± 0,01 PG 23,60 ± 0,26 PG - nước cất (2:8, tt/tt) 0,72 ± 0,01 PG - Tween 80 (100:1) 29,51 ± 0,23 PG - Tween 80 (100:2) 32,79 ± 0,11 PG - Tween 80 (100:5) 39,20 ± 0,13 PEG 400 15,85 ± 0,63 Glycerol - nước cất (1:1, kl/kl) 4,10 ± 0,08 Methanol 41,0 ± 0,31 IPA 2,16 ± 0,09 Ethanol 20,13 ± 0,60 IPA - eucalyptol (10:1, kl/kl) 5,33 ± 0,71 chỉnh mùi Kết Bảng 3.15 cho thấy: Các tá dược nhóm nước cất dung dịch đệm hịa tan rutin (trong khoảng 0,2 mg/g) Trong nhóm polyol, PG hịa tan rutin tốt so với PEG 400 gấp 1,5 lần, gấp 4,5 lần so với hỗn hợp glycerol - nước cất (1:1, kl/kl) PG cịn có nhiều ưu điểm có khả giữ ẩm da, đồng thời đóng vai trị bảo quản cho chế phẩm Do lựa chọn PG dung mơi để hịa tan rutin cơng thức với nồng độ khoảng 20 - 40 % Từ độ tan rutin hỗn hợp PG - nước cất (2:8, kl/kl), rutin có khả đạt nồng độ bão hịa 0,74 %, để đảm bảo rutin tan hồn tồn bào chế nhũ tương, lựa chọn nồng độ rutin nhũ tương 0,15 % (kl/kl) 44 Khi thêm tween 80 vào PG độ tan rutin tăng, tỷ lệ tween 80 cao rutin tan nhiều Trong nhóm alcol bay hơi, ethanol hòa tan rutin gần với PG, gấp 10 lần so với IPA, IPA độc ethanol, có cơng dụng giúp cải thiện cảm giác bơi sản phẩm lên da, lựa chọn IPA đưa vào công thức gel nhũ tương Cố định nồng độ IPA sử dụng % (kl/kl) tổng công thức gel nhũ tương Chất điều chỉnh mùi: Nghiên cứu cố định nồng độ eucalyptol sử dụng nhũ tương 0,5 % Trên thực tế khảo sát, thêm eucalyptol vào IPA cịn có khả hịa tan rutin tốt so với IPA đơn chất Bảng 3.16 Kết khảo sát độ tan rutin tá dược thân dầu Nhóm ester Nhóm dầu thực vật acid béo Nhóm chất chống Dung mơi Độ tan (mg/g) Capryol 90 1,05 ± 0,02 Labrafac 0,028± 0,001 IPM 0,09± 0,002 Dầu bơ 0,74± 0,001 Dầu hạt nho 0,018± 0,001 Dầu cám gạo < µg/g Dầu jojoba 0,005 Acid oleic < µg/g Dầu bơ - α - tocopherol (100:1, kl/kl) 0,55 ± 0,01 oxy hóa Kết bảng Bảng 3.16 cho thấy: Trong nhóm ester, CAP có khả hịa tan rutin 1,05 mg/g, gấp 1,5 lần dầu bơ, 10 lần IPM 37 lần labrafac 45 CAP dầu bơ hòa tan rutin tốt nên chọn làm thành phần cho pha Dầu IPM hịa tan rutin, nhiên IPM có tác dụng làm tăng tính thấm nên sử dụng cơng thức Trong nhóm dầu thực vật acid béo, khả hòa tan rutin dầu bơ 0,74 mg/g, gấp 40 lần dầu hạt nho Rutin gần không tan dầu jojoba, dầu cám gạo acid oleic Chất chống oxy hóa: Do sử dụng dầu bơ dầu thực vật nên α - tocopherol thêm vào pha Dầu với nồng độ % so với tổng khối lượng pha Dầu Kết đánh giá độ tan rutin cho thấy, thêm α - tocopherol vào dầu bơ với tỷ lệ % độ tan rutin giảm so với sử dụng riêng dầu bơ, từ 0,74 mg/g xuống 0,55 mg/g Từ kết khảo sát độ tan rutin, tá dược lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu xây dựng công thức nhũ tương sau: Pha Nước gồm: PG, hỗn hợp eucalyptol IPA, nước cất Trong đó: - Tỷ lệ PG đưa vào khảo sát tối ưu hóa - Tỷ lệ sử dụng IPA eucalyptol cố định 0,5 % so với tổng khối lượng nhũ tương Pha Dầu gồm: CAP, dầu bơ, IPM, α - tocopherol Trong đó: - Tỷ lệ α - tocopherol %, kl/kl so với tổng khối lượng pha Dầu - Tỷ lệ CAP, dầu bơ, IPM pha Dầu tiếp tục nghiên cứu mục 3.2.2 3.2.2 Xác định tỷ lệ thành phần pha Dầu Kết khảo sát hệ số phân bố Dầu/Nước rutin trình bày Bảng 3.17 46 Bảng 3.17 Kết khảo sát hệ số phân bố D/N rutin STT Thành phần pha Nước Thành phần pha Dầu (kl/kl) (kl/kl) LogP A1 Nước cất IPM -2,84 A2 PG - nước cất (2:8) IPM -3,92 A3 PG - nước cất (2:8) Dầu bơ -1,58 A4 PG - nước cất (2:8) CAP -0,15 A5 PG - nước cất (2:8) Dầu bơ - IPM (2:8) -1,51 A6 PG - nước cất (2:8) CAP - IPM (2:8) -1,59 A7 PG - nước cất (3:7) CAP - dầu bơ - IPM (50:35:15) -0,82 A8 PG - IPA- nước cất (3:1:6) CAP - dầu bơ - IPM (20:50:30) -1,25 A9 PG - IPA- nước cất (3:1:6) CAP - dầu bơ - IPM (50:35:15) -0,95 A10 PG - IPA- nước cất (3:1:6) CAP - dầu bơ - IPM (50:25:25) -0,99 Qua kết khảo sát, nhận thấy tất hệ số phân bố D/N khảo sát rutin âm Khi pha Dầu chứa IPM rutin phân bố vào pha Dầu (thí nghiệm A1, logP = -2,84) Pha Nước có thêm PG hệ số logP giảm mạnh (thí nghiệm A2, logP = -3,92) Khi thêm CAP dầu bơ vào pha Dầu hệ số logP, tăng từ -3,92 lên khoảng -1,5 (thí nghiệm A5, A6) Điều phù hợp với kết khảo sát độ tan rutin Thí nghiệm A7, A9 cho thấy thêm IPA vào pha Nước làm hệ số phân bố tăng nhẹ -0,95 từ lên -0,82 Thí nghiệm A8 đến A10 cho thấy, với pha Nước gồm PG - IPA- nước cất (3:1:6) tăng tỷ lệ CAP dầu bơ pha Dầu hệ số phân bố tăng, tỷ lệ CAP - dầu bơ - IPM (50:35:15) có hệ số phân bố âm -0,95 Do lựa chọn thành phần pha Dầu gồm CAP - dầu bơ - IPM (50:35:15) Do α - tocopherol chiếm % (kl/kl) so với pha Dầu, nên thay phần IPM α - tocopherol 47 Vậy