Nghiên cứu bào chế gel liposome chứa cao toàn phần rau má

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐÀO TIẾN TRUNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL LIPOSOME CHỨA CAO TOÀN PHẦN RAU MÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐÀO TIẾN TRUNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL LIPOSOME CHỨA CAO TOÀN PHẦN RAU MÁ NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN THÀNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ Y TẾ iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn đề tài “Nghiên cứu bào chế gel liposome chứa cao toàn phần Rau má” cơng trình nghiên cứu cá nhân thời gian qua Mọi số liệu sử dụng luận văn kết nghiên cứu tơi tự tìm hiểu, phân tích cách khách quan, trung thực, có nguồn gốc rõ ràng chưa cơng bố hình thức Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm có khơng trung thực thơng tin sử dụng cơng trình nghiên cứu Tác giả Đào Tiến Trung iv LỜI CÁM ƠN Luận văn “Nghiên cứu bào chế gel liposome chứa cao toàn phần Rau má” thực từ tháng 03/2022 đến tháng 10/2022 môn Bào chế, Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, hướng dẫn PGS TS Trần Văn Thành Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, nhận nhiều hỗ trợ từ Thầy Cô, đồng nghiệp gia đình Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Trần Văn Thành Thầy quan tâm, bảo ân cần truyền đạt cho nhiều kiến thức kinh nghiệm thực hành phịng thí nghiệm Dưới hướng dẫn tận tình Thầy, tơi hồn thành tốt Luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện cho sử dụng thiết bị để phục vụ cho đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln nguồn động viên lớn cho suốt thời gian vừa qua, cảm ơn Anh Chị đồng nghiệp làm đề tài Thạc sĩ bạn cựu sinh viên sinh viên đã, làm khóa luận Bộ mơn Bào chế ln quan tâm giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Chúc Anh Chị bạn đạt kết tốt nghiệp mong đợi thành cơng tương lai Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2022 Đào Tiến Trung v MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình vẽ, sơ đồ, đồ thị x Đặt vấn đề Chương Tổng quan tài liệu .3 1.1 Tổng quan Rau má 1.2 Vết thương da .10 1.3 Tổng quan liposome 12 1.4 Tổng quan gel 22 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 2.2 Nguyên liệu thiết bị .30 2.3 Bào chế đánh giá cao toàn phần Rau má (Ctp-RM) .32 2.4 Bào chế đánh giá liposome chứa Ctp-RM 40 2.5 Bào chế đánh giá gel mang liposome chứa Ctp-RM 43 Chương Kết bàn luận .48 3.1 Bào chế đánh giá Ctp-RM .48 3.2 Bào chế đánh giá liposome chứa Ctp-RM 60 3.3 Bào chế đánh giá gel mang liposome chứa Ctp-RM 64 Chương Bàn luận 71 4.1 Bào chế Ctp-RM 71 4.2 Khảo sát công thức bào chế liposome trắng 73 4.3 Bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM .76 4.4 Bào chế gel mang liposome chứa Ctp-RM 77 Chương Kết luận đề nghị 80 5.1 Kết luận 80 5.2 Đề nghị .81 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACC Hội đồng mỹ phẩm ASEAN Hiệp hội nhà hố học phân tích thống Đơn vị tạo khóm CFU ASEAN Cosmetic Committee Association of official analytical chemists Colony forming unit CMC Carboxymethyl cellulose CMC Critical micelle concentration Nồng độ micelle tới hạn CPP Critical packing parameter Thông số đóng gói tới hạn AOAC Ctp-Rm Da Cao tồn phần Rau má Dalton DĐVN Dược điển Việt Nam (2017) DLPC Dilauroyl phosphatidylcholine DLS Dynamic light scattering DMPC Dimyristoyl phosphatidylcholine Dimyristoyl phosphatidylethanolamin Deoxyribonucleic acid DMPE DNA DOPC DOPE DPPC DPPE DSPC Dioleoyl phosphatidylcholine Dioleoyl phosphatidylethanolamin Dipalmitoyl phosphatidylcholine Dipalmitoyl phosphatidylethanolamin Distearoyl phosphatidylcholine ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid GUV Giant unilamellar vesicle HPC Hydroxypropyl cellulose High performance liquid chromatography Hydroxypropylmethyl cellulose Hydrogenated soy phosphatidyl choline HPLC HPMC HSPC Tán xạ ánh sáng động Thể đơn lớp khổng lồ Sắc ký lỏng hiệu cao Phosphatidyl cholin đậu nành hydro hoá vii Từ viết tắt Từ nguyên IPM ISO ITO Isopropyl myristate International organization for standardization Iridium-tin oxide KTTP Nghĩa tiếng Việt Tổ chức tiêu chuẩn hoá quốc tế Oxyd iridium-kẽm Kích thước tiểu phân LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng LUV Large unilamellar vesicle Thể đơn lớp lớn MLV Multi-lamellar vesicle Thể đa lớp (>10) đồng trục MVV Multivesicular vescicle Thể đa khoang MWCO Molecular weight cut-off Giới hạn kích thước phân tử NF National formulary Dược thư quốc gia OLV Oligo-lamellar vesicle Thể đa lớp (2-10) đồng trục PDI Polydispersity index Chỉ số đa phân tán PEG Poly(ethylene glycol) RES Reticuloendothelial system Hệ võng nội mơ RPM Round per minute Vịng/phút RRT Relative retention rime Thời gian lưu tương tối RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCF Super critical fluid Chất lỏng siêu tới hạn SPC Soy phosphatidyl choline Phosphatidyl cholin đậu nành SUV Small unilamellar vesicle Thể đơn lớp nhỏ TCCS Tiêu chuẩn sở TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TECA TEM TTFCA USP Titrated extract of Centella asiatica Transmission electron microscopes Total triterpenoid fraction of Centella asiatica United States Pharmacopeia Cao Rau má tiêu chuẩn hố Kính hiển vi điện tử truyền qua Phân đoạn saponin toàn phần Rau má Dược điển Hoa Kỳ viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Chiết xuất Rau má phương pháp ngấm kiệt Bảng 1.2 Chiết xuất Rau má phương pháp Soxhlet Bảng 1.3 Chiết xuất Rau má phương pháp chưng cất Bảng 1.4 Chiết xuất Rau má phương pháp hỗ trợ với siêu âm Bảng 1.5 Chiết xuất Rau má phương pháp hỗ trợ với vi sóng Bảng 1.6 Một số thơng tin phospholipid dùng bào chế liposome 17 Bảng 3.1 Nguyên liệu, hoá chất dùng bào chế đánh giá Ctp-RM 30 Bảng 3.2 Thiết bị bào chế đánh giá Ctp-RM 30 Bảng 3.3 Nguyên liệu bào chế đánh giá gel liposome chứa Ctp-RM .31 Bảng 3.4 Thiết bị bào chế đánh giá gel liposome chứa Ctp-RM 32 Bảng 3.5 Chuẩn bị dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính 38 Bảng 3.6 Công thức bào chế pha dung môi hữu – Lô .41 Bảng 3.7 Công thức bào chế pha dung môi hữu – Lô .41 Bảng 3.8 Công thức bào chế pha dung môi hữu – Lô .41 Bảng 3.9 Công thức gel natri CMC (gel N) .44 Bảng 3.10 Công thức gel carbomer-lecithin copolymer (gel L) 44 Bảng 3.11 Công thức gel gôm Gellan (gel K) 44 Bảng 3.12 Công thức gel poloxamer 188 (gel P) .44 Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm bột dược liệu Rau má 49 Bảng 3.2 Kết định lượng sơ hàm lượng saponin mẫu dịch chiết 51 Bảng 3.3 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống .53 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính tuyến tính 54 Bảng 3.5 Đánh giá ý nghĩa phương trình hồi quy (! = 0,05) 54 Bảng 3.6 Đánh giá ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy (! = 0,05) 55 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ lặp lại .55 Bảng 3.8 Kết định lượng mẫu đối chiếu ngày (D2) .56 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ xác trung gian 56 Bảng 3.10 Kết so sánh độ xác hàm lượng asiaticosid (! = 0,05) 56 ix Bảng 3.11 Kết khảo sát độ .57 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ 57 Bảng 3.13 Kết đánh giá PDI zeta mẫu liposome trắng 60 Bảng 3.14 Công thức bào chế pha dung môi hữu 60 Bảng 3.15 Kết PDI zeta mẫu liposome chứa Ctp-Rm 62 Bảng 3.16 Khả tải hoạt chất mẫu liposome .62 Bảng 3.17 Công thức bào chế 100 g gel liposome chứa Ctp-RM 65 Bảng 3.18 Kết đánh giá độ dàn mỏng gel liposome 66 Bảng 3.19 Kết đánh giá pH gel liposome 67 Bảng 3.20 Kết đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro .68 Bảng 3.21 Giá trị p (! = 0,05) Qt gel liposome thời điểm 69 Bảng 4.1 Một số điều kiện chiết xuất Rau má phương pháp ngấm kiệt 71 x DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các saponin triterpen Rau má Hình 1.2 Cấu trúc số liposome 12 Hình 1.3 Cấu trúc da từ vào 14 Hình 1.4 Đường thấm thuốc qua da số trị liệu thích hợp 15 Hình 1.5 Cấu trúc (A) acid phosphatidic (B) glycerophospholipid .16 Hình 1.6 Cấu trúc sphingophospholipid 16 Hình 1.7 Cấu trúc (A) cholesterol (B) oleoyl ester cholesterol .18 Hình 2.8 Cấu trúc loại thiết bị xác định khả giải phóng hoạt chất 28 Hình 3.1 Cảm quan bột dược liệu Rau má sấy lạnh 48 Hình 3.2 Các cấu tử bột dược liệu Rau má 48 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn C (mẫu TECA) mẫu thử T (Dược liệu) 49 Hình 3.4 Sắc ký đồ phân đoạn 1, 5, 10, 15, 20 chiết xuất bột Rau má .50 Hình 3.5 Sắc ký đồ phân đoạn 10-15 chiết xuất bột Rau má 51 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 52 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu thử 52 Hình 3.8 Kết xây dựng phương trình hồi quy 54 Hình 3.9 Các sắc ký đồ dung dịch T4 .58 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng (Methanol) 58 Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch B6 59 Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch C8 59 Hình 3.13 Lưu đồ bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM 61 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu placebo (giá mang 1B.05.60.30) .62 Hình 3.15 Phân bố KTTP bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM 63 Hình 3.16 Lưu đồ bào chế gel liposome chứa Ctp-RM 65 Hình 3.17 Khả phóng thích hoạt chất in vitro gel liposome 67 Hình 4.1 Kết khảo sát liposome trắng theo hàm lượng phospholipid 74 Hình 4.2 Kết khảo sát liposome trắng theo tỉ lệ PL cholesterol 74 Hình 4.3 Kết khảo sát liposome trắng theo thể tích tiêm mẫu 75 xi Hình 4.4 Kết khảo sát liposome trắng theo nhiệt độ đồng hố 75 Hình 4.5 Kết khảo sát liposome trắng theo thời gian khuấy trộn .76 xii TÓM TẮT Luận văn Thạc sĩ dược học – Khóa: 2020 – 2022 Đề tài: “Nghiên cứu bào chế gel liposome chứa cao toàn phần Rau má” Học viên: Đào Tiến Trung Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trần Văn Thành MỞ ĐẦU Các saponin triterpenoid (asiaticosid, madecassosid, acid asiatic, acid madecassic) Rau má (Centella asiatica (L.) Urb Apiaceae) giúp tái tạo mô liên kết, tăng tổng hợp fibronectin collagen loại I, làm nhanh chóng lên da non, làm lành vết thương Mục tiêu đề tài nghiên cứu chiết xuất đánh giá cao toàn phần Rau má, tải hoạt chất vào liposome bào chế gel bôi da ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đánh giá bột dược liệu Rau má theo DĐVN V Dược điển Châu Âu 10 - Khảo sát quy trình chiết xuất saponin tồn phần từ bột dược liệu - Xây dựng quy trình định lượng asiaticosid cao toàn phần Rau má phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao toàn phần Rau má thể chất cao đặc - Khảo sát xây dựng công thức gel bôi da đánh giá tính chất gel (cảm quan, độ đồng nhất, độ dàn mỏng, pH, khả giải phóng hoạt chất in vitro) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kiểm nghiệm bột dược liệu Rau má theo tiêu chuẩn Dược điển để sử dụng Xây dựng thẩm định quy trình định lượng asiaticosid cao tồn phần Rau má phương pháp HPLC Cao toàn phần chiết xuất với ethanol 70% (tt/tt) kiềm hoá phương pháp ngấm kiệt, tỷ lệ dược liệu dung mơi 1:15 Cao tồn phần Rau má có hàm lượng asiaticosid trung bình 4,26% (kl/kl) Khảo sát quy trình tạo liposome phương pháp tiêm ether với tỷ lệ xiii khối lượng phospholipid : cholesterol 80:20, chất nhũ hoá Tween 20 sử dụng với tỷ lệ 0,5% (kl/tt) pha hữu Phối hợp pha hữu vào pha nước với tỷ lệ 1:10 thể tích máy khuấy từ tốc độ 500 RPM, nhiệt độ 45 ℃ 30 phút Hệ phân tán liposome thu có kích thước giọt trung bình 422,8 nm, số đa phân tán 0,473, zeta trung bình -11,03 mV Cơng thức gel liposome chứa cao toàn phần Rau má tương đương 1% (kl/kl) TECA 3% (kl/kl) tá dược tạo gel L có độ dàn mỏng 30,18 cm2 ; pH = 6,01 có khả giải phóng hoạt chất điều kiện thử nghiệm KẾT LUẬN Bằng phương pháp ngấm kiệt, chiết xuất saponin toàn phần Rau má với ethanol 70% (tt/tt) kiềm hoá, tỷ lệ dược liệu dung mơi 1:15 Bào chế cao tồn phần Rau má chất đặc quánh, màu nâu đen, có mùi thơm đặc trưng dược liệu với hàm lượng asiaticosid trung bình 4,26% (kl/kl) Khảo sát quy trình tạo liposome thu hệ phân tán có kích thước giọt trung bình 422,8 nm với PDI 0,473 Bào chế thành công gel liposome chứa 0,39% (kl/kl) asiaticosid dạng cao tồn phần Rau má có tính chất phù hợp cho chế phẩm bơi da tiềm TỪ KHÓA Làm lành vết thương, asiaticosid, liposome, hydrogel, Centella asiatica xiv ABSTRACT Master thesis in Pharmacy – Academic course: 2020 - 2022 “Preparation of topical liposomal gel contains Centella asiatica extract” By Tien Trung, DAO Supervisor: Assoc Prof Dr Van Thanh, TRAN INTRODUCTION The saponin triterpenoids (asiaticoside, madecassoside, asiatic acid, madecassic acid) found in hydrocotyle (Centella asiatica (L.) Urb., Apiaceae) or pennywort, have been proved to increase the synthesis of fibronectin and type I collagen, therefore it can accelerate the process of wound’s healing This study was to figure out how to extract total saponins from the plant and evaluate the encapsulation efficiency of “Centella asiatica total extraction” into liposome particles to prepare a topical gel MATERIALS AND METHODS - Evaluate Centella asiatica powder, based on Vietnamese Pharmacopoeia V - Study on the extraction process of total saponins from Centella asiatica powder - Establish and validate the quantitative procedure for asiaticoside of Centella asiatica by HPLC, as the first step to building the standard for Centella asiatica total extract - Prepare the topical hydrogel and evaluate the product in some following criterias: homogenity, spreadability, acidity, in vitro drug release’s ability) RESULTS AND DISCUSSION Raw herbal powder meets the Pharmacopeia’s standards prior to be used The herbal was extracted with alkalined ethanol 70% (v/v) by maceration method at room temparature, with a ratio of 1:15 between raw material and solvent Performed and validated the quantitative procedure for asiaticoside in Centella asiatica total extract by HPLC Asiaticoside’s average content in the extract is 4,26% (w/w) Prepared the xv liposomal dispersion by ether injection method, the ratito between phospholipid and cholesterol is 80:20 (w/w), Tween 20 was used at 0,5% (w/v) in the ether phase as emulsifier The homogenzation is performed with the ratio 1:10 between the ether phase and the water phase, on an 500 RPM magnetic stirrer at 45 ℃ in 30 minutes The vesicles have an average diameter of 422,8 nm, determined by DLS method with the polydispersity index (PDI) at 0,473 and an average zeta potential is -11,03 mV The most prefered liposomal gel contains Centella asiatica total extract equals 0,39% (w/w) asiaticosid with gelling agent (Gel L) was used at 3% (w/w) The product’s spreadability is 30,18 cm2, pH = 6,01 (25 ℃) and has the ability to release asiaticoside through a cellulose acetate 0,45 "m pore-size membrane, under test’s circumstances CONCLUSIONS By maceration method, the extraction of total saponins in Centella asiatica powder is performed with alkalined ethanol 70% (v/v) and the raw material-solvent ratio is 1:15 The extract’s asiaticoside average content is 4,26% (w/w) Hydrogel formulation containing total extract equals 0,39% (w/w) asiaticosid and 3% (w/w) gelling agent Gel L, has been proven to be a potential topical gel KEYWORDS Wound healing, asiaticoside, hydrogel, liposome, Centella asiatica ĐẶT VẤN ĐỀ Rau má có tên khoa học Centella asiatica (L.) Urb., thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), gọi Tinh tuyết thảo Theo kinh nghiệm Y học cổ truyền, Rau má có vị đắng cay, tính hàn, quy vào kinh Can, Tỳ, Thận có cơng dụng nhiệt lợi thấp, tiêu thũng giải độc Trong Rau má đáng ý saponin triterpen nhóm ursan với chất quan trọng asiaticosid, ngồi cịn có số saponin nhóm olean nhóm lupan với hàm lượng thấp, số flavonoid mà chủ yếu glycosid kaempferol, carotenoid, alkaloid (hydrocotylin), vitamin, tinh dầu 1,3 Các cơng trình nghiên cứu cịn cho thấy Rau má có cơng dụng bảo vệ thần kinh, chống loét dày, cải thiện trí nhớ làm chậm lão hoá Các saponin triterpen Rau má có khả tăng cường tổng hợp collagen I fibronectin nên Rau má có đặc tính làm lành vết thương, vết loét, vết phỏng, làm mau lành sẹo, làm mờ sẹo Cao Rau má chuẩn hoá thường dùng sản xuất kem dưỡng da, trị mụn, lở loét với hàm lượng từ 0,2-2% (kl/kl) 1,4,5 Trong phân tử glycosid, aglycon phần định tác dụng dược lý có nhược điểm bền nên chế phẩm bào chế từ dược liệu thường dùng cao toàn phần phân đoạn chiết xuất để thay Asiatiacosid có phân tử khối lớn (959,12 Da) nên khó thấm qua da, cần đưa vào dạng bào chế liposome để vận chuyển qua cấu trúc da Để sử dụng da niêm mạc, liposome cần đưa vào hệ mang thuốc dạng bào chế bán rắn để làm tăng khả bám dính kéo dài thời gian lưu thuốc da 7-9 Hiện Việt Nam, chưa có chế phẩm chứa thành phần cao Rau má tiêu chuẩn hoá (TECA) phân đoạn triterpen toàn phần Rau má (TTFCA) mà chứa chiết xuất Rau má Các nguyên liệu kiểm nghiệm theo TCCS DĐVN (2017) chưa có chuyên luận cao Rau má Dược điển Hoa kỳ 2020 có chun luận cao khơ Rau má Với mong muốn góp phần nghiên cứu sản phẩm chứa thành phần từ Rau má với cơng nghệ bào chế liposome qua phát triển sản phẩm từ dược liệu nước, đồng thời góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, thực đề tài: “Nghiên cứu bào chế gel liposome chứa cao toàn phần Rau má” với mục tiêu sau: Nghiên cứu chiết xuất khảo sát tính chất cao tồn phần Rau má (Ctp-RM) Xây dựng công thức bào chế đánh giá tính chất liposome chứa Ctp-RM Xây dựng cơng thức bào chế đánh giá tính chất gel liposome chứa Ctp-RM CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY RAU MÁ 1.1.1 Phân loại thực vật Rau má tồn tươi khơ (Herba Centellae asiaticae) Rau má (Centella asiatica (L.) Urb.), thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), gọi Tinh tuyết thảo Vị trí Rau má hệ thống phân loại thực vật A Takhtajan (2009) 10 Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cúc (Asteridae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Hoa tán (Apiaceae) Chi Centella L Lồi Centella asiatica (L.) Urb 1.1.2 Mơ tả thực vật Dạng sống cỏ bò, thân non màu tía nhạt, thân già màu tía đậm hơn, có lơng trắng khía dọc nhỏ; có nhiều mấu, mấu phát triển thành Lá đơn, mọc so le nhiều tập trung mấu, kèm Phiến hình thận, mép khía tai bèo, dài 4-6 cm, rộng 2,5-3,5 cm, màu xanh, mặt đậm Gân kiểu chân vịt, 6-8 gân rõ mặt Cuống màu xanh, hình trụ dài 8-13 cm, có rãnh dọc mặt tạo hình lịng máng, rỗng bên có lơng Bẹ dài 7-14 mm, có gân dọc màu xanh, mặt màu trắng, mặt ngồi tím Rễ chùm, màu trắng vàng Cụm hoa tán đơn gồm hoa mọc trục phát hoa hình trụ, dài 5-13 mm, màu xanh tím, đậm gốc, có nhiều lơng trắng mịn, mảnh Tán có bắc, hình trứng nhọn, dài 3-5 mm, rộng 2-3 mm, màu xanh, có sọc tía, đậm gốc lá, có lơng mịn tồn Hoa đều, lưỡng tính, mẫu Đế hoa lồi, màu xanh nhạt, dài 0,5-0,6 mm Cuống hoa ngắn (0,4 mm), có lơng Lá đài 5, đều, rời, màu xanh, dạng hình tam giác nhỏ, dài 0,3-0,5 mm, tiền khai van Tràng hoa gồm cánh hoa rời, đều, màu tím nhạt, hình trứng, đỉnh cong vào phía trong, dài 1-1,5 mm, rộng 0,5-1 mm, tiền khai van Bộ nhị gồm nhị rời, đều, đính xen kẽ cánh hoa; nhị dạng sợi, màu xanh nhạt, dài 0,3-0,45 mm, có lơng ; bao phấn màu hồng tím,ơ, hình thận, dài 0,20,3 mm, nứt dọc, hướng trong, đính ; hạt phấn rời, hình hạt gạo, màu vàng, có rãnh dọc, dài 20-25 "m Bộ nhụy gồm noãn, bầu ơ, dẹp, đáy hình tim, đầu bằng, màu đỏ tía, dài 3-4 mm, rộng 3,5-4 mm, có nhiều lơng trắng Vịi nhụy 2, rời, đính đỉnh bầu choãi hai bên, màu xanh, dài 0,3-0,4 mm, chân vịi phình ra, đĩa mật hình vịng cung bao quanh gốc vịi nhụy Quả bế đơi, hình tim, đầu bằng, hai bên bị ép dẹp, dài 3,5-3,7 mm, rộng 3,5-4 mm, màu xanh phớt tía, có gân dọc màu hồng tía lơng mịn; cắt ngang gồm phần có hình tam giác, phần có 1012 cạnh lồi Hạt màu trắng, hình bán nguyệt, đường kính 1,5-2 mm 2,11 1.1.3 Phân bố, sinh học sinh thái Chi Centella L có khoảng 40 lồi, phân bố Nam Đông Nam Á Ở Việt Nam, Rau má mọc tự nhiên khắp nơi, ưa ẩm Mùa hoa quả: tháng 4-6 1,3,11 1.1.4 Thành phần hoá thực vật R3 R2 HO R1 R2 R4 lg Pow Acid asiatic H CH3 H H 5,32 Acid madecassic OH CH3 H H 4,40 CH3 H 4,50 COOR4 Acid terminolic HO HO Hợp chất H R1 OH H R3 Asiaticosid H CH3 H Glc6-Glc4-Rha -0,54 Madecassosid OH CH3 H Glc6-Glc4-Rha -1,20 Asiaticosid B OH H CH3 Glc6-Glc4-Rha -1,10 (Glc = glucose ; Rha = rhamnose) Hình 1.1 Các saponin triterpen Rau má Hoạt chất đóng vai trị quan trọng Rau má saponin triterpen nhóm ursan Các saponosid pseudoglycosid aglycon acid asiatic acid madecassic (acid brahmic) liên kết với phần đường thông qua liên kết ester 1,11 Ngồi cịn có số saponin nhóm oleanan (acid terminolic asiaticosid B) nhóm lupan (acid betulinic), số flavonoid (kaempferol, quercetin), alkaloid (hydrocotylin), carbohydrat (centellose, meso-inositol, pectin S3A), vitamin C, tinh dầu, carotenoid, sterol, lipid, hợp chất polyacetylen 1,11 Asiaticosid có phân tử khối 959,12 Da nên khó thấm qua da khơng thể vượt qua màng thẩm tích Do pseudoglycosid nên saponin Rau má có tính phá huyết yếu Nồng độ phá huyết acid asiatic mg/mL cịn asiaticosid madecassosid khơng biểu tính phá huyết 12,13 Tính phá huyết cho có liên quan đến tạo phức saponin với cholesterol ester màng hồng cầu lại thấy nhiều trường hợp khơng có tỷ lệ thuận số phá huyết khả tạo phức saponin với cholesterol 1.1.5 Tác dụng sinh học saponin tritenpenoid Rau má Rau má có vị đắng ngọt, mùi thơm, tính mát, có tác dụng nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu viêm, sát trùng, cầm máu, nhuận gan Dân gian dùng làm rau sống, giải khát, giải nhiệt, thông tiểu, chữa sốt, rôm sảy, mẩn ngứa, chữa bệnh gan, thổ huyết, tiêu chảy, lỵ viêm họng, viêm phế quản, viêm đường tiểu, giúp hạ huyết áp, chậm nhịp tim Liều dùng 30-40 g/ngày dạng tươi 1,11 Trước Rau má asiaticosid dùng để chữa hủi lao da Các saponin Rau má giúp làm tăng tổng hợp collagen I fibronectin, có tính làm lành vết thương, vết loét, vết phỏng, ngăn ngừa sừng hoá nên Rau má dùng làm thuốc giúp lành sẹo, mờ sẹo, hạn chế tạo sẹo lồi, chữa vết loét, bỏng độ II III, eczema, làm lành vết thương, vết mổ Sử dụng đường uống Rau má có tác dụng điều trị loét dày, tá tràng stress Do có thành phần flavonoid nên Rau má giúp làm bền thành mạch, trị rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch 1,11 1.1.6 Chiết xuất Rau má 1.1.6.1 Định nghĩa Chiết xuất Rau má (Centella asiatica extract) nguồn phong phú hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học chiết xuất từ Rau má, bao gồm: triterpenoid saponins, flavonoid, phenolic acid, triterpen steroid, amino acid đường Thành phần chiết xuất như: TECA (titrated extract of C asiatica), TTFCA (total triterpenoid fraction of C asiatica), TTF (total triterpenic fraction) giống chứa asiatic acid (30%), madecassic acid (29-30%), asiaticosid (40%) 1.1.6.2 Tác dụng sinh học da Trong da liễu, chiết xuất Rau má dùng để điều trị vết thương nhỏ, vết thương phì đại, vết bỏng, bệnh vẩy nến, xơ cứng bì Những vai trị quan trọng chiết xuất Rau má kể đến như: chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn chống ung thư Chiết xuất Rau má giàu triterpenes nguyên liệu có giá trị lớn ngành Dược phẩm Mỹ phẩm Làm lành vết thương: Chiết xuất Rau má, cụ thể saponins triterpenes có vai trò quan trọng việc hỗ trợ làm lành vết thương TECA thành phần (asiatic acid, madecassic acid, asiaticoside) nghiên cứu TECA làm tăng tổng hợp collagen loại I phụ thuộc liều lượng thông qua kích thích tăng sinh nguyên bào sợi kích hoạt đường SMAD TECA làm tăng nồng độ proline tự nội bào, hiệu ứng độc lập với kích thích tăng sinh collagen 6,18 Các hợp chất triterpene acid asiatic, acid madecassic, asiaticoside madecassoside chịu trách nhiệm việc chữa lành vết thương Tác dụng chứng minh chất chiết xuất hợp chất triterpene số lượng lớn báo cáo khoa học liên quan đến thí nghiệm in vitro in vivo.5,6,20,21 Điều trị bệnh vẩy nến: Hoạt động chống bệnh vẩy nến chiết xuất nước từ Rau má, có chứa thành phần asiaticoside madecasosside thông qua phát triển tế bào sừng SVK-14.6 Điều trị bệnh xơ cứng bì: Guseva cộng nghiên cứu hiệu chế phẩm madecasol dùng đường uống hay dùng chỗ bệnh nhân với chứng bệnh xơ cứng toàn thân xơ cứng bì khu trú chỗ Họ tìm với tháng dùng thuốc đường uống (liều 30 mg/ngày) làm mềm tổn thương da, làm sáng sắc tố da cải thiện tình trạng chung