thành phần pha Dầu gồm CAP - dầu bơ - IPM - α - tocopherol (50:35:14:1), với tỷ lệ đưa vào khảo sát tối ưu hóa 3.2.3 Khảo sát lựa chọn chất nhũ hóa Kết khảo sát độ bền nhũ tương trắng sử dụng loại CNH khác trình bày Bảng 3.18 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ bền pha nhũ tương trắng STT Độ bền pha 40 oC (giờ) CNH Cremophor RH 40 1,25 Cremophor EL 35 1,5 Cremophor RH 40 : EL 35 (1:1, kl/kl) Cremophor RH 40 : EL 35 (1:2, kl/kl) 0,5 Tween 80 Span 80 Tween 80 : span 80 (3:1, kl/kl) Tween 80 : span 80 (3:2, kl/kl) 5,5 Tween 80 : span 80 (1:1, kl/kl) 11 10 Tween 80 : span 80 (2:3, kl/kl) 15 11 Tween 80 : span 80 (1:3, kl/kl) 26 Kết khảo sát cho thấy, nhũ tương điều chế với nồng độ CNH %, độ bền pha có khác Khi sử dụng cremophor RH 40 cremophor EL 35 dạng đơn lẻ hay kết hợp nhũ tương hình thành không ổn định, độ bền pha từ 0,5 đến 1,5 Khi sử dụng riêng tween 80 nhũ tương ổn định (1 giờ), sử dụng riêng span 80 nhũ tương bền 48 Khi sử dụng hỗn hợp tween 80 span 80 độ bền pha tăng, tăng tỷ lệ span 80 nhũ tương bền Hỗn hợp tween 80 - span 80 (1:3, kl/kl) tạo nhũ tương bền nhất, lên đến 26 Vậy chọn CNH hỗn hợp tween 80 - span 80 (1:3, kl/kl), với tỷ lệ đưa vào khảo sát tối ưu hóa 3.2.4 Tối ưu hóa cơng thức nhũ tương chứa rutin Đặt công thức nhũ tương chứa rutin mơ hình tối ưu hóa NT1 đến NT15, điều chế với cỡ mẫu 100 g, tỷ lệ rutin nhũ tương 0,15 % Các công thức nhũ tương trình bày cụ thể Bảng 3.19 49 Bảng 3.19 Các công thức nhũ tương mơ hình thực nghiệm tối ưu hóa Cơng thức Rutin* Pha Dầu CNH PG (g) (g) (g) (g) IPA Eucalyptol Nước cất (g) (g) (g) NT1 0,183 25 27,5 0,5 36,8 NT2 0,183 20 3,5 27,5 0,5 43,3 NT3 0,183 25 3,5 35 0,5 30,8 NT4 0,183 15 3,5 35 0,5 40,8 NT5 0,183 15 27,5 0,5 49,8 NT6 0,183 25 27,5 0,5 39,8 NT7 0,183 20 3,5 27,5 0,5 43,3 NT8 0,183 15 27,5 0,5 46,8 NT9 0,183 20 35 0,5 37,3 NT10 0,183 20 3,5 27,5 0,5 43,3 NT11 0,183 20 20 0,5 49,3 NT12 0,183 20 35 0,5 34,3 NT13 0,183 15 3,5 20 0,5 55,8 NT14 0,183 20 20 0,5 52,3 NT15 0,183 25 3,5 20 0,5 45,8 Trong đó: Rutin*: Khối lượng rutin nguyên liệu cân tương ứng với 0,15 g rutin tinh khiết 100 % Trong công thức nhũ tương trắng khơng có rutin Pha Dầu: Hỗn hợp CAP - dầu bơ - IPM - α - tocopherol (50:35:14:1) CNH: Hỗn hợp tween 80 - span 80 (1:3) Các nhũ tương trắng tạo thành có màu trắng đến vàng nhạt, đục rõ rệt, đồng (Hình 3.10) 50 Hình 3.10 Hình ảnh nhũ tương trắng Các nhũ tương chứa rutin có màu vàng, đục rõ rệt, đồng nhất, khơng có cặn khơng tan Hình 3.11 Hình ảnh nhũ tương chứa rutin Kết đánh giá số tính chất hóa lý nhũ tương trình bày Bảng 3.20 51 Bảng 3.20 Kết đánh giá số tính chất hóa lý nhũ tương STT pH Kích thước giọt trung bình (µm) Định lượng rutin nhũ tương rutin NT trắng NT rutin NT trắng NT rutin µg Hàm lượng % so với yêu cầu NT1 7,19 6,67 0,197 0,215 151,92 101,3 NT2 7,23 6,76 3,33 2,64 156,4 104,3 NT3 7,20 6,15 7,91 7,11 152,36 101,6 NT4 7,20 6,72 4,96 2,97 157,9 105,3 NT5 7,39 6,61 3,50 4,42 148,04 98,7 NT6 7,32 6,55 5,32 6,36 156,1 104,1 NT7 7,04 6,80 2,56 3,48 150,26 100,2 NT8 7,55 7,02 3,23 3,14 152,78 101,8 NT9 7,11 6,51 3,63 5,87 157,44 105,0 NT10 7,08 6,67 3,55 2,78 153,12 102,1 NT11 7,34 6,82 6,75 5,3 156,02 104,0 NT12 7,38 6,22 0,254 0,207 149,28 99,5 NT13 7,46 6,82 4,9 5,68 160,26 106,8 NT14 7,37 6,50 3,71 3,71 155,14 103,4 NT15 7,35 6,84 5,84 5,84 150,02 100,0 Các nhũ tương trắng có pH từ 7,08 đến 7,55 Các nhũ tương chứa rutin có pH nằm khoảng 6,15 đến 7,02 Khi thêm rutin pH nhũ tương giảm, nằm khoảng pH trung tính Kích thước giọt trung bình nhũ tương rutin thay đổi so với kích thước giọt trung bình của nhũ tương trắng, 10 µm Tất nhũ tương thử đạt hàm lượng nằm khoảng 90 - 110 % Kết đánh giá biến phụ thuộc thí nghiệm mơ hình tối ưu hóa trình bày Bảng 3.21 52 Bảng 3.21 Kết đánh giá biến phụ thuộc mơ hình tối ưu hóa Y2 - Lượng rutin giải Y1- Độ phóng đơn vị diện bền pha tích màng sau (giờ) (µg/cm2) (n=3) (n=3) 200,3 ± 2,21 STT A - Tỷ lệ pha Dầu (%) B - Tỷ lệ CNH (%) C - Tỷ lệ PG (%) 25 27,5 20 3,5 27,5 183,0 ± 2,21 25 3,5 35 197,1 ± 1,86 15 3,5 35 141,8 ± 1,34 15 27,5 138,3 ± 3,54 25 27,5 11 190,7 ± 2,06 20 3,5 27,5 10 179,5 ± 3,01 15 27,5 141,6 ± 4,88 20 35 164,9 ± 2,05 10 20 3,5 27,5 13 179,4 ± 3,99 11 20 20 156,8 ± 2,09 12 20 35 166,8 ± 2,90 13 15 3,5 20 137,2 ± 1,64 14 20 20 10 130,5 ± 3,53 15 25 3,5 20 138,9 ± 2,82 Phân tích liệu thu từ thực nghiệm, đưa mối quan hệ biến độc lập biến phụ thuộc Mức độ ảnh hưởng biến độc lập đến độ bền pha trình bày Bảng 3.22 Hình 3.12 53 Bảng 3.22 Mức độ ảnh hưởng biến độc lập