bệnh xơ cứng bì 1.1.6.3 Phương pháp chiết xuất Có nhiều phương pháp chiết xuất dược liệu ngâm lạnh, ngấm kiệt, chiết Soxhlet, chưng cất, chiết hỗ trợ siêu âm, chiết vi sóng,… Việc lựa chọn phương pháp chiết phụ thuộc tính khả thi mặt kinh tế mục tiêu chiết Công trình nghiên cứu Farhana Nazira Idris Masrina Mohd Nadzir (năm 2021) so sánh phương pháp chiết xuất khác Centella asiatica chiết xuất hợp chất có hoạt tính sinh học ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn Trong trường hợp chiết xuất Rau má, dung môi hữu như: ethanol, methanol, hay hỗn hợp cồn-nước sử dụng phổ biến Sử dụng phương pháp ngấm kiệt với hỗn hợp dung môi propylen glycol nước, thân Rau má chiết xuất vài ngày 22 Một số phương pháp chiết xuất (gồm thông số quy trình chiết hoạt chất chiết được) trình bày từ bảng 1.1 đên bảng 1.5 Bảng 1.1 Chiết xuất Rau má phương pháp ngấm kiệt STT Các thông số quy trình chiết xuất Hợp chất chiết xuất Ethanol 95% ; 60 ℃ ; 120 phút Tỉ lệ dược liệu : dung môi: 20 g/100mL Madecassosid, asiaticosid Acid asiatic, acid madecassic Nước, ethanol, methanol, tsôi, Tỉ lệ dược liệu : dung môi: g / 100 mL Asiaticosid Acid asiatic Methanol ; 66 ℃ ; Tỉ lệ dược liệu : dung môi: 10 g / 100 mL Phenolic Saponin Ethanol 80% (tt/tt) ; nhiệt độ phòng ; 24 Phenolic Tỉ lệ dược liệu : dung môi: g / 100 mL Saponin Ethanol tuyệt đối ; nhiệt độ phòng ; 24 Saponin Tỉ lệ dược liệu : dung môi: 2-20 g / 100 mL Ethanol 95% (tt/tt), nhiệt độ phòng ; 72 Tỉ lệ dược liệu : dung môi (đã sấy 35-40 ℃ Saponin ngày): 33 g / 100 mL, chiết lần Ethanol 70% ; nhiệt độ phòng ; 24 Tỉ lệ dược liệu : dung môi: 1-10 g / 100 mL Saponin Dùng máy lắc rung 200 RPM Bảng 1.2 Chiết xuất Rau má phương pháp Soxhlet STT Các thơng số quy trình chiết xuất Hợp chất chiết xuất Methanol : Nước (9:1) ; 60 phút Tỉ lệ dược liệu : dung môi : 20 g / 100 mL Madecassosid, asiaticosid Acid asiatic Methanol ; 60 ℃ ; Alkaloid, phenolic, tannin Flavonoid, terpenoid, saponin Ethanol ; Terpenoid, alkaloid, phenol Tỉ lệ dược liệu : dung môi : 400 g / 100 mL Methanol ; 12-24 Phenolic, flavonoid Ascorbic acid Bảng 1.3 Chiết xuất Rau má phương pháp chưng cất STT Các thông số quy trình chiết xuất Hợp chất chiết xuất Xylen ; 70 phút Tỉ lệ dược liệu : dung môi : 0,4 g / 100 mL Tinh dầu α-caryophyllene Germacrene D Nước ; 3-4 Phenolic, flavonoid Ascorbic acid Bảng 1.4 Chiết xuất Rau má phương pháp hỗ trợ với siêu âm STT Các thông số quy trình chiết xuất Hợp chất chiết xuất Nước ; 20 phút ; 125 W Tỉ lệ dược liệu : dung môi : 0,4 g / 100 mL Asiatic acid Methanol : Nước (9:1) ; 10 phút × lần Tỉ lệ dược liệu : dung môi : 10 g / 100 mL Madecassosid, asiaticosid Acid siatic, acid madecassic Methanol : Nước (9:1) ; Tỉ lệ dược liệu : dung môi : g / 100 mL Madecassosid, asiaticosid Acid siatic Ethyl acetat : Nước (99:1) 40 kHz ; 216 W ; 70 ℃ Tỉ lệ dược liệu : dung môi : g / 100 mL Alkaloid, flavonoid Saponin, terpenoid Bảng 1.5 Chiết xuất Rau má phương pháp hỗ trợ với vi sóng STT Các thơng số quy trình chiết xuất Hợp chất chiết xuất Ethanol ; phút ; mức lượng 40-50% Tỉ lệ dược liệu : dung môi : g / 100 mL Phenolic, flavonoid Triterpenoid Methanol : Nước (9:1) ; 20 phút Tỉ lệ dược liệu : dung môi : g / 100 mL Madecassosid, asiaticosid Acid siatic Ethanol ; 20 phút Saponin triterpen Tỉ lệ dược liệu : dung môi : 2-20 g / 100 mL 1.1.6.4 Ứng dụng chiết xuất Rau má Chiết xuất Rau má sử dụng phổ biến sản xuất Dược phẩm Mỹ phẩm Trong bào chế, chiết xuất Centella asiatica ứng dụng để làm viên nén, kem bôi da, gel bôi da, thuốc mỡ Hiện có số chế phẩm Madecassol®, Centellase®, Blastoestimulina® 5,6 Kem Madecassol® cơng ty Bayer (Thổ Nhĩ Kì) thuốc mỡ Centellase® có chứa hoạt chất thành phần 10 mg chiết xuất Rau má chuẩn hoá g chế phẩm dùng với định trị sẹo lồi, loét chân, viêm tĩnh mạch, vết thương chậm lành, vết thương phẫu thuật, vết bỏng, vết loét Thuốc mỡ Blastoestimulina® chứa 0,01 g chiết xuất Rau má chuẩn hoá, 0,0035 g neomycin sulfat g chế phẩm định cho vết thương bị nhiễm trùng vết thương có nguy nhiễm trùng Chiết xuất Rau má giúp thúc đẩy trình làm lành vết thương phối hợp với kháng sinh neomycin có phổ kháng khuẩn rộng, chống lại vi khuẩn Gram (+) Gram (-), đảm bảo hiệu chống nhiễm trùng sản phẩm Ngoài ra, thị trường Việt Nam lưu hành kem Yoosun Rau má Công ty CPDP Đại Bắc với thành phần lành tính bao gồm dịch chiết Rau má, vitamin E, D-panthenol, chlorhexidine digluconate có cơng dụng dưỡng da, làm mát da, ngăn ngừa mụn thâm mụn, làm dịu vết muỗi đốt, tái tạo da, ngừa thâm sẹo 10 1.2 VẾT THƯƠNG TRÊN DA 1.2.1 Định nghĩa Vết thương định nghĩa khuyết tật vết rách da tổn thương vật lý, hóa học hay nhiệt độ, dẫn đến phá vỡ tính tồn vẹn da, cấu trúc giải phẫu bình thường chức mô sống 14-16 Da quan quan trọng thể, hàng rào bảo vệ thể với mơi trường bên ngồi, ngăn chặn tác nhân có hại vi khuẩn, virus xâm nhập trì mơi trường bên Tổn thương da có kèm theo xâm nhập vi khuẩn gây tình trạng viêm nhiễm trùng chỗ (nhiễm trùng vết thương) toàn thân (nhiễm trùng huyết) Do đó, việc đánh giá vết thương điều cần thiết cho chẩn đoán, điều trị, quản lý nghiên cứu 16 Dựa chất trình làm lành, vết thương phân thành hai loại cấp tính mãn tính: - Vết thương cấp tính thường lành hồn tồn, phục hồi lâu dài tính tồn vẹn chức giải phẫu, để lại sẹo, thời gian lành khoảng -12 tuần Các chấn thương học, vết mổ phẫu thuật, vết bỏng, chất thương hóa chất, xạ, điện, nguồn nhiệt,… nguyên nhân phổ biến vết thương cấp tính - Vết thương mãn tính chấn thương mô mà chưa lành sau 12 tuần, thường tái phát, khó lành chấn thương lặp lại, tình trạng sinh lý bệnh tiểu đường, khối u ác tính, nhiễm trùng dai dẳng,… 15,16 Ngồi ra, vết thương phân loại dựa số lượng lớp da diện tích bề mặt da bị ảnh hưởng - Vết thương bề mặt tổn thương ảnh hưởng đến bề mặt biểu bì da - Vết thương nông tổn thương liên quan đến lớp biểu bì lớp hạ bì, bao gồm mạch máu, tuyến mồ hôi, tuyến nang lông - Vết thương sâu xảy lớp mỡ da mô sâu bị tổn thương 16 11 1.2.2 Tiến trình làm lành vết thương Làm lành vết thương trình sinh học phức tạp liên quan đến tăng sinh tế bào tái tạo mô Vết thương chữa lành cách lý tưởng trở lại cấu trúc, chức hình dạng giải phẫu bình thường da Quá trình làm lành vết thương chia thành giai đoạn: cầm máu, phản ứng viêm, tăng sinh tế bào tái cấu trúc - Giai đoạn cầm máu viêm gần xảy đồng thời, từ vài phút đến 24 giờ, kéo dài khoảng ngày sau bị thương Ở giai đoạn này, có phóng dịch tiết giàu protein vào vết thương mơ hoại tử hóa lỏng tác dụng enzyme để tạo thành khối lỏng màu vàng nhạt Dịch tiết thành phần quan trọng làm lành vết thương, cung cấp nước, giữ ẩm cho vết thương, cung cấp chất dinh dưỡng, tạo điều kiện thuận lợi cho di chuyển nguyên phân tế bào biểu mô, cung cấp bạch cầu giúp kiểm soát vi khuẩn, giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thương - Giai đoạn tăng sinh tái cấu trúc đặc trưng di chuyển tế bào biểu mô nguyên bào sợi đến vùng bị thương để thay mô bị tổn thương bị Những tế bào tái tạo phát triển nhanh chóng lớp vảy khơ (hay cục máu đơng) kèm theo dày biểu mô Sự tăng sinh tế bào kéo dài từ 2-3 ngày Các mô hạt hình thành tăng sinh mao mạch hạch bạch huyết vết thương collagen tạo thành từ nguyên bào sợi Đến ngày thứ năm, hình thành mô hạt mạch máu đạt mức tối đa Sự tăng sinh nguyên bào sợi collagen tiếp tục tuần, thời gian đó, mạch máu phù nề thuyên giảm Giai đoạn tái cấu trúc liên quan đến hình thành liên kết tế bào mơ, điều định tính chất vết sẹo 15,16 Mục đích việc làm lành vết thương làm lành nhanh theo cách đơn giản nhất, mục đích thứ yếu giảm hình thành sẹo 16.Có số yếu tố cần quan tâm để đảm bảo vết thương chữa lành thành cơng Trong trường hợp vết thương mãn tính, yếu tố tiềm ẩn bệnh tật, liệu pháp dùng thuốc, hoàn cảnh bệnh nhân phải xem xét Các tác nhân làm lành vết thương truyền thống 12 bao gồm loại băng vết thương, công thức dạng lỏng (dung dịch, hỗn dịch, nhũ tương) bán rắn (thuốc mỡ, kem, gel) Các chế phẩm dạng lỏng hay bán rắn sử dụng rộng rãi việc làm lành vết thương 15 1.3 TỔNG QUAN VỀ LIPOSOME 1.3.1 Định nghĩa liposome Liposome thể lipid kép dạng túi rỗng hình thành từ loại phospholipid, có kích thước từ 0,03-10 "m 17 Liposome dùng làm chất mang dạng tiểu phân nghiên cứu rộng rãi có nhiều triển vọng thiết kế hệ thống đưa thuốc đến mục tiêu 18 Liposome phân loại theo kích thước, bao gồm: - Liposome đơn lớp gồm đơn lớp nhỏ (SUV, nanoliposome) có kích thước từ 0,025-0,05 "m thể đơn lớp lớn (LUV, GUV) có kích thước từ 0,2-5 "m 19 - Liposome đa lớp thường có kích thước lên đến 0,5 "m gồm có liposome đa lớp đồng trục OLV (từ 2-10 lớp) MLV (trên 10 lớp), liposome kép (MVV) liposome có cấu trúc đa khoang 19 (A) Liposome đơn lớp ; (B) (C): Liposome đa lớp đồng trục (D): Liposome kép ; (E): Liposome đa khoang Hình 1.2 Cấu trúc số liposome 13 1.3.2 Ưu điểm nhược điểm liposome 1.3.2.1 Ưu điểm liposome - Về mặt sinh học: Liposome hoàn toàn trơ mặt sinh học phân huỷ sinh học Khơng có độc tính, tính kháng ngun tính sinh nhiệt phospholipid thành phần tự nhiên tất màng tế bào 20 - Về mặt bào chế: Có thể điều chế với kích thước, thành phần, điện tích bề mặt khác tuỳ theo yêu cầu ứng dụng Có thể dùng để mang bao nhiều loại dược chất thân nước thân dầu enzym, vitamin, kháng sinh, tác nhân kháng khối u Thuốc giữ liposome mang đến mục tiêu tuỳ thuộc vào liposome bị phá huỷ nơi mà dược chất phóng thích bảo vệ khỏi yếu tố bất lợi từ bên số trường hợp làm giảm độc tính thuốc trường hợp liposome chứa Amphotericin B 20,21 Các liposome hệ xử lý gắn thêm cấu trúc khác lên bề mặt giúp thay đổi lực thuốc với receptor nhằm vận chuyển thuốc tới mục tiêu 22 1.3.2.2 Nhược điểm liposome Các đặc tính vật lý, ổn định điều chế tính thấm liposome tuỳ thuộc vào yếu tố bên (pH, nhiệt độ môi trường, lực ion, diện các cation hoá trị II) yếu tố bên liposome (điện tích bề mặt, chất lipid mức độ bão hoà độ dài chuỗi acid béo) 20 Mặt khác, trình điều chế liposome sử dụng dung môi hữu nên đặt vấn đề kiểm sốt lượng dung mơi tồn dư sản phẩm ảnh hưởng đến môi trường bào chế quy mô lớn 22 Nhược điểm liposome chủ yếu thuộc lĩnh vực độ ổn định đồng sản xuất liposome, nên nghiên cứu sử dụng cần khảo sát yếu tố sau 20: - Tính tinh khiết ổn định lipid - Sự tương tác dược chất lipid - Sự ổn định dược chất nguy chảy thoát dược chất khỏi liposome - Sự kiểm sốt kích thước hiệu suất mang thuốc liposome nâng cỡ lô 14 1.3.3 Khả vận chuyển thuốc qua da liposome Cơ chế việc hấp thu thuốc qua da chế khuếch tán thụ động 20,23 Các yếu tố hỗ trợ thấm thuốc qua da chia thành hai nhóm: - Các yếu tố hoạt chất: Hệ số phân bố dấu/nước, nồng độ hoạt chất, hệ số khuếch tán hoạt chất, khả ion hoá hoạt chất pH môi trường 20,23 - Các yếu tố tá dược khả bám dính tạo thành lớp mỏng, khả giải phóng hoạt chất chỗ, khả phân bố hoạt chất đến mô cần trị liệu, khả dẫn thuốc qua hàng rào thân nước thân dầu cấu trúc da, khả hydrat hoá lớp sừng, khả tạo pH phù hợp 20,23 Stratum corneum Stratum granulosum Stratum spinosum Stratum basale Ống tiết mồ hôi Tuyến bã nhờn Tuyến mồ hôi Cơ dựng lông Nang lơng Mạch máu bạch huyết Mơ mỡ Hình 1.3 Cấu trúc da từ ngồi vào Lớp biểu bì da bao gồm lớp lipid bảo vệ, lớp sừng lớp niêm mạc Lớp sừng có chất hố học keratin ngậm nước, gọi lớp đối kháng có vai trị quan trọng q trình hấp thu thuốc Cấu trúc gồm nhiều lớp tế bào, bên tế bào chết dễ bong tróc (stratum corneum), bên lớp tế bào liên kết với chặt chẽ (stratum lucidum) Bề dày bình thường lớp sừng từ 10-40 "m chứa 10% nước, thấm nước dày lên đáng kể tế bào biểu bì trương nở Lớp sừng có vai trị bảo vệ thể điều hoà thấm nước chất qua da Lớp sừng có khả giữ lại phần hoạt chất phóng thích từ 15 từ nên xem lớp sừng kho dự trữ thuốc Bên lớp sừng lớp niêm mạc (lớp Malpighian) dày khoảng 30-60 "m cấu trúc tế bào sống (stratum spinosum stratum basale) phân chia để tạo cấu trúc lớp sừng bên ngồi Ở hai lớp có lớp tế bào sống dày khoảng 10 "m gọi vùng hàng rào Rein (stratum granulosum) có tính khơng thấm nước ngăn chặn trình nước từ tổ chức bên 20,23 CÁC LỚP TỔ CHỨC DA ĐƯỜNG ĐƯA THUỐC Hoạt chất hồ tan, khuếch tán, phóng thích từ tá dược Trên bề mặt da MỘT SỐ TRỊ LIỆU Trang điểm Bảo vệ da Trị côn trùng