đến độ bền pha nhũ tương Tổng Bậc Trung bình Giá trị F Giá trị p phương sai tự phương sai Mơ hình 7,05 0,78 5,45 0,04 A-Tỷ lệ pha dầu B-Tỷ lệ CNH C-Tỷ lệ PG 0,14 1,35 2,19 1 0,14 1,35 2,19 0,95 9,37 15,24 0,37 0,03 0,01 AB AC BC 0,57 0,67 0,32 1 0,57 0,67 0,32 3,98 4,63 2,22 0,10 0,08 0,20 A² B² C² 0,49 0,20 1,35 1 0,49 0,20 1,35 3,41 1,38 9,36 0,12 0,29 0,02 Cor Total 7,77 14 Kết cho thấy: Tỷ lệ CNH tỷ lệ PG ảnh hưởng đến độ bền pha có ý nghĩa thống kê, tỷ lệ PG ảnh hưởng mạnh Còn tỷ lệ pha Dầu tương tác ảnh hưởng đến độ bền pha khơng có ý nghĩa thống kê Hình 3.12 Bề mặt đáp ứng độ bền pha theo biến độc lập thiết kế tối ưu hóa Bề mặt đáp ứng (Hình 3.12) cho thấy xu hướng thay đổi phức tạp: - Khi cố định tỷ lệ CNH: tỷ lệ pha dầu giảm độ bền pha tăng đến cực đại giảm; giảm tỷ lệ PG độ bền pha tăng 54 - Khi giữ cố định lệ pha Dầu: PG giảm độ bền pha tăng đến điểm cực đại giảm xuống - Khi cố định tỷ lệ PG, tăng tỷ lệ pha Dầu độ bền pha tăng - Khi tăng đồng thời CNH PG độ bền pha giảm mạnh - Vùng đáp ứng tốt: CNH - 3,8 %, PG 20 - 30 %, pha Dầu đáp ứng tốt tỷ lệ Phương trình mơ hình thu được: 𝑌1 = − 0,1307A − 0,4103B − 0,5234C − 0,3782AB − 0,408AC – 2,0823BC − 0,3642𝐴2 – 0,2316𝐵 – 0,6037𝐶 Phương trình mơ tả có ý nghĩa thống kê với p 0,0382; R2 0,9075; R2 hiệu chỉnh 0,7409 Mức độ ảnh hưởng biến độc lập đến lượng rutin phóng thích đơn vị diện tích màng sau 6h trình bày Bảng 3.23 Hình 3.13 Bảng 3.23 Mức độ ảnh hưởng biến độc lập đến khả giải phóng hoạt chất nhũ tương Tổng Bậc Trung bình Giá trị F Giá trị p phương sai tự phương sai Mơ hình 11,90 1,320 9.890 0,011 A-Tỷ lệ pha Dầu 5,29 B-Tỷ lệ CNH 0,34 C-Tỷ lệ PG 2,27 0,01 AB AC 1,06 BC 0,26 0,36 A² B² 0,23 C² 2,32 Cor Total 12,56 5,290 39,590 0,002 1 1 1 1 14 0,343 2,270 0,011 1,060 0,261 0,364 0,228 2,320 2,570 16,960 0,079 7,900 1,950 2,720 1,710 17,380 0,170 0,009 0,790 0,038 0,221 0,160 0,248 0,009 Kết cho thấy: Tỷ lệ pha Dầu, tỷ lệ PG tương tác pha Dầu PG ảnh hưởng đến khả giải phóng hoạt chất có ý nghĩa thống kê, tỷ lệ pha Dầu ảnh hưởng mạnh Các yếu tố khác ảnh hưởng khơng có ý nghĩa thống kê 55 Hình 3.13 Bề mặt đáp ứng khả giải phóng hoạt chất theo biến độc lập thiết kế tối ưu hóa Kết bề mặt đáp ứng (Hình 3.13) cho thấy: - Khả giải phóng hoạt chất tỷ lệ thuận với tỷ lệ pha Dầu tỷ lệ PG, tăng đồng thời pha Dầu PG khả giải phóng hoạt chất tăng - Khi giữ nguyên tỷ lệ CNH, tăng nồng độ pha Dầu tỷ lệ PG khả giải phóng hoạt chất tăng - Vùng đáp ứng tốt: Pha Dầu 18 - 25 %, CNH - %, PG 25 - 35 % - Phương trình mơ hình thu được: 𝑌2 = 0,8133𝐴 + 0,2072𝐵 × 0,5323𝐶 + 0,0513𝐴𝐵 + 0,5136𝐴𝐶 − 0,2544𝐵𝐶 − 0,3139𝐴2 − 0,2487𝐵2 − 0,7933𝐶 Phương trình mơ tả có ý nghĩa thống kê với p 0,0106; R2 0,9468; R2 hiệu chỉnh 0,8511 Cả hai phương trình mơ hình thu có ý nghĩa thống kê, hai lựa chọn để tối ưu hóa tỷ lệ tá dược cơng thức nhũ tương rutin Các mục tiêu kỳ vọng khai báo phần mềm thiết kế thực nghiệm, trình bày Bảng 3.24 56 Bảng 3.24 Các điều kiện tối ưu hóa cơng thức nhũ tương chứa rutin Biến Hàm mục tiêu A - Tỷ lệ pha Dầu (%) Trong khoảng khảo sát 15 25 B - Tỷ lệ CNH (%) Trong khoảng khảo sát C - Tỷ lệ PG (%) Trong khoảng khảo sát 20 35 Y1 - Độ bền pha (giờ) Trong khoảng dự kiến 8,0 13,0 130,54 200,32 Mức Mức cao thấp nhất Y2 - Lượng hoạt chất giải phóng Lớn đơn vị diện tích màng 6h (µg/cm2) Phần mềm đưa giá trị A, B, C Yi phù hợp với kỳ vọng, trình bày Hình 3.14 Hình 3.14 Hàm kỳ vọng Cơng thức nhũ tương rutin mơ hình dự đốn thực lặp lại lần, kết đánh giá Yi thực nghiệm trình bày Bảng 3.25 Kết cho thấy giá trị Yi thực nghiệm dự đốn khác khơng có ý nghĩa thống kê 57 Bảng 3.25 Giá trị đề xuất, giá trị dự đoán giá trị thực nghiệm Giá trị đề xuất (%) A - Tỷ lệ pha Dầu 24,16 B - Tỷ lệ CNH 2,95 C - Tỷ lệ PG 29,51 Giá trị dự đoán Yi Giá trị thực tế Yi Y1 (giờ) Y2 (µg/cm2) Y1 (giờ) Y2 (µg/cm2) 196,7 8,5 ± 0,5 203,5 ± 4,45 Vậy công thức nhũ tương xây dựng sau: Rutin nguyên liệu 0,183 g Capryol 90 12,08 g Dầu bơ 8,46 g Isopropyl myristat 3,38 g Propylen glycol 29,51 g Isopropyl alcol 5,0 g α-tocopherol 0,24 g Eucalyptol 0,5 g Tween 80 0,74 g Span 80 2,21 g Nước cất vđ 100 g Tiến hành điều chế nhũ tương rutin theo công thức, nhũ tương chứa rutin thu có màu vàng, đục (Hình 3.15), pH trung bình 6,8 ± 0,23; kích thước giọt trung bình 4,41 ± 0,047 µm, dải phân bố kích thước giọt trình bày Hình 3.16 58 Hình 3.15 Nhũ tương rutin có Hình 3.16 Dải phân bố kích thước giọt công thức tối ưu nhũ tương rutin có cơng thức tối ưu Xây dựng cơng thức quy trình điều chế gel nhũ tương rutin Các gel nhũ tương rutin