cắn Trị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm bề mặt da Thấm qua lớp sừng Làm mềm da Làm bong sừng Lớp sừng Phân phối, khuếch tán lớp sừng Bộ phận phụ Thấm qua phận phụ Tuyến bã & nang lông Tuyến mồ hôi Phân phối, khuếch tán lớp biểu bì sống Lớp biểu bì sống Chống đổ mồ Làm bong tróc da Chống vi khuẩn, nấm Làm rụng lông Kháng viêm Gây tê Chống ngứa Kháng histamin Phân phối, khuếch tán lớp trung bì Lớp trung bì Di chuyển đến tuần hồn chung Tuần hoàn chung Hệ thống trị liệu qua da Các thuốc tác động tồn thân Hình 1.4 Đường thấm thuốc qua da số trị liệu thích hợp Thuốc thấm qua da thấm trực tiếp xuyên qua tế bào ngấm theo phận phụ Các tiểu phân có từ 3-10 "m tập trung nang lơng tiểu phân kích thước < "m qua nang lơng vào da Các chất thân dầu dễ thấm qua lớp biểu bì khó thấm vào tới lớp trung bì, hạ bì 23 Các chế phẩm dùng ngồi da muốn có tác động tồn thân cần có hoạt lực mạnh với liều điều trị không mg/ngày 20,23 Các nghiên cứu khả thấm qua da liposome cho thấy liposome thấm tốt qua lớp sừng khó thấm qua lớp biểu bì 24 Các liposome đơn lớp có tích điện dương hấp thu vào da tốt tốt liposome trung hoà tích điện âm tương ứng lớp sừng có nhiều nhóm sulfidryl tích 16 điện âm 23,25 Tuy nhiên, liposome tích điện âm lại thấm tốt vùng biểu bì sống trung bì 25 Điện di làm tăng cương hấp thu liposome tích điện âm Do chế phẩm dùng ngồi da có cấu trúc liposome thường với mục đích làm mềm da trị bệnh lý nhiễm khuẩn, nhiễm nấm ngồi da nang lơng 18 1.3.4 Thành phần cấu trúc liposome 1.3.4.1 Phospholipid Phospholipid nguyên liệu để điều chế liposome Phospholipid ester phân thành hai nhóm glycerophospholipid sphingophospholipid Phần alcol glycerophospholipid diacylglycerol phần alcol sphingophospholipid N-acylsphingosin Phần acid acid phosphoric dẫn xuất với inositol, aminoalcol (cholin, ethanolamin, serin) tạo thành sản phẩm acid phosphatidic dẫn xuất (lecithin, cephalin,…) HO R1OCO O OCOR2 P HO OH O R1OCO P O O OCOR2 (A) OX (B) Hình 1.5 Cấu trúc (A) acid phosphatidic (B) glycerophospholipid O HN R O OH HO O P O X Hình 1.6 Cấu trúc sphingophospholipid Khả tích điện liposome phụ thuộc vào nhóm cấu trúc acid phosphoric Trong bào chế liposome thường sử dụng glycerophospholipid phosphatidylcholin, phosphatidylglycerol với gốc acyl acid béo acid lauric (12:0), acid mysristic (14:0), acid palmitic (16:0), acid stearic (18:0), acid oleic 17 (18:1(∆9)) Có thể sử dụng hỗn hợp phospholipid chiết xuất từ đậu nành dạng nguyên chất (SPC) hydro hố (HSPC) Các phospholipid có khả tự liên kết với tạo thành tiểu phân hình cầu có cấu trúc khác dựa vào thơng số đóng gói tới hạn (CPP) phân tử thơng qua đại lượng gồm v thể tích phần thân dầu ; lc chiều dài phân thân dầu a0 diện tích bề mặt tiểu phân chiếm chỗ phần ưa nước: ν CPP = a0 lc Các chất có khả tạo màng kép có giá trị CPP từ 0,5 đến xấp xỉ 1,0 27 Các phospholipid có đại lượng nhiệt độ chuyển pha (Tm) Đại lượng phụ thuộc vào cấu trúc nhóm phân cực, chiều dài mức độ bão hồ acid béo có ý nghĩa việc đánh giá khả thấm giải phóng hoạt chất liposome Giá trị Tm xác định với phép đo nhiệt vi sai (DSC) 26,27 Bảng 1.6 Một số thông tin phospholipid dùng bào chế liposome Phospholipid Loại acid béo Tm (℃) Điện tích bề mặt DLPC 12:0 -1 DMPC 14:0 23 DPPC 16:0 41 DSPC 18:0 55 DOPC 18:1 (∆9) -20 DMPE 14:0 50 DPPE 16:0 63 DOPE 18:1 (∆9) -16 Ở nhiệt độ Tm, phân tử phospholipid tồn trạng thái gel vững chắc, nhiệt độ tiệm cận Tm xảy trình chuyển pha từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng có cấu trúc lỏng lẻo Nên để sử dụng trị liệu qua da nên lựa chọn lipid có Tm phạm vi nhiệt độ sinh lý da (30-35 ℃) Liposome khơng thể phóng thích hoạt chất không tương tác với tế bào Sự tương tác xảy theo ba chế gồm 20,28: - Sự hợp màng liposome với màng tế bào 18 - Sự khuếch tán hoạt chất chứa liposome qua màng tế bào - Sự nội bào hoá liposome bị phân huỷ lysosome 1.3.4.2 Cholesterol Cholesterol dẫn chất cholesterol ester thêm vào cấu trúc liposome với tỷ lệ phần trăm phospholipid cholesterol từ 80:20 đến 50:50 29 (A) (B) Hình 1.7 Cấu trúc (A) cholesterol (B) oleoyl ester cholesterol Vai trò cholesterol cấu trúc liposome gồm: - Làm tăng hiệu suất tạo thành tiểu phân phân tử phospholipid - Làm tăng tính bền vững liposome - Giảm tính thấm màng với chất tan điện ly không điện ly - Hạn chế việc kết tập tiểu phân Tuy nhiên, nhược điểm cholesterol làm giảm hiệu suất tải hoạt chất liposome đặc biệt hoạt chất thân dầu có cạnh tranh vị trí phần cấu trúc thân dầu liposome, làm giảm tính thấm qua da Mặt khác, cholesterol dễ bị oxi hố nên tạo thành sản phẩm thối giáng khơng có lợi cho thể 1.3.4.3 Các thành phần khác Ngoài phospholipid cholesterol, q trình bào chế liposome cịn bổ sung chất để thay đổi điện màng bổ sung chất làm thay đổi cấu trúc màng liposome 19 1.3.5 Tổng quan phương pháp bào chế liposome Việc bào chế liposome cần thực điều kiện vô trùng với vật liệu tinh khiết, vô trùng Nguyên tắc việc bào chế hệ thống liposome phối hợp thành phần liposome gồm phospholipid lipid khác với dung dịch dược chất Các hợp chất thân nước lớp nước liposome hợp chất thân dầu giữ lớp lipid kép 20 Q trình bào chế tóm tắt sau 30: - Hoà tan phospholipid vào dung môi hữu làm bay dung môi - Thêm dung dịch nước chứa hoạt chất vào để phân tán lipid - Tinh chế liposome thu - Kiểm tra đánh giá thành phẩm 1.3.6 Các phương pháp tải thuốc vào liposome Các phương pháp tải hoạt chất vào liposome gồm có hai nhóm phương pháp tích cực (tải dược chất vào liposome bào chế sẵn) phương pháp thụ động (tải dược chất trình bào chế liposome) 30 Trong bào chế thường phối hợp phương pháp để tăng hiệu suất quy trình thu cấu trúc mong muốn 1.3.6.1 Các phương pháp tải thuốc tích cực Các phương pháp tải thuốc tích cực có ưu điểm hiệu suất tải thuốc cao đồng thời hạn chế chảy thoát dược chất khỏi liposome sau bào chế 30,31 1.3.6.2 Các phương pháp tải thuốc thụ động Được sử dụng nhiều quy trình bào chế liposome gồm nhóm sau: - Phương pháp phân tán học: Siêu âm, đồng hoá, nén đẩy qua màng, hydrat màng mỏng vi hoá lỏng 30 - Phương pháp phân tán dung môi: Tiêm ethanol, tiêm ether, bốc pha đảo, nhũ hoá kép kết hợp với đông khô, trao đổi dung môi 30 - Phương pháp loại bỏ chất diện hoạt: Thẩm tích, hấp thụ chất diện hoạt, hấp phụ gel Đây phương pháp xử lý liposome thể MLV LUV bào chế cách sử dụng chất diện hoạt (dẫn xuất acid cholic, alkyl glycoside, 20 Triton X-100,…) nồng độ micelle tới hạn (CMC) để hoà tan lipid phối hợp với pha nước 30,32 Ngồi ra, cịn số phương pháp khác dòng diện, chất lỏng siêu tới hạn phương pháp đơn giản (single-step method) Đề tài sử dụng phương pháp phân tán dung môi hữu sử dụng diethyl ether tiêm vào pha nước nhiệt độ 45-65 ℃ 30 Phương pháp dễ tiến hành tránh tác động vật lý hoá học lên cấu trúc lớp lipid kép Một số nhược điểm phương pháp sau 33,34: - Hiệu suất liposome hoá thấp, đặc biệt dược chất thân nước - Khó loại bỏ hồn tồn ether gây tượng tồn dư dung môi - Tốc độ tiêm chậm tiêm nhanh có nguy gây tắc kim - Kích thước liposome thu không đồng (0,07-0,2 "m) Các yếu tố ảnh hưởng lên phương pháp cần tối ưu hoá tiến hành 34: - Tỷ lệ dung môi hữu pha nước phối hợp - Nhiệt độ tốc độ khuấy phối hợp - Tốc độ tiêm dung môi hữu vào pha nước 1.3.7 Các phương pháp tinh chế liposome 1.3.7.1 Thẩm phân Thẩm phân phương pháp thường dùng để loại bỏ phân tử nhỏ nhờ màng bán thấm cố định mơi trường thẩm phân có khuấy trộn máy khuấy từ Phương pháp kiểm soát nhờ yếu tố màng lọc (kích thước lỗ lọc) dịch thẩm phân (khả hoà tan chất cần thẩm phân khả trì tính bền vững màng lipid kép) 35 - Ưu điểm phương pháp thẩm phân: - Dễ tiến hành, chi phí thấp tiến hành với lượng mẫu lớn - Kết thu có tính xác có độ lặp lại cao - Nhược điểm phương pháp: 21 - Tốn nhiều thời gian (tối thiểu 24 loại bỏ khoảng 95% phân tử) cần phải kiểm tra môi trường thẩm phân để xác định thời gian thẩm phân tối ưu - Phải kiểm sốt nồng độ thẩm thấu mơi trường thẩm phân so với môi trường khoang liposome để tránh tượng chảy thoát hoạt chất - Hiệu suất thu hồi liposome bị giảm liposome bị kết kính vào dụng cụ chứa 1.3.7.2 Ly tâm Phương pháp phụ thuộc nhiều yếu tố 35 - Yếu tố tiểu phân: Hình dạng, kích thước tỷ trọng - Yếu tố môi trường phân tán: Độ nhớt, tỷ trọng hàm lượng chất tan - Tốc độ ly tâm: Phải 10.000 RPM Phương pháp có khả gây kết tập tiểu phân chảy thoát dược chất cho hoà màng tiểu phân Phương pháp gồm có siêu ly tâm vi ly tâm - Siêu ly tâm (ultracentrifugation) thường sử dụng nghiên cứu sinh học tế bào dùng để tách riêng loại bào quan tế bào Tốc độ ly tâm cao thường kèm với gia tăng nhiệt độ dẫn đến ổn định màng làm chảy thoát dược chất 35 - Vi ly tâm (microcentrifugation) thực dụng cụ gọi eppendorf tích từ 0,2-2 mL Vi ly tâm thường dùng để tách chất có phân tử khối 7000 Da Có thể phối hợp vi ly tâm với sắc ký lọc gel dùng Sephadex G50 G25 (Gel filtration microcentrifugation) với việc tối ưu hoá thời gian rửa giải để tăng hiệu tinh chế 35 1.3.7.3 Siêu lọc Siêu lọc phương pháp nhanh đơn giản để tinh chế liposome Siêu lọc kết hợp phương pháp dùng màng bán thấm phương pháp ly tâm Kích thước lỗ lọc màng bán thấm thường 1/10 kích thước tiểu phân Phương pháp hạn chế pha loãng nồng độ liposome làm giảm ảnh hưởng lực ly tâm với cấu trúc màng lipid kép 35 22 1.4 TỔNG QUAN VỀ GEL 1.4.1 Định nghĩa Gel dạng thuốc mỡ cấu tạo chất lỏng (mơi trường phân tán) gel hố nhờ tá dược tạo gel thích hợp Sự chuyển động môi trường phân tán bị giới hạn mạng khơng gian ba chiều hình thành chuyển thể sol-gel tác dược tạo gel Sự chuyển thể xảy solvat hoá tá dược tạo gel hình thành liên kết vật lý, hố học Sự chuyển thể phụ thuộc vào tác nhân nồng độ tác nhân tạo gel, nhiệt độ, pH, lực tương tác ion,… có nhiều ứng dụng tạo gel in situ Gel phân loại thành hai nhóm gel thân nước gel thân dầu dựa tính chất vật lý tác nhân tạo gel 36,37 Các chế phẩm dùng da thường gel thân nước nên thường dùng tá dược tạo gel loại gôm, polysaccharid (tinh bột, tinh bột biến tính), dẫn xuất cellulose, dẫn xuất acid acrylic (carbopol), magnesi nhơm silicat (Veegum) Có thể thêm vào chất béo nhũ tương hoá để tạo hình dáng hấp dẫn 22,23,38 Gel thân nước có số đặc điểm sau 17,36-39: - Tính thixotropic: Là đặc điểm chất lỏng phi Newton kiểu giả dẻo, xác định kiểm tra tính lưu biến chế phẩm Các chất lỏng thixotropic có độ nhớt phụ thuộc thời gian chịu tác động ngoại lực có chuyển thể sol-gel thuận nghịch phụ thuộc vào cường độ lực tác động nên có khả dàn bám dính da tốt - Thường không chứa dầu, với chế phẩm trị mụn - Dễ dàng loại bỏ nước (tan nước) - Có khả làm mềm, bảo vệ giảm kích ứng da, khơng làm đổi màu da - Tương thích với nhiều tá dược khác 1.4.2 Một số tá dược tạo gel thường dùng Các tá dược tạo gel phân loại dự tính chất hố học: 23 - Các tác nhân vô (nhôm hydroxyd, magne hydroxyd, bentonit,…) thường tạo gel hai pha có chất giống hỗn dịch keo 17,36,37 - Các tác nhân hữu (protein, polysaccarid, polymer) thường tạo gel pha khơng tồn giới hạn rõ ràng pha phân tán môi trường phân tán 36,37 1.4.2.1 Tá dược tạo gel hữu từ thiên nhiên Nhóm có chất chất đại phân tử protein polysaccarid 36,37 - Protein: Collagen (0,2-0,4%, cần trì pH > 37 ℃), gelatin (2-15%) - Polysaccarid: Chitosan, dextran, agar, k-arrageenan, alginat, pectin, tinh bột, acid hyaluronic, loại gôm (arabic, xanthan, aragant, guar, gellan…) 1.4.2.2 Tá dược tạo gel hữu có nguồn gốc tổng hợp - Các dẫn xuất bán tổng hợp cellulose: methyl cellulose (MC), ethyl cellulose (EC), carboxymethyl cellulose (CMC, Na CMC), hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) Hàm lượng sử dụng để tạo gel tuỳ vào chất cụ thể (1-5% MC, 36% Na CMC, 2-5% HPMC) cần phối hợp thêm chất giữ ẩm glycerol, sorbitol Nhóm có ưu điểm tiệt trùng nhiệt điều chỉnh pH nhờ phối hợp các dung dịch đệm 23,26,38 - Các polymer acid acrylic (carbomer) dẫn xuất: Có khả trương nở tạo gel nước, glycerol, propylen glycol Gel carbomer khơng sánh có tính acid trung hồ với kiềm lên đến pH khoảng 4-6 (thường dùng triethanolamin) làm tăng độ sánh Carbomer sử dụng phổ biến Carpobol 974 với hàm lượng từ 0,5-2% 23,26,38 - Poloxamer (Pluronic®): Là polymer đồng trùng hợp chuỗi polyoxypropylen xen chuỗi poly(ethylenglycol) Poloxamer sử dụng làm tá dược tạo gel nồng độ 15-50% 26,38 - Polyacrylamid: Tan tốt nước, glycerol không tan methanol, ethanol Tạo gel nồng độ 4%, gel tạo thành dễ bị giảm độ nhớt bị lão hoá 26,38 - Poly(vinyl alcol): Tạo gel nồng độ 4-10% nhiệt độ 14 ℃ 26,38 24 1.4.2.3 Tá dược tạo gel có nguồn gốc vơ - Nhơm hydroxyd: Tạo gel hai pha có cấu trúc hỗn dịch keo 36,37 - Nhóm tá dược tạo gel chất rắn dạng hạt mịn, có nguồn gốc tự nhiên bentonit (nhôm silicat), hectorit (magnes silicat) tổng hợp (laponit) Nồng độ tạo gel bentonit hectorit từ 0,5-5% laponit 2% 36,37 1.4.3 Các phương pháp bào chế gel thân nước - Sử dụng tương tác vật lý: Gia nhiệt (có thể kết hợp với việc làm lạnh), lực tĩnh điện, lực tương tác ion, lực liên kết hydro, đông lạnh-giải đơng 40 - Sử dụng phản ứng hố học để hình thành liên kết polymer cách bổ sung chất tạo cầu nối monomer làm khung để monomer gắn lên Có thể phối hợp phương pháp hoá học với phương pháp dùng xạ ion hoá để tăng hiệu suất tạo thành gel 40 - Sử dụng xạ ion hố để hình thành gốc tự do, gốc tự kết hợp với để hình thành mạng lưới khơng gian Q trình thực với chất tạo gel ngâm nước chất tạo gel dạng rắn dùng để xử lý gel thành phẩm để làm tăng số liên kết chéo mạng lưới không gian 40 1.4.4 Các yếu tố ảnh hương đến trình tạo gel 1.4.4.1 Trình tự phối hợp tá dược tạo gel Tuỳ thuộc vào tác động thành phần khác công thức Nếu thành phần gây ảnh hưởng lên tốc độ trương nở tá dược tạo gel chúng bổ sung sau gel tạo thành Trong trường hợp ngược lại, thành phần khác nên bổ sung vào môi trường phân tán trước bổ sung tá dược tạo gel, nhiên cần phải khảo sát ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ trình trương nở lên độ bền hoạt chất 7,22,41 1.4.4.2 Môi trường phân tán Nước tinh khiết môi trường phân tán phổ biến Một số chất khác dùng để hỗ trợ q trình trương nở tá dược tạo gel 22: 25 - Hỗn hợp ethanol-toluen làm tăng khả phân tán ethylcellulose - Dicloromethan methanol làm tăng độ nhớt hydroxypropyl cellulose - Một số alcol tăng độ bền lưu biến gel poly (ethylen oxyd) - Glycerin, propylene glycol, sucrose cải thiện khả phân tán natri alginat - Borax dùng làm chất phân tán gel poly (vinyl alcol) - Magnes oxid, kẽm oxid glycerin dùng làm chất phân tán gel bentonit 1.4.4.3 Điều kiện bào chế Nhiệt độ, pH thời gian làm trương nở tiêu cần tối ưu hoá 22 - Gelatin poly(vinyl alcol) cần ngâm nước nóng cịn methylcellulose cần ngâm nước nhiệt độ bình thường - Carbomer, gơm Guar, gơm Aragant, HPC, poloxamer có khoảng pH tạo gel hẹp từ 5-8 cịn CMC, HPMC, natri alginat tạo gel có khoảng pH tạo gel rộng từ 4-10 - Thời gian làm trương nở tá dược tạo gel tới 24 loại gôm tự nhiên tới 48 tá dược dạng polymer 1.4.4.4 Bọt khí Bọt khí gel thành phẩm thường gặp phối hợp thành phần khác vào tá dược tạo gel ngâm trương nở Một số phương pháp hạn chế bọt khí q trình bào chế lắp cánh khuấy đáy thùng khuấy trộn tăng thời gian để ổn định, bảo quản nhiệt độ thấp, dùng siêu âm bổ sung tá dược chống tạo bọt Ở quy mô cơng nghiệp, dùng hệ thống khử khí chân khơng để loại bỏ bọt khí 22 1.4.4.5 Đóng gói Thường dùng tuýp lọ nhựa Có thể dùng vật liệu làm nhôm để chứa chế phẩm có tính acid nhẹ Cần phải đuổi hết khí dụng cụ chứa để tránh sản phẩm bị nhiễm khuẩn 22 26 1.4.5 Một số phương pháp đánh giá chế phẩm gel 1.4.5.1 Đánh giá thể chất Thể chất gel có ảnh hưởng đến sinh khả dụng dạng bào chế Một số tiêu để đánh giá thể chất gel độ nhớt, độ xuyên sâu, độ bám dính, độ dàn mỏng, khả chảy khỏi tuýp Các thử nghiệm nêu tiến hành nhiều lần phải điều kiện nhiệt độ với việc bảo quản chế phẩm 23 1.4.5.2 Độ nhớt Độ nhớt chất lỏng cao lực tác động làm trượt khối chất lỏng lớn nên tăng khả bám dính chế phẩm vị trí sử dụng gây ảnh hưởng tới trình giải phóng thuốc Để xác định độ nhớt chế phẩm dùng nhớt kế Đơn vị độ nhớt Pa.s centipoise (1 cP = mPa.s) 23 1.4.5.3 Độ dính chế phẩm Độ dính chế phẩm biểu thị thời gian cần thiết để làm tách rời hai bề mặt rắn (thường hai kính niêm mạc động vật) chứa lớp chế phẩm giữa, tác dụng khối lượng định 23 Bề mặt gắn cố định, bề mặt nối với dụng cụ treo đĩa cân chuyển động qua ròng rọc Cho g chế phẩm hai kính đặt hai kính cân có khối lượng 0,5-1 kg để chế phẩm dàn mỏng đến diện tích định 42,43 - Nếu xác định lực tách rời hai bề mặt phương lực phải đặt vng góc với bề mặt Đặt lên đĩa cân cân có khối lượng định ghi nhận khối lượng làm tách hai bề mặt Lực tách f1 = m S (g/cm2) với m khối lượng cân làm tách hai bề mặt có diện tích tiếp xúc S 43 - Nếu xác định lực trượt phương lực phải bố trí song song với bề mặt Đặt lên đĩa cân cân có khối lượng m (g) định ghi nhận thời gian trượt t (s) bề mặt đến vị trí cách điểm xuất phát l (cm) xác định sẵn Lực trượt f2 = m.l t (g.cm/s) 42,43 27 1.4.5.4 Tính lưu biến Tính chất lưu biến nhằm đánh giá độ nhớt (tính chất chảy, khả trơn trượt) độ biến dạng (biến dạng đàn hồi, biến dạng dẻo) chất trước tác động ngoại lực Kết đánh giá tính lưu biến chế phẩm lỏng bán rắn cho phép đánh giá độ ổn định chế phẩm sinh khả dụng chế phẩm Tính lưu biến ảnh hưởng đến quy trình bào chế cách mà chế phẩm đóng gói thao tác sử dụng chế phẩm Có thể xác định tính lưu biến thơng qua máy đo tính lưu biến (rheometer) để xác định tương quan độ nhớt, lực trượt tốc độ trượt khoảng thời gian xác định 27,44 1.4.5.5 Đánh giá độ ổn định Có thể dùng phương pháp lão hoá cấp tốc sau: Thuốc theo dõi thay đổi chất lượng chu kỳ gia giảm nhiệt độ Mỗi chu kỳ gồm có: bảo quản nhiệt độ ℃ 24 giờ, bảo quản nhiệt độ 50 ℃ 24 bảo quản nhiệt độ phòng Sau chu kỳ, sản phẩm đánh giá tiêu chất lượng theo yêu cầu công nhận đạt độ ổn định khơng có thay đổi mặt chất lượng sau chu kỳ 23 1.4.5.6 Xác định pH pH ảnh hưởng đến độ nhớt tá dược tạo gel, độ ổn định hoạt chất tương thích tá dược pH chế phẩm tốt phải tương thích với pH da pH da trung bình vào khoảng 4,7 23 28 1.4.5.7 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro Buồng cho Màng lọc Buồng nhận Nhánh lấy mẫu Khuấy từ Loại đứng Buồng cho Buồng nhận Loại ngang Hình 1.8 Cấu trúc loại thiết bị xác định khả giải phóng hoạt chất Phương pháp đánh giá khả giải phóng hoạt chất tế bào Franz sử dụng phổ biến với mơ hình khuếch tán theo chiều ngang (side-by-side cell) theo chiều đứng (flow through cell) Mơ hình khuếch tán theo chiều dọc mơ hình kín (close-chamber) mơ hình mở (open-chamber) Cấu trúc thiết bị gồm hai buồng buồng cho buồng nhận ngăn màng lọc giữ chặt phận kẹp 45,46 - Buồng cho chứa chế phẩm thử nghiệm, dạng bán rắn thuốc mỡ, kem, gel cho trực tiếp lên màng lọc đặt vào thiết bị 47 - Buồng nhận dùng để chứa môi trường thử nghiệm Các điều kiện buồng nhận điều chỉnh giống điều kiện da trì suốt trình thử nghiệm: 32 ± 0,5 ℃ (dùng bể ổn nhiệt) pH 5,4 (dùng đệm phosphat pH 5,4) 22 Môi trường buông nhận phải liên tục khuấy trộn cách dùng máy khuấy từ thiết kế dạng dòng chảy liên tục 45,46 Sau khoảng thời gian định lấy mẫu dung dịch để định lượng, đồng thời bù lại đồng thể tích mơi trường thử nghiệm Cần phải lấy tối thiểu mẫu vào thời điểm 0,5 1,0 ; 2,0 ; 4,0 ; 6,0 sau bắt đầu Thử nghiệm cần lặp lại tối thiểu lần Đồ thị tốc độ giải phóng hoạt chất biểu diễn dựa vào lượng thuốc phóng thích cm2 màng lọc bậc hai thời gian 22 29 - Màng lọc sử dụng da động vật da người qua xử lý, da nuôi cấy nhân tạo dùng màng nhân tạo cellulose acetat/nitrat, polysulfon, teflon xử lý với lipid nhân tạo isopropyl mysristat để mơ tính đối kháng lớp sừng 45,46,48 Màng lọc nên ngâm môi trường thử nghiệm để hạn chế giai đoạn tiềm thời 22 30 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Gel liposome chứa cao toàn phần Rau má (Ctp-RM) 2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 2.2.1 Khảo sát quy trình bào chế đánh giá Ctp-RM Nguyên liệu, hoá chất thiết bị dùng để bào chế đánh giá Ctp-RM trình bày bảng 3.1 bảng 3.2 Bảng 2.1 Nguyên liệu, hoá chất dùng bào chế đánh giá Ctp-RM Nguyên liệu Tiêu chuẩn Xuất xứ Acetonitril-HPLC TCCS Đức Acid phosphoric-HPLC TCCS Đức Acid sulfuric 98% TCCS Việt Nam Ammoniac TCCS Việt Nam Bản mỏng silica gel MERCK GF254 TCCS Đức Bột Rau má sấy lạnh TCCS Việt Nam Cloroform TCCS Việt Nam Ethanol 96% TCCS Việt Nam Methanol-HPLC TCCS Đức n-Butanol TCCS Việt Nam Nước cất 02 lần TCCS Việt Nam TECA (39% asiaticosid) TCCS Pháp Vanillin TCCS Việt Nam Bảng 2.2 Thiết bị bào chế đánh giá Ctp-RM Thiết bị Mã số Nguồn gốc Bể siêu âm Derui DR-MH100 Trung Quốc Bếp cách thuỷ Memmert WNB29 Đức Bình ngấm kiệt nhỏ giọt Việt Nam Buồng soi UV Việt Nam 31 Bảng 2.2 Thiết bị bào chế đánh giá Ctp-RM Các dụng cụ thuỷ tinh Isolab Đức Cân phân tích số lẻ Ohaus PA2014 Mỹ Cân sấy ẩm hồng ngoại Ohaus MB-90 Mỹ Walters Mỹ Optika B192 Ý Memmert UN110 Đức Hệ thống HPLC với đầu dị PDA Kính hiển vi quang học Tủ sấy 2.2.2 Bào chế đánh giá gel liposome chứa Ctp-RM Nguyên liệu, hoá chất thiết bị dùng để bào chế đánh giá chất lượng gel liposome chứa Ctp-RM trình bày bảng 3.3 bảng 3.4 Bảng 2.3 Nguyên liệu bào chế đánh giá gel liposome chứa Ctp-RM Nguyên liệu Tiêu chuẩn Xuất xứ Cao toàn phần Rau má TCCS Việt Nam Phospholipid đậu nành TCCS Pháp Cholesterol TCCS Pháp Acetonitril-HPLC TCCS Đức Acid phosphoric-HPLC TCCS Đức Methanol-HPLC TCCS Đức Carbomer-lecithin copolymer TCCS Mỹ Diethyl ether TCCS Việt Nam Dinatri hydrophosphat TCCS Việt Nam Gôm Gellan TCCS Mỹ Isopropyl mysristat TCCS Đức Kali dihydrophosphat TCCS Việt Nam Natri carboxylmethylcellulose TCCS Việt Nam Nipagin M TCCS Việt Nam Nước cất 02 lần DĐVN Việt Nam Poloxamer 188 TCCS Trung Quốc Propylen glycol TCCS Việt Nam Tween 20 TCCS Việt Nam 32 Bảng 2.4 Thiết bị bào chế đánh giá gel liposome chứa Ctp-RM Thiết bị Mã số Nguồn gốc Bể siêu âm Derui DR-MH100 Trung Quốc Bếp cách thuỷ Memmert WNB29 Đức Các dụng cụ thuỷ tinh Isolab Đức Cân phân tích số lẻ Ohaus PA2014 Mỹ Waters Mỹ Optika B192 Ý Màng lọc Milipore 0,45 "m Merck Đức Máy cô quay chân không Buchi Đức Malvern Anh Máy đo pH Hanna HI-2211 Mỹ Máy đồng hoá Scilogex D160 Mỹ IKA CMAG-HS7 Đức Máy lắc tròn OS-350D-C Đài Loan Máy ly tâm để bàn DSC-200A-1 Đài Loan Máy vortex IKA V3-S000 Đức Hệ thống HPLC với đầu dị PDA Kính hiển vi quang học Máy đo kích thước tiểu phân Máy khuấy từ có gia nhiệt 2.3 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ CAO TOÀN PHẦN RAU MÁ (CTP-RM) 2.3.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu - Nguyên liệu: Bột Rau má sấy lạnh Quảng Thanh Công ty TNHH xuất nhập Thiên nhiên Việt - Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: § Chuyên luận “Rau má”, DĐVN (2017), trang 1299 § Chuyên luận “Centella”, EP 10 (2020), trang IV-164 § Chuyên luận “Powdered Centella asiatica Extract ”, USP 43 (2020), trang 4863 2.3.1.1 Cảm quan đánh giá vi học Lấy lượng vừa đủ bột dược liệu Rau má (qua rây f 0,5 mm) cho lên lame kính, nhỏ giọt nước cất, đậy lamelle lại di nhẹ để bột phân tán Soi kính hiển 33 vi vật kính 40X quan sát số cấu tử lông che chở, lỗ khí dị bào, tinh thể calci oxalat hình cầu gai, biểu bì, mảnh mơ mềm 11,… 2.3.1.2 Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) - Bản mỏng: Silica gel MERCK GF254 - Dung môi khai triển: Cloroform – methanol – nước (7 : : 0,5) - Dung dịch thử: Lấy 1,0 g bột dược liệu (qua cỡ rây số 250) thêm 25 mL ethanol 96% (TT), đun hồi lưu 30 phút Gạn lọc dịch chiết qua bơng đến cắn Hịa tan cắn 20 mL nước cất chiết lần với n-butanol bão hòa nước (TT), lần 15 mL Gộp dịch chiết n-butanol, rửa 15 mL nước bão hòa n-butanol (TT), bỏ lớp nước, lấy lớp n-butanol đến cắn Hịa tan cắn mL methanol (TT) để dùng làm dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Sử dụng cao Rau má chuẩn hoá (TECA) Seppic (Pháp) cung cấp, số giấy chứng nhận chất lượng sản phẩm COA0028008, có giá trị từ ngày 17/03/2022 đến ngày 16/03/2025 Hòa tan TECA methanol (TT) để dung dịch có nồng độ mg/mL - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng khoảng 5-10 "L dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, phun lên mỏng dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT) Sấy mỏng 105 ℃ đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 2.3.1.3 Độ ẩm - Yêu cầu: Không 12,0% (DĐVN 5, PL 9.6, g, 85 ℃, h) - Cách tiến hành: Sấy chén cân thủy tinh miệng rộng đáy có nắp mài làm bì