khảo sát có màu trắng đục vàng nhạt, thể chất mềm mịn, đồng Kết đánh giá tính chất khác gel nhũ tương rutin trình bày Bảng 3.26 Bảng 3.26 Kết tính chất gel nhũ tương pH Độ dàn mỏng (cm2) Kích thước giọt Hàm lượng rutin trung bình so với u cầu (µm) (%) Nhũ tương 6,8 - 4,41 ± 0,047 102,5 G1 5,88 28,26 0,222 ± 0,007 97,1 G2 6,14 23,27 0,939 ± 0,002 99,2 G3 6,55 86,54 9,37 ± 0,229 100,3 G4 6,71 83,28 6,01 ± 0,193 101,7 G5 6,37 28,71 0,334 ± 0,005 97,1 G6 6,82 29,20 0,381 ± 0,002 101,0 G7 6,76 56,72 8,19 ± 0,381 96,8 G8 6,48 59,41 7,72 ± 0,120 100,4 59 Tất gel đạt hàm lượng rutin từ 97 đến 102 % so với hàm lượng yêu cầu, pH từ 5,8 đến 6,9, kích thước giọt trung bình 10 µm pH kích thước giọt có thay đổi so với nhũ tương rutin nằm khoảng chấp nhận (< 10 µm) Gel G3 (carbopol 0,3 %) G4 (carbopol 0,2 %) có độ dàn mỏng lớn nhất, gấp lần so với gel có poloxamer thành phần (G1, G2, G5, G6) Do carbopol tạo gel nồng độ thấp, tạo cấu trúc gel linh động nên khả dàn mỏng cao Gel G1 (poloxamer %), G2 (poloxamer %), G5 (poloxamer % phối hợp carbopol 0,1 %), G6 (poloxamer % phối hợp carbopol 0,2 %) có kích thước giọt giảm 10 đến 20 lần so với kích thước giọt nhũ tương chứa rutin Đánh giá tốc độ giải phóng hoạt chất gel nhũ tương rutin nhũ tương rutin, kết trình bày Bảng 3.27 Hình 3.17 Bảng 3.27 Kết khả giải phóng hoạt chất nhũ tương từ công thức tối ưu gel nhũ tương khảo sát Lượng rutin giải phóng đơn vị diện tích màng thời điểm (µg/cm2) Công thức 0,5 giờ giờ Nhũ tương 29,71±3,35 59,63±2,76 104,81±4,16 165,35±2,21 203,82±1,69 rutin G1 4,9±1,01 9,0±1,20 16,1±2,18 25,8±1,22 34,1±1,90 G2 5,3±1,34 8,6±2,53 15,9±2,09 25,2±,354 35,4±1,11 G3 17,6±3,14 35,9±3,27 63,9±4,18 1003±3,20 144,3±3,21 G4 20,6±3,52 40,3±2,75 66,1±3,79 114,0±4,52 155,2±1,43 G5 14,7±2,78 16,9±1,64 26,4±1,00 49,3±1,73 64,1±4,26 G6 12,4±3,65 19,7±2,03 32,9±2,98 51,5±4,11 66,4±1,04 G7 10,9±1,68 20,1±1,92 34,2± 2,11 47,4±2,10 59,0±3,28 G8 17,6±0,97 21,0±2,80 32,4±3,11 55,4±1,55 76,6±2,33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Lượng hoạt chất giải phóng đơn vị diện tích màng sau (µg/cm2) 60 250.0 200.0 150.0 100.0 50.0 0.0 0.5 G1 G2 G3 Thời gian (giờ) G4 G5 G6 G7 G8 Nhũ tương Hình 3.17 Biểu đồ tốc độ giải phóng hoạt chất nhũ tương rutin gel nhũ tương rutin Kết cho thấy: Khi tạo gel, khả giải phóng hoạt chất giảm so với nhũ tương Poloxamer 407 cho gel có khả giải phóng hoạt chất kém, kể giảm nồng độ gel từ % (G1) xuống % (G2) Khi sử dụng riêng carbopol khả giải phóng hoạt chất gel cao Sử dụng trắc nghiệm thống kê ANOVA yếu tố để so sánh khả giải phóng hoạt chất gel carbopol 0,3 % (G3) 0,2 % (G4) Kết cho thấy thời điểm 0,5 đến giờ, khả giải phóng hoạt chất hai gel khác khơng có ý nghĩa thống kê, giờ, khác có ý nghĩa thống kê Vậy khả giải phóng hoạt chất tỷ lệ nghịch với nồng độ carbopol sử dụng Tuy nhiên nồng độ carbopol 940 0,2 %, làm gel thu lỗng, khơng đạt thể chất mong muốn, nên thử phối hợp carbopol HA poloxamer để cải thiện thể chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 61 Khi phối hợp carbopol poloxamer (G5, G6), sử dụng lượng poloxamer đạt thể chất mong muốn kích thước giọt giảm mạnh, nhiên lượng hoạt chất giải phóng thấp so với G3 G4 Phối hợp carbopol HA (G7, G8), đạt thể chất gel mong muốn, khả giải phóng hoạt chất gel giảm so với sử dụng carbopol đơn lẻ (G3, G4) Từ kết khảo sát gel nhũ tương, nhận thấy gel carbopol 0,3 % (G3) đạt thể chất mong muốn, pH phù hợp với dạng thuốc dùng da niêm mạc, cho khả giải phóng hoạt chất cao Vậy đề tài xây dựng công thức gel nhũ tương sau: Rutin nguyên liệu 0,183 g Capryol 90 12,08 g Dầu bơ 8,46 g Isopropyl myristat 3,38 g Propylen glycol 29,5 g Isopropyl alcol 5,0 g α-tocopherol 0,24 g Eucalyptol 0,5 g Tween 80 0,74 g Span 80 2,21 g Carbopol 940 0,3 g Triethanolamin 10 giọt Nước cất vđ 100 g Gel nhũ tương điều chế theo quy trình chi tiết Hình 3.18 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 62 Khuấy Propylen glycol, CNH CAP; dầu bơ IPM; α - tocopherol Rutin Khuấy 80 oC, 10 phút Khuấy đến nguội Hỗn hợp Carbopol 940 Nước cất Khuấy phút Eucalyptol IPA Nước cất Khuấy 350 rpm, 15 phút Gel carbopol % Khuấy 350 rpm Nhũ tương A Triethanolamin Khuấy Gel nhũ tương Hình 3.18 Sơ đồ điều chế gel nhũ tương rutin Điều chế gel carbopol 940: Carbopol phân tán vào 30 g nước cất 15 phút, để để carbopol trương nở hoàn toàn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 Điều chế gel nhũ tương rutin: Cân lượng PG, CNH, pha Dầu theo công thức, khuấy phút, thu hỗn hợp (1) Hòa tan rutin vào hỗn hợp (1), 80 oC, 10 phút, khuấy đến nguội Thêm hỗn hợp IPA - eucalyptol phối trộn sẵn, khuấy phút Thêm lượng nước cất (sau trừ lượng nước dùng để điều chế gel nền), vừa thêm vừa khuấy 350 rpm, 15 phút thu nhũ tương A Thêm lượng gel carbopol % vào nhũ tương A, khuấy đến gel nhũ tương tạo thành hỗn hợp đồng Thêm từ từ dung dịch triethanolamin đến gel đặc lại, pH khoảng 6,8 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 64 Chương BÀN LUẬN Về xây dựng công thức nhũ tương chứa rutin IPA alcol thường sử dụng dạng bào chế dùng da niêm mạc Trong nghiên cứu điều chế gel chứa diclofenac Mohammed, F A (2001), sử dụng IPA nồng độ % khả giải phóng hoạt chất cao sử dụng nồng độ 10 15 %32 Do đó, đề tài cố định nồng độ IPA % tổng cơng thức CNH có chất chất hoạt động bề mặt, phân tử có hai phần: đầu thân nước đuôi kỵ nước Nhờ cấu trúc phân tử này, CNH có khả làm giảm sức căng liên bề mặt pha hệ trì ổn định hệ nhũ tương Sự cân thân nước thân dầu CNH đặc trưng trị số HLB, để nhũ hóa cho kiểu nhũ tương D/N HLB thường nằm khoảng - 18 22 Khi điều chế nhũ tương, pha Dầu cho nhũ tương ổn định với CNH hay hỗn hợp CNH có giá trị HLB định Giá trị HLB gọi HLB tới hạn, ký hiệu RHLB Trong nghiên cứu này, hỗn hợp dầu có giá trị RHLB khoảng 14,5 Theo đó, sử dụng cremophor RH 40 (HLB = 15), cremophor EL 35 (HLB = 15,2), tween 80 (HLB = 15) phù hợp để điều chế nhũ tương Tuy nhiên thực nghiệm, sử dụng riêng CNH này, nhũ tương thu không bền Ngược lại, sử dụng hỗn hợp tween 80 span 80 theo xu hướng tăng tỷ lệ span 80 nhũ tương bền, bền tỷ lệ tween 80 - span 80 1:3 (HLB gần 7) Điều CAP chiếm tỷ lệ lớn pha Dầu, thân CAP có khả nhũ hóa nên ảnh hưởng đến tổng giá trị HLB CNH Trong cơng thức, PG đóng vai trị dung mơi để hịa tan rutin Càng tăng nồng độ PG khả hịa tan rutin tăng, nhiên tăng nồng độ PG cao có nguy gây kích ứng da nhũ tương bền PG polyol, sử dụng nồng độ cao làm tăng phân cực pha Nước, làm nhũ tương khó hình thành ổn định Do đó, khai báo biến độc lập cho mơ hình tối ưu hóa, tỷ lệ PG Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 giới hạn khoảng 20 - 35 % Dữ liệu thực tế cho thấy, bề mặt đáp ứng PG độ bền pha (Hình 3.12), khoảng nồng độ PG cao 30 % độ bền pha giảm Thơng thường, CNH sử dụng nhũ tương với tỷ lệ - % Do rutin có độ tan độ tan rutin tăng nồng độ CNH tăng, nên nghiên cứu lựa chọn khoảng khảo sát nồng độ CNH - %, với kỳ vọng vừa đảm bảo tạo nhũ tương bền, vừa tăng độ tan rutin Độ bền pha thông số thể ổn định nhũ tương Nhũ tương thường có độ bền vật lý tượng kem, kết bơng, kết dính, dẫn đến tách pha Nên độ bền pha lựa chọn làm biến phụ thuộc để khảo sát tối ưu hóa cơng thức Đối với nhũ tương, kích thước giọt đóng vai trị quan trọng việc đưa thuốc thấm sâu vào da Trong giai đoạn khảo sát, nghiên cứu thực đánh giá kích thước giọt trung bình 15 nhũ tương mơ hình tối ưu hóa thực nghiệm Kích thước giọt có khác cơng thức, nhiên tất nhũ tương khảo sát có kích thước giọt trung bình 10 µm, nằm khoảng kích thước giọt bình thường nhũ tương (0,1 - 100 µm 10) Vì khơng đưa kích thước giọt vào thiết kế tối ưu hóa Về xây dựng cơng thức quy trình điều chế gel nhũ tương chứa rutin Khả giải phóng hoạt chất qua màng cellulose acetat gel poloxamer thấp Nguyên nhân cấu trúc gel poloxamer Ở nhiệt độ thấp - oC, phân tử poloxamer bao quanh lớp hydrat hóa, nên thể chất lỏng, tăng nhiệt độ gây đứt gãy liên kết hydro dung môi chuỗi ưa nước polyme Q trình có lợi cho tương tác kỵ nước đuôi kỵ nước chuỗi polyme hình thành micelle Sự gia tăng nhiệt độ làm cho micelle xếp lại thành cấu trúc hình khối sau tạo thành cấu trúc lục giác, tạo gel có cấu trúc vững 38 Các giọt nhũ tương giữ lại cấu trúc tạo micelle này, kích thước giọt gel nhũ tương giảm mạnh, hoạt chất khó giải phóng khỏi dạng thuốc Vì vậy, gel poloxamer có tiềm để áp dụng cho Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 thuốc phóng thích chậm, kéo dài Ricci, E J cộng nghiên cứu thuốc tiêm lidocain có bổ sung thêm poloxamer 407, kết cho thấy sử dụng gel poloxmer 407 kéo dài thời gian lưu lidocain chỗ tiêm, trì giải phóng thuốc tăng hiệu điều trị43 Với carbopol, carbopol 940 phân tán, có pH acid (do carbopol có chất polyacrylic acid) Ở pH acid, carbopol tồn dạng dung dịch cao phân tử lỏng lẻo, trung hòa chất kiềm hình thành ma trận liên kết, tạo thành khối gel 39 Carbopol có khả tạo gel nồng độ nhỏ từ 0,1 % nên khả giải phóng hoạt chất cao HA có tác dụng làm ẩm da, tương thích sinh học với da, nên xu hướng kết hợp thêm HA nhằm mục đích lợi dụng HA để tăng hydrat hóa lớp sừng, làm tăng tính thấm qua