đựng mẫu thử Làm khơ bì thời gian 30 phút tủ sấy 85 ℃ cân để xác định khối lượng bì mb (g) Cân xác vào bì m1 = 1,00 g bột dược liệu dàn mỏng với độ dày tối đa khoảng mm Sấy khô tủ sấy 85 ℃ 34 thời gian giờ, sau lấy làm nguội bình hút ẩm silica gel tới nhiệt độ phòng cân để xác định khối lượng m2 (g) Thực lần, lấy giá trị trung bình Xác định độ ẩm cơng thức m2 – mb × 100% H= m1 2.3.1.4 Chất chiết dược liệu - Yêu cầu: Khơng 25,0% tính theo dược liệu khơ kiệt (DĐVN 5, PL 12.10, phương pháp chiết nóng dùng ethanol 50% (TT) làm dung môi) - Cách tiến hành: Cân xác khoảng p = 2,00 g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài 100 mL Thêm xác 50 mL ethanol 50% (TT), đậy kín, cân xác định khối lượng đầu Để yên giờ, sau đun sơi nhẹ hồi lưu giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng ethanol 50% (TT) để bổ sung lại cho khối lượng xấp xỉ khối lượng ban đầu Lọc qua phễu lọc khơ vào bình hứng khơ thích hợp Lấy xác 25 mL dịch lọc vào cốc thủy tinh cân bì (mb) trước, cô cách thủy đến cắn khô sấy 105 ℃ giờ, lấy để nguội bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn (m1) - Hàm lượng chất chiết tính theo dược liệu khô ktheo công thức HL% = 50 m1 – mb × × 100% p × (1 – h%) 25 2.3.2 Bào chế Ctp-RM 2.3.2.1 Khảo sát tỷ lệ chủng loại dung mơi chiết xuất - Nhóm hoạt chất cần chiết xuất Rau má saponin triterpen có chất saponin acid (pKa ≈ 4,7) nên cần kiềm hố dung mơi chiết xuất lên khoảng pH = pKa + đơn vị để tăng hiệu Do saponin có đặc điểm tạo bọt bền với nước phân tử có cấu trúc giống chất diện hoạt, nên cần dùng dung môi có tính phá bọt ethanol để chiết xuất Ngồi ra, dịch chiết cồn dễ bảo quản dịch chiết nước khó có khả bị nhiễm khuẩn Phương pháp tién hành ngấm kiệt điều kiện thường 35 - Cân khoảng 10 gam bột dược liệu làm ẩm với đồng thể tích với dung môi ethanol 60% (lô 1), ethanol 70% (lô 2) ethanol 80% (lô 3) Tất dung môi điều chỉnh pH = với ammoniac đặc Tiến hành ngâm lạnh lơ bình ngấm kiệt rút dịch chiết với vận tốc phù hợp để thu 20 phân đoạn dịch chiết, phân đoạn rút 10 mL dịch chiết - Kiểm tra phân đoạn ; ; 10 ; 15 ; 20 lơ sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi pha động xử lý mỏng tương tự tiêu “Định tính” để xác định tỷ lệ dược liệu dung môi chiết xuất 2.3.2.2 Xác định sơ hàm lượng saponin toàn phần dịch chiết - Sử dụng phản ứng tạo tạo màu với thuốc thử vanillin-sulfuric 49 - Ở lơ dịch chiết, lấy xác mL phân đoạn gộp thành dịch chiết toàn phần Hút xác 10 mL dịch chiết tồn phần đem tới cắn Hịa tan cắn với 10 mL nước chiết với n-butanol bão hịa nước (10 mL × lần), lấy lớp nbutanol, rửa lại với 10 mL nước bão hịa n-BuOH đến cắn Hịa tan cắn với mL methanol bình định mức 10 mL Bổ sung dung môi đến vạch Hút 50 "L dung dịch 03 mẫu, cho vào ống nghiệm có nắp (đã ngâm nước lạnh), cho tiếp 0,3 mL thuốc thử vanillin 8% (kl/tt) mL dung dịch H2SO4 72% (tt/tt) Ngâm lạnh 10 phút đun cách thuỷ 80 ℃ 20 phút Làm lạnh nhanh nước đá Chuyển dịch sau phản ứng vào bình định mức 10 mL, bổ sung methanol đến vạch Đo độ hấp thu A bước sóng 558 nm Các phép đo thực lần, lấy giá trị trung bình Tiến hành mẫu trắng để hiệu chuẩn máy (auto-zero), dùng 50 "L methanol thay cho dịch chiết Hàm lượng saponin toàn phần tỷ lệ thuận với độ hấp thu mẫu thử 2.3.2.3 Bào chế Ctp-RM - Lựa chọn nồng độ ethanol tỷ lệ dược liệu : dung môi cho hiệu suất chiết tối đa - Tiến hành chiết xuất bột dược liệu để thu dịch chiết cồn Tiến hành thu hồi dung môi máy cô quay áp suất giảm đến thể chất cao lỏng (tỷ lệ 1:1 với lượng dược liệu) Cao lỏng cô cách thuỷ 80 ℃ đến thể chất cao đặc 36 - Xác định hàm ẩm cao đặc (DĐVN 5, PL 12.15): Cân xác 2,00 gam cao đặc chén cân bì có đường kính khoảng 50 mm chiều cao 30 mm(đã sấy khô xác định khối lượng bì) Thêm mL ethanol 70% (tt/tt) vào chén khuấy để hồ tan cao đặc Cơ cách thủy 80 ℃ đến cắn khô Sấy cắn 105 ℃ Để nguội bình hút ẩm silica gel 30 phút, cân để xác định khối lượng cắn Thực song song với mẫu chứng không chứa cao đặc 2.3.3 Định lượng asiaticosid Ctp-RM 2.3.3.1 Phương pháp phân tích Sắc ký lỏng hiệu cao với thông số sau: - Pha tĩnh C18 (250 × 4,6 mm, đường kính hạt nhồi "m) - Pha động H3PO4 0,3% (tt/tt) CH3CN theo chương trình gradient sau: % Pha động phút 65 phút 66 phút 76 phút H3PO4 0,3% (tt/tt) 78 45 78 CH3CN 22 55 95 22 - Điều kiện phân tích: Nhiệt độ mơi trường 25-28 ℃, độ ẩm 50-60% - Detector: UV 200 nm - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 "L - Nhiệt độ buồng cột: 35 ℃ 2.3.3.2 Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích Các mẫu thử (trừ mẫu trắng) bảo quản nhiệt độ 2-8 ℃ không sử dụng - Mẫu trắng: Dung môi pha mẫu (Methanol đạt tiêu chuẩn HPLC) - Mẫu chuẩn gốc: Cân xác khoảng 128 mg TECA (có chứa 39% asiaticosid) cho vào bình định mức 100 mL Thêm 50 mL methanol, siêu âm 10 phút Để nguội nhiệt độ phịng pha lỗng với methanol đến định mức thu dung dịch chuẩn gốc có nồng độ asiaticosid khoảng 0,50 mg/mL 37 - Mẫu đối chiếu: Lấy xác mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 mL pha lỗng với methanol đến vạch định mức thu dung dịch có nồng độ asiaticosid khoảng 0,20 mg/mL Lọc qua màng 0,45 "m, bỏ dịch lọc đầu - Mẫu thử: Cân xác khoảng 200 mg Ctp-RM cho vào bình nón nút mài 50 mL, thêm 15 mL methanol siêu âm không gia nhiệt 10 phút Gạn lấy phần dịch đem ly tâm 4000 RPM phút, thu lớp dịch Tập trung phần cắn lặp lại quy trình thêm lần Gộp dịch methanol sau ly tâm vào bình định mức 50 mL pha loãng với methanol đến định mức Lọc qua màng 0,45 "m, bỏ dịch lọc đầu 2.3.3.3 Quy trình phân tích xử lý số liệu Tiêm mẫu đối chiếu mẫu thử vào máy Hàm lượng % asiaticosid cao Rau má tính theo cơng thức: X (%) = 50 AT ×C× × 100% AC m × (100 – h) Trong đó: - AC: Diện tích pic asiaticosid sắc ký đồ mẫu đối chiếu - AT: Diện tích pic asiaticosid sắc ký đồ mẫu thử - m: Khối lượng Ctp-RM (mg) - C: Nồng độ asiaticosid có mẫu đối chiếu (mg/mL) - h: Hàm ẩm Ctp-RM 2.3.4 Thẩm định quy trình định lượng asiaticosid Ctp-RM Quy trình định lượng asiaticosid Ctp-RM thẩm định theo hướng dẫn AOAC (2019), phụ lục K 2.3.4.1 Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích - Mẫu chuẩn gốc: Chuẩn bị tương tự dung dịch chuẩn gốc phần “Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích” mục Định lượng - Mẫu thử tiêu “Độ tuyến tính”: Chuẩn bị giai mẫu T1-T6 cách pha lỗng thể tích xác dung dịch chuẩn gốc với methanol vừa đủ 10 mL theo 38 bảng 3.5 sau Dung dịch T4 có nồng độ xấp xỉ dung dịch đối chiếu phần “Định lượng” nên dùng khảo sát tiêu “Độ đặc hiệu” “Tính tương thích hệ thống” Bảng 2.5 Chuẩn bị dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính Bình định mức 10 mL Dung dịch chuẩn gốc (mL) T1 1,0 Nồng độ asiaticosid (mg/mL) 0,050 T2 2,0 0,100 T3 3,0 0,150 T4 4,0 0,200 T5 5,0 0,250 T6 6,0 0,300 - Mẫu thử tiêu “Độ xác”: Chuẩn bị lơ, lơ gồm mẫu độc lập (Dung dịch B1-B12) Cách chuẩn bị tương tự mẫu thử phần “Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích” mục Định lượng Chọn ngẫu nhiên mẫu để dùng khảo sát tiêu “Độ đặc hiệu” - Mẫu thử tiêu “Độ đúng” : Cân xác khoảng 200 mg Ctp-RM cho vào bình nón nút mài 50 mL, thêm 10 mL methanol siêu âm không gia nhiệt 10 phút Gạn lấy phần dịch đem ly tâm 4000 RPM phút, thu lớp dịch Tập trung phần cắn lặp lại quy trình thêm lần Gộp dịch methanol sau ly tâm vào bình định mức 50 mL Tiến hành thêm dung dịch chuẩn gốc vào mẫu thử mức nồng độ khác pha loãng với methanol đến định mức Ở mức nồng độ thực mẫu độc lập (Dung dịch C1-C9) Lọc qua màng 0,45 "m, bỏ dịch lọc đầu Chọn ngẫu nhiên mẫu để dùng khảo sát tiêu “Độ đặc hiệu” § Mức (40%): Thêm xác mL dung dịch đối chiếu (Mẫu C1, C2, C3) § Mức (50%): Thêm xác 10 mL dung dịch đối chiếu (Mẫu C4, C5, C6) § Mức (60%): Thêm xác 12 mL dung dịch đối chiếu (Mẫu C7, C8, C9) 39 2.3.4.2 Khảo sát tính tương thích hệ thống Sử dụng dung dịch T4 Tiến hành sắc ký lần, tính RSD thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết hệ số đối xứng pic asiaticosid RSD phải 2,0% 2.3.4.3 Khảo sát độ đặc hiệu Sử dụng dung dịch T4, mẫu B, mẫu C mẫu trắng methanol Tiến hành sắc ký mẫu lần Đánh giá tiêu chí sau: - Sắc ký đồ mẫu trắng khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng thời gian lưu asiaticosid sắc ký đồ dung dịch T4 - Trên sắc ký đồ dung dịch B dung dịch C phải xuất pic có thời gian lưu tương ứng thời gian lưu asiaticosid sắc ký đồ dung dịch T4 - Tín hiệu pic asiaticosid sắc ký đồ dung dịch C phải có gia tăng diện tích chiều cao pic so sánh với sắc ký đồ dung dịch B 2.3.4.4 Khảo sát độ tuyến tính - Tương quan nồng độ diện tích pic asiaticosid xây dựng nồng độ chuẩn nằm khoảng 0,05 – 0,30 mg/mL - Tiến hành sắc ký mẫu lần lấy kết trung bình Sử dụng phần mềm Excel để xây dựng phương trình đường chuẩn đánh giá ý nghĩa phương trình hồi quy (trắc nghiệm t trắc nghiệm F) 2.3.4.5 Khảo sát độ xác - Độ lặp lại: Sử dụng mẫu B1-B6 Tiến hành sắc ký mẫu lần Tính hàm lượng asiaticosid theo cơng thức phần định lượng - Độ xác trung gian: Sử dụng mẫu B7-B12 Tiến hành giống khảo sát độ lặp lại thay đổi ngày tiến hành - Tính RSD hàm lượng asiaticosid có mẫu thử (n = 6) toàn phép thử (n = 12) 40 2.3.4.6 Khảo sát độ - Sử dụng mẫu C1-C9 Tiến hành sắc ký mẫu lần Độ mức nồng độ thể qua mức độ thu hồi asiaticosid tính theo cơng thức: m1 – m2 × 100% R% = m3 § m1 khối lượng (mg) asiaticosid tìm thấy § m2 khối lượng (mg) asiaticosid có sẵn mẫu thử § m3 khối lượng (mg) asiaticosid thêm vào 2.4 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ LIPOSOME CHỨA CTP-RM 2.4.1 Khảo sát tạo liposome trắng 2.4.1.1 Các thông số cố định - Khối lượng pha nước (đệm phosphat pH 5,5) cho lần tiêm mẫu: 50 g - Hàm lượng Tween 20 (hoà tan vào pha dung môi hữu cơ): 0,5% (kl/kl) - Vận tốc tiêm ether: mL/phút - Tốc độ máy khuấy từ tiêm ether vào pha nước: 500 RPM - Thời gian siêu âm giảm kích thước tiểu phân: 30 phút - Ủ nhiệt 45 ℃ thời gian 30 phút 2.4.1.2 Các thơng số khảo sát Các thí nghiệm mã hố theo cơng thức XX.Y.Z.T - XX số lô tỷ lệ khối lượng phospholipid cholesterol: Khảo sát lô với hàm lượng (kl/tt) phospholipid 1% (lô 1) ; 2% (lô 2) ; 3% (lô 3) Trong lô, khảo sát tỷ lệ khối lượng phospholipid cholesterol theo tỷ lệ A (9:1) ; B (8:2) ; C (7:3) ; D (6:4) ; E (5:5) - Y thể tích (mL) pha hữu tiêm vào pha nước: Thể tích tiêm 10 mL tương ứng Y = 10 thể tích tiêm mL tương ứng Y = 05 - Z nhiệt độ (℃) phối hợp (Z = 45 60) - T thời gian (phút) khuấy trộn (T = 30 60) 41 Quy trình bào chế: Cân chất có khối lượng tương ứng theo lơ thể theo bảng 3.6 đến 3.8 vào bình nón nút mài 100 mL Thêm khoảng 25 mL diethyl ether, lắc cho tan Chuyển dung dịch sang bình đinh mức 50 mL thêm dung môi cho vừa đủ Đậy nắp lắc Bảng 2.6 Công thức bào chế pha dung môi hữu – Lô Thành phần 1A 1B 1C Phospholipid (g) 0,5000 Tween 20 (g) 0,2500 Cholesterol (g) 0,0556 0,1250 Diethyl ether 0,2143 1D 0,3333 1E 0,5000 vđ 50 mL Bảng 2.7 Công thức bào chế pha dung môi hữu – Lô Thành phần 2A 2B 2C Phospholipid (g) 1,0000 Tween 20 (g) 0,2500 Cholesterol (g) 0,1111 0,2500 Diethyl ether 0,4286 2D 0,6667 2E 1,0000 vđ 50 mL Bảng 2.8 Công thức bào chế pha dung môi hữu – Lô Thành phần 3A 3B 3C Phospholipid (g) 1,5000 Tween 20 (g) 0,2500 Cholesterol (g) 0,1667 Diethyl ether 0,3750 0,6429 3D 1,0000 3E 1,5000 vđ 50 mL 2.4.1.3 Đánh giá liposome trắng Sau khuấy trộn, mẫu liposome siêu âm 30 phút bảo quản ống nghiệm điều kiện 2-8 ℃ tối thiểu 24 Đánh giá theo tiêu sau: - Cảm quan: Không tồn mảng cholesterol lắng đọng đáy ống mẫu - Đánh giá phân bố kích thước tiểu phân: Yêu cầu PDI phải 0,50 Nếu mẫu có PDI xấp xỉ cần đánh giá thêm biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân 42 2.4.2 Bào chế liposome chứa Ctp-RM 2.4.2.1 Khảo sát công thức bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Dung dịch Ctp-RM 20% (kl/kl): Cân xác khoảng 100 g cao đặc hoà tan vào đệm phosphat pH 5,5 vừa đủ 500 g Để yên 24 điều kiện từ 2-8 ℃ để chlorophyll kết tủa gạn lấy lớp dung dịch - Các công thức đạt yêu cầu mục khảo sát liposome trắng thực lại, thay đệm phosphat pH 5,5 dung dịch Ctp-RM 20% (kl/kl) đệm phosphat pH 5,5 Sau bào chế xong, liposome bảo quản điều kiện 2-8 ℃ trước thực đánh giá tiêu bao gồm: § Chỉ số đa phân tán (PDI) zeta § Hiệu suất tải hoạt chất vào liposome 2.4.2.2 Đánh giá công thức bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Đánh giá số đa phân tán (PDI) zeta: Pha loãng mẫu (nếu cần) với đệm phosphat pH 5,5 đánh giá tương tự mẫu liposome trắng - Xác định hiệu suất tải hoạt chất vào liposome theo phương pháp sau: § Bổ sung đệm phosphat pH 5,5 vào mẫu liposome cho vừa đủ 50 mL Hút xác mL mẫu vào buồng chứa eppendorf siêu lọc có MWCO 30 kDa Ly tâm tốc độ 12.000 RPM 15 phút Chuyển buồng chứa vào bình nón nút mài 50 mL, thêm 10 mL methanol siêu âm 10 phút để phá huỷ liposome Chuyển dung dịch thu vào bình định mức 10 mL pha loãng với methanol đến vạch Lọc qua màng 0,45 "m, bỏ dịch lọc đầu § Xác định hàm lượng asiaticosid mẫu phương pháp HPLC mô tả phần định lượng asiaticosid cao Rau má Tiến hành tương tự với mẫu liposome trắng tương ứng để đánh giá ảnh hưởng thành phần cấu tạo liposome đến kết định lượng Khối lượng P (mg) asiaticosid tải vào liposome tính sau : P (mg) = AT × C × (Độ pha lỗng) × 50 AC 43 Trong đó: + AC: Diện tích pic asiaticosid sắc ký đồ mẫu đối chiếu + AT: Diện tích pic asiaticosid sắc ký đồ mẫu thử + C: Nồng độ asiaticosid có mẫu đối chiếu (mg/mL) § Hiệu suất liposome hố (EE) tính sau, với T khối lượng asiaticosid có pha nước EE = P × 100% T 2.4.2.3 Bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM Lựa chọn cơng thức có hiệu suất liposome hố cao để tiến hành bào chế liposome chứa Ctp-RM Sau bào chế xong, bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM kiểm tra PDI zeta, sau bảo quản điều kiện 2-8 ℃ trước tạo gel 2.5 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ GEL MANG LIPOSOME CHỨA CTP-RM Điều chế gel liposome cách tạo gel bổ sung thêm hệ phân tán chứa tiểu phân liposome 50 2.5.1 Khảo sát tá dược tạo gel 2.5.1.1 Công thức bào chế gel - Thành phần công thức gel gồm tá dược tạo gel phối hợp hỗn hợp dung mơi có chứa nước, chất giữ ẩm chất bảo quản: Tá dược tạo gel x% (kl/kl) Propylen glycol 15% (kl/kl) Nipagin M 0,1% (kl/kl) Nước cất vừa đủ 100% (kl/kl) - Quy trình bào chế gel nền: § Hồ tan Nipagin M vào 50% lượng nước cất thu dung dịch (1) § Phân tán tá dược tạo gel vào propylen glycol, thu hỗn dịch (2) § Thêm từ từ dung dịch (1) vào hỗn dịch (2), khuấy Thêm nước cất vừa đủ bảo quản 24 điều kiện 2-8 ℃ cho tá dược trương nở hoàn toàn 44 2.5.1.2 Khảo sát chủng loại tá dược tạo gel Các tá dược tạo gel khảo sát theo công thức bảng từ 3.9-3.12 Bảng 2.9 Công thức gel natri CMC (gel N) Công thức N1 (3%) N2 (4%) N3 (5%) N4 (6%) Tá dược N 0,60 g 0,80 g 1,00 g 1,20 g Propylen glycol 3,00 g 3,00 g 3,00 g 3,00 g Nipagin M 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,02 g Nước cất Vừa đủ 20 g Bảng 2.10 Công thức gel carbomer-lecithin copolymer (gel L) Công thức L1 (1,5%) L2 (1,75%) L3 (2%) L4 (3%) Tá dược L 0,30 g 0,35 g 0,40 g 0,60 g Propylen glycol 3,00 g 3,00 g 3,00 g 3,00 g Nipagin M 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,02 g Nước cất Vừa đủ 20 g Bảng 2.11 Công thức gel gôm Gellan (gel K) Công thức K1 (0,1%) K2 (0,15%) K3 (0,2%) K4 (0,25%) Tá dược K 0,02 g 0,03 g 0,04 g 0,05 g Propylen glycol 3,00 g 3,00 g 3,00 g 3,00 g Nipagin M 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,02 g Nước cất Vừa đủ 20 g Bảng 2.12 Công thức gel poloxamer 188 (gel P) Công thức P1 (15%) P2 (25%) P3 (35%) P4 (45%) Tá dược P 3,00 g 5,00 g 7,00 g 9,00 g Propylen glycol 3,00 g 3,00 g 3,00 g 3,00 g Nipagin M 0,02 g 0,02 g 0,02 g 0,02 g Nước cất Vừa đủ 20 g 45 2.5.1.3 Đánh giá độ ổn định gel Cân g mẫu gel cho vào ống nghiệm có nắp vặn riêng biệt Để nhiệt độ phòng tối thiểu 24 Thực chu kỳ nhiệt Ở chu kỳ, mẫu gel bảo quản ℃ 16 giờ, 50 ℃ giờ, chu liên tục Sau chu kỳ quan sát tách lớp gel 2.5.2 Bào chế gel mang liposome chứa Ctp-RM - Cân lượng bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM tương đương g TECA phối hợp với gel vừa đủ 100 g theo công thức sau: Hệ phân t liposome chứa Ctp-RM a (g) Tá dược tạo gel b (g) Propylen glycol 15 g Nipagin M 0,1 g Nước cất vừa đủ 100 g - Bảo quản gel tạo thành lọ thuỷ tinh nâu, miệng rộng nhiệt độ từ 2-8 ℃ tối thiểu 24 giờ, sau lấy mẫu để thực kiểm nghiệm 2.5.3 Đánh giá gel mang liposome chứa Ctp-RM 2.5.3.1 Cảm quan - Đánh giá mắt thường điều kiện ánh sáng khuếch tán: Sản phẩm khơng có tiểu phân thấy mắt thường - Đánh giá khả bắt dính lên da: Dùng khoảng 0,5 g gel bôi lên vùng da mu bàn tay rửa sạch, đánh giá khả dàn mỏng bám dính lên da điều kiện thường Rửa tay đánh giá khả rửa trôi gel 2.5.3.2 Độ ổn định chu kỳ nhiệt Cân g mẫu gel cho vào ống nghiệm có nắp vặn riêng biệt Để nhiệt độ phịng tối thiểu 24 Thực chu kỳ nhiệt Ở chu kỳ, mẫu gel bảo quản ℃ 16 giờ, 50 ℃ giờ, chu liên tục Sau chu kỳ quan sát tách lớp gel 46 2.5.3.3 Độ dàn mỏng Cân g mẫu gel cho vào kính, đặt kính cịn lại có khối lượng khoảng 150 g lên trên, để yên trong phút Đo đường kính d vịng trịn chế phẩm tản theo chiều vng góc lấy giá trị trung bình Thực mẫu thử độc lập Diện tích dàn mỏng (S) tính sau: (d1 + d2 )2 π (cm2 ) S= 16 2.5.3.4 pH Cân khoảng 0,5 g gel, phân tán vào nước cất vừa đủ 50 mL Xác định pH máy đo pH nhiệt độ phòng Thực mẫu thử độc lập Lặp lại phép thử lần, lần cách tối thiểu 24 lưu mẫu nhiệt độ phòng Thực tương tự với mẫu gel so sánh kết 2.5.3.5 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro Dùng tế bào Franz kiểu đứng với thông số sau: - Thể tích buồng nhận (đã có khuấy từ): 19 mL - Nhiệt độ môi trường thử: 32 ± 0,5 ℃ - Tốc độ khuấy:600-800 RPM - Lượng chế phẩm thử nghiệm:1,00 g - Màng thử: Màng cellulose acetat 0,45 "m, dày 150 "m, đường kính 25 mm - Môi trường thử nghiệm: Đệm phosphat pH 5,5 - Thời gian thử nghiệm: - Thể tích mẫu thử nghiệm: mL - Diện tích tiếp xúc màng thử mơi trường: 3,14 cm2 Quy trình tiến hành: - Màng lọc ngâm isopropyl mysristat 24 để mơ tính đối kháng lớp sừng Thấm khô dung môi gắn màng lọc vào buồng nhận tế bào Franz có mơi trường nhận khuấy từ 47 - Đặt miếng đệm cao su buồng cho lên Dùng kẹp để cố định buồng Giữ hệ thống nhiệt độ 32 ± 0,5 ℃ thời gian 30 phút để ổn định màng Kiểm tra diện bọt khí buồng nhận loại bỏ bọt khí (nếu có) - Cân khoảng 1,0 gam chế phẩm vào buồng cho trải lên màng lọc Đậy kín buồng cho màng parafin Đặt hệ thống lên máy khuấy từ có gia nhiệt có kết nối với hệ thống ổn nhiệt Vận hành máy khuấy từ tốc độ 600-800 RPM, ghi nhận thời điểm t0 - Môi trường thử nghiệm lấy mẫu giai đoạn 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 4,0 ; 6,0 tính từ thời điểm t0, sau lần lấy phải bù lại đồng thể tích mơi trường vào hệ thống Định lượng nồng độ hoạt chất theo phương pháp HPLC mô tả phần xác định hàm lượng asiaticosid Ctp-RM Hàm lượng (mg/mL) asiaticosid mẫu thử tính dựa phương trình hồi quy tương quan xây dựng phần thẩm định quy trình định lượng asiaticosid CtpRM, tiêu “Khảo sát tính tuyến tính” (Mục 2.3.4.4) - Lượng hoạt chất giải phóng cm2 (mg/cm2) diện tích tiếp xúc màng lọc môi trường thời điểm t (Qt) tính theo cơng thức sau: n-1 Qt = $Ct × Vc + % Ci × Vi & × i=1 Trong S § Ct: Nồng độ (mg/mL) hoạt chất mẫu thử thời điểm t § Vc: Thể tích (mL) buồng nhận tế bào Franz (19 mL) § Ci: Nồng độ (mg/mL) hoạt chất mẫu thử thời điểm i § Vi: Thể tích (mL) mẫu thử nghiệm (1 mL) lấy thời điểm i § S: Diện tích (cm2) tiếp xúc màng lọc môi trường (3,14 cm2) - Thử nghiệm lặp lại lần, tính giá trị QTB, độ lệch chuẩn SD sai số phép thử: e = ±T × SD √N với T = Student (N – ; ! = 0,05) Biểu diễn kết hệ trục toạ độ với trục tung QTB (mg/cm2) trục hoành thời gian t (giờ) 48 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ CTP-RM 3.1.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu 3.1.1.1 Cảm quan đánh giá vi học Hình 3.1 Cảm quan bột dược liệu Rau má sấy lạnh Bột Rau má sấy lạnh có màu xanh, mùi thơm Rây bột qua rây 0,5 mm soi vật kính 40X thấy cấu tử hình 4.2 sau Hình 3.2 Các cấu tử bột dược liệu Rau má 49 3.1.1.2 Định tính sắc ký lớp mỏng - Dựa hồ sơ kiểm định chất lượng nguyên liệu TECA cho thấy nguyên liệu có chứa 39% asiaticosid, 30% acid madecassic, 24% acid asiatic - Dựa giá trị log Pow dự đoán giá trị Rf sắc ký đồ giảm dần theo thứ tự: acid asiatic > acid madecassic > asiaticosid Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử thể hình 4.3 Acid asiatic Acid madecassic Asiaticosid Madecassosid Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn C (mẫu TECA) mẫu thử T (Dược liệu) 3.1.1.3 Độ ẩm Độ ẩm bột Rau má sấy lạnh trình bày bảng 4.1 Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm bột dược liệu Rau má STT mb m1 m2 h% 40,7401 1,0005 40,8153 7,52% 35,2967 1,0007 35,3749 7,82% 38,5632 1,0005 38,6390 7,58% Trung bình 7,64% RSD% 2,08% Kết luận: Nguyên liệu đạt tiêu chuẩn độ ẩm theo tiêu chuẩn DĐVN 50 3.1.1.4 Hàm lượng chất chiết dược liệu - Khối lượng dược liệu: 2,0008 g - Hàm ẩm dược liệu: 7,64% - Khối lượng chén cân bì: 33,3188 g - Khối lượng chén chứa cắn: 33,5982 g HL% = 50 33,5982 – 33,3188 × × 100% = 30,24% 2,0008 × (1 – 7,64%) 25 Kết luận: Nguyên liêu đạt tiêu chuẩn hàm lượng chất chiết theo tiêu chuẩn DĐVN 3.1.2 Bào chế Ctp-RM 3.1.2.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết xuất - Kết khảo sát tỷ lệ dung mơi chiết xuất trình bày hình 4.4 Dựa cường độ màu sắc ký đồ thấy phân đoạn số 15, hàm lượng chất chiết giảm đáng kể nồng độ ethanol Hình 3.4 Sắc ký đồ phân đoạn 1, 5, 10, 15, 20 chiết xuất bột Rau má - Tiến hành khảo sát cụ thể phân đoạn từ 10 đến 15 Kết trình bày hình 4.5 cho thấy tỷ lệ 1:15 cho phép chiết xuất tối đa hoạt chất (các vết có Rf từ 0,50-0,80) có nguyên liệu nồng độ ethanol 51 Hình 3.5 Sắc ký đồ phân đoạn 10-15 chiết xuất bột Rau má Kết luận: Chiết xuất bột Rau má với tỷ lệ dược liệu : dung môi 1:15 3.1.2.2 Định lượng sơ hàm lượng saponin toàn phần dịch chiết - Kết định lượng sơ hàm lượng saponin mẫu dịch chiết nồng độ ethanol khác trình bày bảng 4.2 Kết cho thấy chiết ethanol 70% thu hàm lượng saponin toàn phần cao Bảng 3.2 Kết định lượng sơ hàm lượng saponin mẫu dịch chiết Lô dịch chiết Độ hấp thu ABS558 nm Ethanol 60% Ethanol 70% Ethanol 80% Lần 0,4686 0,5909 0,4929 Lần 0,4684 0,5967 0,4948 Lần 0,4666 0,5928 0,4986 Trung bình 0,4679 0,5935 0,4954 RSD% 0,24% 0,50% 0,59% Kết luận: Lựa chọn dung mơi chiết xuất ethanol 70% kiềm hố đến pH 3.1.2.3 Bào chế Ctp-RM - Khối lượng bột dược liệu sử dụng: kg - Khối lượng cao đặc thu được: 1,1 kg với hàm ẩm 7,92 % 52 3.1.3 Định lượng asiaticosid Ctp-RM 3.1.3.1 Kết phân tích mẫu chuẩn Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu chuẩn - Khối lượng TECA cân: 0,1255 g - Nồng độ asiaticosid dung dịch chuẩn gốc: 0,4894 mg/mL - Nồng độ asiaticosid dung dịch đối chiếu: 0,1958 mg/mL - Pic asiaticosid có tR = 22,953 phút diện tích pic = 1.000.792 3.1.3.2 Kết phân tích mẫu thử Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu thử 53 - Khối lượng cao toàn phần cân: 0,1924 g = 192,4 mg - Pic asiaticosid có tR = 22,960 phút diện tích pic = 747.483 - Hàm ẩm cao toàn phần: 7,92% - Hàm lượng % asiaticosid có cao tồn phần: X (%) = 50 747.483 × 0,1957 × × 100% = 4,12 % 192,4 × (1 – 7,92%) 1.000.792 3.1.4 Thẩm định quy trình định lượng asiaticosid Ctp-RM Quy trình thẩm định theo hướng dẫn AOAC (2019), phụ lục K 3.1.4.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống Kết lần tiêm mẫu dung dịch T4 thể bảng 4.