da hoạt chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 67 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu, đề tài đạt kết sau: Mục tiêu 1: Đề tài lựa chọn thành phần tỷ lệ tá dược đưa vào công thức nhũ tương sau: Pha Dầu: CAP - dầu bơ - IPM - α - tocopherol (50:35:14:1) Pha Nước: PG, hỗn hợp eucalyptol - IPA, nước cất CNH: Hỗn hợp tween 80 - span 80 (1:3) Công thức nhũ tương tối ưu hóa với hỗ trợ phần mềm Design Expert v12.0, với biến độc lập tỷ lệ pha Dầu, tỷ lệ CNH tỷ lệ PG; biến phụ thuộc độ bền pha lượng hoạt chất giải phóng qua màng cellulose acetat sau Công thức nhũ tương xây dựng sau: Rutin nguyên liệu 0,183 g Capryol 90 12,08 g Dầu bơ 8,46 g Isopropyl myristat 3,38 g Propylen glycol 29,51 g Isopropyl alcol 5,0 g α-tocopherol 0,24 g Eucalyptol 0,5 g Tween 80 0,74 g Span 80 2,21 g Nước cất vđ100 g Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 Nhũ tương thu có nồng độ rutin 0,15 %, độ bền pha 8,5 khả giải phóng hoạt chất qua màng cellulose acetat sau 203,5 ± 4,45 µg/cm2, pH khoảng 6,8, kích thước giọt trung bình 4,41 ± 0,047 µm Mục tiêu 2: Đề tài khảo sát tá dược tạo gel poloxamer 407, carbopol 940, HA với tỷ lệ khác Lựa chọn công thức gel nhũ tương rutin sử dụng chất tạo gel carbopol với tỷ lệ 0,3 % Xây dựng quy trình điều chế gel nhũ tương chứa rutin Gel nhũ tương rutin chứa 0,15 % rutin, có màu trắng đục vàng nhạt, thể chất mềm mịn, pH khoảng 6,55, kích thước giọt trung bình 9,37 ± 0,229 µm, khả giải phóng hoạt chất qua màng cellulose acetat sau 6h 144,3 ± 3,21 µg/cm2 Quy trình định lượng gel nhũ tương chứa rutin phương pháp HPLC thẩm định đầy đủ Vậy đề tài xây dựng công thức gel nhũ tương sau: Rutin nguyên liệu 0,183 g Capryol 90 12,08 g Dầu bơ 8,46 g Isopropyl myristat 3,38 g Propylen glycol 29,5 g Isopropyl alcol 5,0 g α-tocopherol 0,24 g Eucalyptol 0,5 g Tween 80 0,74 g Span 80 2,21 g Carbopol 940 0,3 g Triethanolamin 10 giọt Nước cất vđ 100 g Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 Gel nhũ tương điều chế theo quy trình sau: Khuấy Propylen glycol, CNH CAP; dầu bơ IPM; α - tocopherol Rutin Khuấy 80 oC, 10 phút Khuấy đến nguội Hỗn hợp Carbopol 940 Nước cất Khuấy phút Eucalyptol IPA Nước cất Khuấy 350 rpm, 15 phút Gel carbopol % Khuấy 350 rpm Nhũ tương A Triethanolamin Khuấy Gel nhũ tương Kiến nghị - Đánh giá tính thấm rutin gel nhũ tương qua màng sinh học - Theo dõi độ ổn định gel nhũ tương rutin Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Ganeshpurkar A & Saluja, A, K, (2017), “The Pharmacological Potential of Rutin”,Saudi Pharmaceutical Journal, Vol.25(2), pp.149 - 164 Netaji t Nitrue et al (2014), “Anti-hyperglycemic activity of Rutin in streptozotocin-induced diabetic rats: An effect mediated through cytokines, antioxidants and lipid biomarkers”, Indian Journal of Experimental Biology IJEB, Vol, 52 (7), pp.720-727 Ki-SeokChoi et al (2014), “Rutin inhibits UVB radiation-induced expression of COX-2 and iNOS in hairless mouse skin: MAP kinase and JNK as potential targets”, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol.559, pp.38-45 Shrestha Sharma et al (2013), "Rutin: therapeutic potential and recent advances in drug delivery", Expert Opinion on Invesigational Drugs, Vol.22 (8), pp.1063-1079 Gianni Belcaro et al, (2008), “O-(beta-hydroxyethyl)-rutosides systemic and local treatment in chronic venous disease and microangiopathy: an independent prospective comparative study”, Angiology, Vol, 59, DOI: 10,1177/0003319707312021 Trần Thị Hải Yến, Hoàng Thị Hiền, Vũ Thị Thu Giang (2020), “Nghiên cứu bào chế nano niosome mang rutin dịch chiết gel lơ hội”, Tạp chí khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, tập 36 (1), tr,46-54 A S Panwar et al (2011), “Emulgel: A review”, Asian Journal of Pharmacy and Life Science, Vol.1 (3), pp.333-343 Shaik Shaheda Sultana et al (2014), “Emulgel – A Novel Surrogate Appraoch for Transdermal Drug Delivery System”, Indo American Journal of Pharmaceutical Research, Vol.4 (11), pp.1462-1477 Sonam Vats et al (2014), “Emulsion Based Gel Technique: Novel Approach for Enhancing Topical Drug Delivery of Hydrophobic Drugs”, International Journal for Pharmaceutical Research Scholars, Vol.3 (2), pp.649-650 ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 10 McClements, D J (2010), “Emulsion Design to Improve the Delivery of Functional Lipophilic Components”, Annual Review of Food Science and Technology, vol.1(1), pp.241–269 11 Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, Tập 1, NXB Y học, Hà Nội, pp,375-379, 