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống Số đĩa STT tR (phút) Diện tích pic lý thuyết T4.1 22,953 1.000.792 7893 Hệ số đối xứng 1,06 T4.2 22,901 1.034.005 7826 1,04 T4.3 22,752 1.012.099 7901 1,03 T4.4 22,766 976.143 7706 1,05 T4.5 22,703 1.024.716 8051 1,03 T4.6 22,723 1.019.945 8088 1,03 Trung bình 22,800 1.011.283 7911 1,04 RSD% 0,45% 2,03% 1,79% 1,22% Nhận xét: Tất giá trị RSD% thời gian lưu, số đĩa lỹ thuyết hệ số đối xứng ≤ 2% Chỉ tiêu diện tích pic có RSD = 2,03% chấp nhận Kết luận: Phương pháp phân tích đạt yêu cầu tính tương tính hệ thống 3.1.4.2 Khảo sát tính tuyến tính Chuẩn bị giai mẫu T1-T6 từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 0,4894 mg/mL Kết khảo sát độ tuyến tính thể bảng 4.4 Riêng mẫu T4 lấy kết trung bình từ bảng 4.3 54 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính tuyến tính Nồng độ Diện tích pic STT (mg/mL) (Lần 1) T1 0,0489 232.083 Diện tích pic (Lần 2) 230.827 Trung bình 231.455 T2 0,0979 506.587 500.234 503.411 T3 0,1468 780.401 791.811 786.106 T4 0,1958 - - 1.011.283 T5 0,2447 1.329.153 1.306.046 1.317.600 T6 0,2936 1.607.321 1.573.953 1.590.637 Kết xây dựng phương trình hồi quy thể tương quan nồng độ diện tích pic asiaticosid miền giá trị từ 0,0489 – 0,2936 mg/mL thể hình 4.8 Kết đánh giá ý nghĩa phương trình hồi quy thể bảng 4.5 4.6 Diện tích pic (×10³ đơn vị) 1.800 1.600 y = 5.518.165x - 39.616 R² = 0,9990 1.400 1.200 1.000 800 600 400 200 0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,2000 Nồng độ (mg/mL) 0,2500 0,3000 0,3500 Hình 3.8 Kết xây dựng phương trình hồi quy Bảng 3.5 Đánh giá ý nghĩa phương trình hồi quy (! = 0,05) df SS MS F Significance-F Regression 0,0420 0,0420 Residual 0,0000 0,0000 Total 0,0420 4101,6978 0,0000 Trắc nghiệm F: Significance-F = 0,0000 < 0,05: Phương trình hồi quy có ý nghĩa 55 Bảng 3.6 Đánh giá ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy (! = 0,05) Coefficients Standard error t-Stat P-value Hệ số b 0,0073 0,0029 2,5513 0,0632 Hệ số a 0,0000 0,0000 64,0445 0,0000 Trắc nghiệm t: - p(b) = 0,0632 > 0,05: Hệ số b khơng có ý nghĩa, lược bỏ - p(a) = 0,0000 < 0,05: Hệ số a có ý nghĩa Kết luận: Phương pháp phân tích đạt yêu cầu tính tuyến tính với miền giá trị từ 0,049 - 0,294 mg/mL, phương trình hồi quy: ŷ = 5.518.165x – 39.616, hệ số tương quan R2 = 0,9990 3.1.4.3 Khảo sát độ xác - Độ lặp lại: Kết phân tích mẫu B1-B6 thể bảng 4.7 Kết tính tốn theo kết trung bình dung dịch T4 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ lặp lại Lượng cân STT Diện tích pic (mg) T4 1.011.283 Nồng độ asiaticosid (mg/mL) 0,1957 Hàm lượng - B1 197,4 809.936 0,1567 4,31% B2 213,6 896.416 0,1734 4,41% B3 200,3 834.818 0,1615 4,38% B4 196,0 811.166 0,1569 4,35% B5 190,6 785.775 0,1520 4,33% B6 192,4 747.483 0,1446 4,08% Trung bình 4,31% RSD% 2,72% - Độ xác trung gian: Tiến hành giống khảo sát độ lặp lại với mẫu thử B7-B12 thay đổi ngày tiến hành Dung dịch chuẩn gốc dung dịch đối chiếu chuẩn bị lại với quy trình tương tự ngày Kết thể từ bảng 4.8 đến 4.10 56 Bảng 3.8 Kết định lượng mẫu đối chiếu ngày (D2) Lượng cân Nồng độ asiaticosid Thời gian lưu STT (g) (mg/mL) (phút) D2.1 0,1294 0,2019 22,867 D2.2 0,1294 0,2019 Diện tích pic 971.656 22.565 982.390 Trung bình 977.023 Bảng 3.9 Kết khảo sát độ xác trung gian Lượng cân Nồng độ asiaticosid STT Diện tích pic (mg) (mg/mL) D2 977.023 0,2019 Hàm lượng - B7 199,7 745.739 0,1541 4,19% B8 203,0 803.529 0,1660 4,44% B9 207,7 774.796 0,1601 4,19% B10 191,5 679.498 0,1404 3,98% B11 205,6 776.397 0,1604 4,24% B12 211,2 795.447 0,1644 4,23% Trung bình 4,21% RSD% 3,49% Bảng 3.10 Kết so sánh độ xác hàm lượng asiaticosid (! = 0,05) Hàm lượng asiaticosid STT Ngày thứ Ngày thứ Hàm lượng trung bình 0,0431 0,0421 RSD% (n = 6) 2,72% 3,49% RSD% (n = 12) 3,21% P(F ≤ f) one-tail 0,3157 P(T ≤ t) two-tail 0,2299 - Phép kiểm F: Giá trị P = 0,3157 > 0,05: Phương sai hai mẫu không khác - Phép kiểm t: Giá trị P = 0,2299 > 0,05: Giá trị hàm lượng trung bình asiaticosid lơ khơng có khác biệt 57 Theo hướng dẫn AOAC (2019), với mức nồng độ từ 0,01% (0,1 mg/mL) đến 0,1% (1 mg/mL), giá trị RSD% nằm khoảng từ 3-4% Kết luận: Phương pháp phân tích đạt yêu cầu độ xác với độ lặp lại (RSD = 2,72%) độ xác trung gian (RSDn=6 = 3,49% ; RSDn=12 = 3,21%), đáp ứng theo yêu cầu AOAC 3.1.4.4 Khảo sát độ - Kết phân tích mẫu C1-C9 thể từ bảng 4.11 đến 4.12 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ Khối lượng (mg) Lượng cân m2 asiaticosid STT (mg) (mg) thêm vào C1 218,7 9,424 1,615 Diện tích pic m1 (mg) 1.067.172 11,026 C2 223,9 9,648 1,615 1.089.603 11,258 C3 216,9 9,348 1,615 1.073.038 11,087 C4 250,4 10,791 2,019 1.256.475 12,982 C5 252,8 10,897 2,019 1.257.256 12,990 C6 246,7 10,635 2,019 1.237.840 12,790 C7 229,5 9,893 2,422 1.193.317 12,330 C8 237,4 10,233 2,422 1.236.277 12,774 C9 259,0 11,162 2,422 1.330.609 13,748 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ C1 m1 – m2 (mg) % thu hồi C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 1,602 1,610 1,739 2,191 2,093 2,155 2,437 2,541 2,586 99% Trung bình 100% 108% 109% 104% 107% 101% 105% 107% 102% 106% 104% Theo hướng dẫn AOAC (2019), với mức nồng độ từ 0,01% (0,1 mg/mL) đến đươi 0,1% (1 mg/mL), giá trị độ thu hồi nằm khoảng từ 90-108% Kết luận: Phương pháp phân tích đạt yêu cầu độ theo yêu cầu AOAC 58 3.1.4.5 Khảo sát tính đặc hiệu - Sắc ký đồ mẫu trắng khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng thời gian lưu asiaticosid toàn sắc ký đồ dung dịch T4 thực phần khảo sát “Tính tương thích hệ thống” Hình 3.9 Các sắc ký đồ dung dịch T4 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng (Methanol) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 59 - Tín hiệu pic asiaticosid sắc ký đồ dung dịch B6 có thời gian lưu 22,960 phút, diện tích pic 747.483 chiều cao pic 20.485 "V - Tín hiệu pic asiaticosid sắc ký đồ dung dịch C8 có thời gian lưu 22,517 phút, diện tích pic 1.236.277 chiều cao pic 34.318 "V - Tất pic asiaticosid đạt yêu cầu độ tinh khiết Kết luận: Phương pháp phân tích đạt yêu cầu độ đặc hiệu Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch B6 Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch C8 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 60 3.2 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ LIPOSOME CHỨA CTP-RM Giá mang liposome đề tài bào chế phương pháp tiêm ether 3.2.1 Khảo sát tạo liposome trắng - Trong công thức liposome trắng, có cơng thức đạt u cầu gồm có: 1B.05.60.30, 1C.10.45.60, 1C.10.60.30, 2B.10.45.30, 3B.05.45.30, 3B.10.45.30 - Giá trị PDI zeta liposome trắng đệm phosphat pH 5,5 (PBS 5,5) thể bảng 4.13 Bảng 3.13 Kết đánh giá PDI zeta mẫu liposome trắng Công thức Thế zeta (mV) Lần Lần Lần Kích thước giọt trung bình (nm) PDI PBS 5,5 -9,3 -9,9 -10,3 - - 1B.05.60.30 -9,8 -8,5 -10,8 460,6 0,320 1C.10.45.60 -8,8 -10,2 -8,8 411,0 0,351 1C.10.60.30 -10,6 -7,8 -9,3 467,5 0,330 2B.10.45.30 -10,4 -10,8 -9,9 411,1 0,329 3B.05.45.30 -8,9 -10,2 -10,4 449,9 0,369 3B.10.45.30 -10,8 -9,3 -10,6 494,7 0,313 3.2.2 Bào chế liposome chứa Ctp-RM 3.2.2.1 Bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Công thức bào chế pha hữu trình bày bảng 4.14 Bảng 3.14 Cơng thức bào chế pha dung môi hữu Thành phần 1B 1C 2B 3B Phospholipid (g) 0,5050 0,5021 1,0042 1,5056 Tween 20 (g) 0,2503 0,2505 0,2508 0,2501 Cholesterol (g) 0,0559 0,1254 0,2143 0,3338 Diethyl ether vđ 50 mL - Dung dịch Ctp-RM 20% (kl/tt): Hoà tan 100 g cao đặc vào dung dịch đệm phosphat pH 5,5 vừa đủ 500 g Để yên 24 điều kiện từ 2-8 ℃ để chlorophyll kết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 61 tủa gạn lấy lớp dung dịch Hàm lượng asiaticosid dung dịch cao toàn phần 0,852% (kl/kl) - Tiêm pha hữu vào 50 g dung dịch Ctp-RM 20% (kl/kl) với tốc độ điều kiện tương ứng với công thức Sau bào chế xong, bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM bảo quản điều kiện 2-8 ℃ trước thực đánh giá tiêu Phospholipid ; Cholesterol ; Tween 20 hoà tan diethyl ether Cao toàn phần Rau má 20% hoà tan PBS pH 5,5 Tiêm pha hữu vào pha nước (5 mL/phút) Khuấy từ 500 RPM tạo hệ phân tán liposome Siêu âm không gia nhiệt, 30 phút Ủ bể điều nhiệt 45 oC, 30 phút Bảo quản chai thuỷ tinh 2-8 oC Hình 3.13 Lưu đồ bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM 3.2.2.2 Đánh giá bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Hình 4.14 mơ tả sắc ký đồ mẫu placebo (chỉ chứa liposome trắng 1B.05.60.30) sau xử lý tương tự với mẫu bán thành phẩm khơng xuất pic có thời gian lưu tương ứng thời gian lưu asiaticosid cho thấy tá dược không gây ảnh hưởng lên kết định lượng asiaticosid mẫu thử - Pha loãng 20 lần bán thành phẩm liposome tải Ctp-RM với đệm phosphat pH 5,5, xác định PDI zeta mẫu So sánh với dung dịch Ctp-RM 1% đệm phosphat pH 5,5 (Ctp-RM 1%) Kết thể bảng 4.15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 62 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu placebo (giá mang 1B.05.60.30) Bảng 3.15 Kết PDI zeta mẫu liposome chứa Ctp-Rm Thế zeta (mV) Lần Lần Lần Kích thước giọt trung bình (nm) Ctp-RM 1% -10,3 -10,9 -11,3 - - 1B.05.60.30 -11,6 -11,8 -12,0 549,9 0,384 1C.10.45.60 -10,8 -10,3 -10,6 327,3 0,575 1C.10.60.30 -9,5 -10,0 -9,2 389,5 0,556 2B.10.45.30 -10,2 -10,9 -10,9 361,4 0,449 3B.05.45.30 -12,0 -12,3 -13,5 393,0 0,531 3B.10.45.30 -11,8 -11,3 -12,6 495,8 0,411 Công thức PDI Bảng 3.16 Khả tải hoạt chất mẫu liposome Cơng thức Diện tích pic P (mg) T (mg) EE% Mẫu đối chiếu 977.023 - - - 1B.05.60.30 140.538 7,260 426 1,7% 1C.10.45.60 184.249 9,519 426 2,2% 1C.10.60.30 170.144 8,790 426 2,1% 2B.10.45.30 165.910 8,571 426 2,0% 3B.05.45.30 188.929 9,760 426 2,3% 3B.10.45.30 159.817 8,256 426 1,9% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 3.2.2.3 Bào chế bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Nhận xét: Công thức 3B.05.45.30 cho hiệu suất tải hoạt chất cao (2,3%) lựa chọn để thực bào chế 200 g bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Công thức bào chế 50 mL pha hữu Phospholipid 1,500 g Cholesterol 0,375 g Tween 20 0,250 g Diethyl ether vđ 50 mL - Bào chế 250 g pha nước dung dịch Ctp-RM 20% (kl/kl): Hoà tan 50 g cao đặc vào dung dịch đệm phosphat pH 5,5 vừa đủ 250 g Để yên 24 điều kiện từ 2-8 ℃ để chlorophyll kết tủa gạn lấy lớp dung dịch - Quy trình bào chế: Tiêm 20 mL pha hữu vào 200 g dung dịch Ctp-RM 20% (kl/kl) với tốc độ mL/phút, đồng hoá máy khuấy từ tốc độ 500 RPM, nhiệt độ 45 ℃ thời gian 30 phút Siêu âm giảm kích thước 30 phút ủ nhiệt 45 ℃ 30 phút Bổ sung đệm phosphat pH 5,5 cho vừa đủ khối lượng khoảng 200 g Lưu mẫu 2-8 ℃ 24 kiểm nghiệm bán thành phẩm: § Cảm quan: Hệ phân tán không bị lắng cặn hay tách lớp sau 24 sau ngày § Giá trị zeta xác định sau lần đo là: -11,3 ; -10,1 ; -11,7 mV § Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân thể hình 4.15 D1 = 749,5 nm (88,5%) D2: 97,54 nm (11,5%) DTB = 422,8 nm PDI = 0,473 Hình 3.15 Phân bố KTTP bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 64 3.3 BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ GEL MANG LIPOSOME CHỨA CTP-RM 3.3.1 Khảo sát tá dược tạo gel - Tá dược N § Tá dược N phân tán tốt propylen glycol trương nở nhanh tiếp xúc với nước nhiệt độ phịng Cả cơng thức cho gel trong, độ nhớt cao (nhiều bọt khí tồn gel) ổn định qua chu kỳ nhiệt § Gel N2, N3 N4 chất q thơ Gel N1 cho thể chất mềm mịn nên phù hợp để bơi da có pH trung bình 25 ℃ 6,35 ± 0,01 - Tá dược L § Tá dược L phân tán tốt trương nở propylen glycol tạo hỗn hợp sệt, màu trắng ngà Ngày thêm nước, tá dược tiếp tục trương nở nhiệt độ phịng Cả cơng thức cho gel đục ổn định qua chu kỳ nhiệt § Gel L1, L2 chất lỏng, gel L3 chất sánh Các cơng thức L1, L2, L3 khó bắt dính lên da Gel L4 cho thể chất phù hợp để bơi da có pH trung bình 25 ℃ 6,05 ± 0,01 - Tá dược K § Tá dược K phân tán tốt propylen glycol trương nở chậm nước nhiệt độ phòng nên cần phải ủ bể ổn nhiệt 80 ℃ khuấy đến tá dược trương nở Cả công thức cho gel đục ổn định qua chu kỳ nhiệt § Gel K1, K2 chất lỏng Gel K4 cho thể chất đặc đồng Gel K3 chất phù hợp để bơi da có pH trung bình 25 ℃ 6,16 ± 0,01 - Tá dược P § Do lượng tá dược tạo gel sử dụng nhiều nên với công thức này, propylen glycol nipagin M hồ tan vào nước Sau thêm dần tá dược vào hỗn hợp khuấy Các công thức P1, P2, P3 cho gel trong, gel P4 có màu trắng đục Cả cơng thức ổn định qua chu kỳ nhiệt § Cơng thức P1, P2 cho gel lỏng, công thức P4 cho gel đặc đồng Gel P3 chất phù hợp để bơi da có pH trung bình 25 ℃ 6,54 ± 0,01 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 Kết luận: Chọn công thức N1 (3% tá dược N), L4 (3% tá dược L), K3 (0,2% tá dược K) ; P3 (35% tá dược P) để tiếp tục bào chế gel liposome: 3.3.2 Bào chế gel mang liposome chứa Ctp-RM - Cao toàn phần chứa 4,26% (kl/kl) asiaticosid, tương đương 10,92% so với nguyên liệu TECA Để có hàm lượng asiaticosid tương đương g TECA cần dùng 9,16 g Ctp-RM, tương đương 45,8 g bán thành phẩm chứa hệ phân tán liposome - Công thức bào chế 100 g gel chứa liposome chứa Ctp-RM với loại tá dược trình bày bảng 4.17 Bảng 3.17 Cơng thức bào chế 100 g gel liposome chứa Ctp-RM Công thức gel