12 Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Tập, 1, NXB Y học, Hà Nội, tr.848851 13 Ilyes Dammak, Paulo Jose do, Amaral Sobral (2018), “Investigation into the physicochemical stability and rheological properties of rutin emulsions stabilized by chitosan and lecithin”, Journal of Food Engineering, Vol.229, pp.12–20 14 Q, Wang et al, (2017), “Oil-in-oil-in water pre-double emulsions stabilized by nonionic surfactants and silica particles: A new approach for topical application of rutin”, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfa.2017.02.067 15 Sung Min Pyo et al (2016), “Rutin - Increased Antioxidant Activity and Skin Penetration by Nanocrystal Technology (smartCrystals)”, Cosmetics 2016, Vol.3(9), doi:10,3390/cosmetics3010009 16 Yuangang Zu, Chunying Li, Yujie Fu, Chunjian Zhao (2006), “Simultaneous determination of catechin, rutin, quercetin kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L,) leaves”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol.46, pp.714 -719 17 Malay K Das, Bhupen Kalita (2014), “Design and Evaluation of PhytoPhospholipid Complexes (Phytosomes) of Rutin for Transdermal Application”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, Vol.4(10), pp.51-57 18 Bhupen Kalita, Malay K, Das (2017), “Rutin–phospholipid complex in polymer matrix for long-term delivery of rutin via skin for the treatment of inflammatory diseases”, Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, Vol.46 (1), pp.41–56 ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 19 Azar Kajbafvala & Alireza Salabat (2021), “Microemulsion and microemulsion gel formulation for transdermal delivery of rutin: Optimization, invitro/ex-vivo evaluation and SPF determination”, Journal of Dispersion Science and Technology, doi:10,1080/01932691,2021,1880928 20 Iulia Pinzaru et al (2021), “Proniosomal Gel for Topical Delivery of Rutin: Preparation, Physicochemical Characterization and In Vitro Toxicological Profile Using 3D Reconstructed Human Epidermis Tissue and 2D Cells”, Antioxidants, Vol.10, pp.85 21 Rabab Kamel, Mona Basha (2013), “Preparation and in – vitro evaluation of rutin nanostructured liquisolid delivery system”, Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University, Vol.51, pp.261-272, 22 Bộ môn Bào chế (2010), Bào chế sinh dược học tập 2, NXB Y học, TP.HCM, tr.21-22, tr.85-86, tr 48-50 23 Dragicevic N, Atkinson J P & Maibach H I (2015), “Percutaneous Penetration Enhancers Chemical Methods in Penetration Enhancement”, Springer, Verlag Berlin Heidelberg, pp.13-24 24 Nimisha Roy et al (2017), “Review article on permeation enhancers: a major breakthrough in drug delivery technology”, Intenational Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, Vol.8(3), pp.1001-1011 25 Güngör, S ; Bergişadi, N (2004), “Effect of penetration enhancers on in vitro percutaneous penetration of nimesulide through rat skin”, Die Pharmazie - An International Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.59 (1), pp 39-41 26 PankajKarande, SamirMitragotri (2009), “Enhancement of transdermal drug delivery via synergistic action of chemicals”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, Vol.1788 (11), pp.2362-2373 27 Monica R P Rao , Shital Aghav , Girish Sukre & Manmeet Kumar (2014) Determination of Required HLB of Capryol 90, Journal of Dispersion Science and Technology, vol.35(2), pp.161-167 ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 28 Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Slian C Owen (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, fifth edition, pp.348, 549-553, 675-678, 517-52, 346-347, 592-593 29 Arellano, A et al (1999), “Influence of propylene glycol and isopropyl myristate on the in vitro percutaneous penetration of diclofenac sodium from carbopol gels”, European Journal of Pharmaceutical Sciences, vol.7(2), pp.129–135 doi:10.1016/s0928-0987(98)00010-4 30 Seppanen, C M., Song, Q., & Saari Csallany, A (2010), “The Antioxidant Functions of Tocopherol and Tocotrienol Homologues in Oils, Fats, and Food Systems”, Journal of the American Oil Chemists’ Society, vol.87(5), pp.469– 481 31 Logsdon, J E., & Loke, R A (2000), “Isopropyl Alcohol”, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology 32 Mohammed, F A (2001), “Topical Permeation Characteristics of Diclofenac Sodium from NaCMC Gels in Comparison with Conventional Gel Formulations”, Drug Development and Industrial Pharmacy, vol.27(10), pp.1083-1097 33 Schürmann M et al (2019), “The Therapeutic Effect of 1,8-Cineol on Pathogenic Bacteria Species Present in Chronic Rhinosinusitis”, Front Microbiol, Vol.10, pp.2325 doi: 10.3389/fmicb.2019.02325 34 Juergens, U (2014), “Anti-inflammatory Properties of the Monoterpene 1.8cineole: Current Evidence for Co-medication in Inflammatory Airway Diseases”, Drug Research, Vol.64(12), pp.638–646 doi:10.1055/s-00341372609 35 Gao, S., & Singh, J (1998), “In vitro percutaneous absorption enhancement of a lipophilic drug tamoxifen by terpenes”, Journal of Controlled Release, Vol.51(2-3), pp.193–199 doi:10.1016/s0168-3659(97)00168-5 ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 36 Gao, S., & Singh, J (1997), “Mechanism of transdermal transport of 5-fluorouracil by terpenes: carvone, 1,8-cineole and thymol”, International Journal of Pharmaceutics, Vol.154(1), pp 67–77 37 Williams, A C., & Barry, B W (2012), “Penetration enhancers”, Advanced Drug Delivery Reviews, vol.64, pp.128–137 doi:10.1016/j.addr.2012.09.032 38 Chen, Y Et al ( 2021), “An Overview onThermosensitive Oral Gel Based on Poloxamer 407”, Materials 2021, vol.14, pp.4522 39 Safitri, Fenny & Nawangsari, Desy & Febrina, Dina (2021), “Overview: Application of Carbopol 940 in Gel”, Advances in Health Sciences Research, vol.34 40 Zhu, J et al (2020), “Applications and Delivery Mechanisms of Hyaluronic Acid used for Topical/Transdermal Delivery - A review”, International Journal of Pharmaceutics, pp.119127 41 Lê Hậu, Lê Thị Thu Vân, Lê Minh Quân, Trần Văn Thành (2021), Thử nghiệm hòa tan nghiên cứu phát triển sản xuất dược phẩm, NXB Y học, tr.216–228 42 OECD (1995), “Guidelines for Testing of Chemicals Partition: Coefficient (n-octanol/water): Shake Flask Method”, OECD Environment Monograph No.76 43 Ricci, E et al (2005), “Sustained release of lidocaine from Poloxamer 407 gels”, International Journal of Pharmaceutics, vol.288(2), pp.235–244 ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-1 PHỤ LỤC Phụ lục Dải phân bố kích thước giọt nhũ tương trắng Hình 1.1 Nhũ tương trắng Hình 1.2 Nhũ tương trắng ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-2 Hình 1.3 Nhũ tương trắng Hình 1.4 Nhũ tương trắng ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-3 Hình 1.5 Nhũ tương trắng Hình 1.6 Nhũ tương trắng ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-4 Hình 1.7 Nhũ tương trắng Hình 1.8 Nhũ tương trắng ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-5 Hình 1.9 Nhũ tương trắng Hình 1.10 Nhũ tương trắng 10 ` Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-6 Hình 1.11 Nhũ tương trắng 11 Hình 1.12 Nhũ tương trắng 12 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-7 Hình 1.13 Nhũ tương trắng 13 Hình 1.14 Nhũ tương trắng 14 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-8 Hình 1.15 Nhũ tương trắng 15 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-9 Phụ lục Dải phân bố kích thước giọt nhũ tương chứa rutin Hình 2.1 Nhũ tương rutin Hình 2.2 Nhũ tương rutin ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-10 Hình 2.3 Nhũ tương rutin Hình 2.4 Nhũ tương rutin ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-11 Hình 2.5 Nhũ tương rutin Hình 2.6 Nhũ tương rutin ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12 Hình 2.7 Nhũ tương rutin Hình 2.8 Nhũ tương rutin ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13 Hình 2.9 Nhũ tương rutin Hình 2.10 Nhũ tương rutin 10 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-14 Hình 2.11 Nhũ tương rutin 11 Hình 2.12 Nhũ tương rutin 12 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-15 Hình 2.13 Nhũ tương rutin 13 Hình 2.14 Nhũ tương rutin 14 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-16 Hình 2.15 Nhũ tương rutin 15 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-17 Phụ lục Dải phân bố kích thước giọt nhũ tương tối ưu ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-18 Phụ lục Dải phân bố kích thước giọt gel nhũ tương rutin Hình 4.1 Gel G1 - poloxamer % Hình 4.2 Gel G2 - poloxamer % ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-19 Hình 4.3 Gel G3 – carbopol 0,3 % Hình 4.4 Gel G4 – carbopol 0,2 % ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-20 Hình 4.5 Gel G5 – poloxamer % kết hợp carbopol 0,1 % Hình 4.6 Gel G6 – poloxamer % kết hợp carbopol 0,2 % ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-21 Hình 4.7 Gel G7 – carbopol 0,3 % phối hợp HA 0,2 Hình 4.8 Gel G8 – carbopol 0,2 % phối hợp HA 0,2 ` Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn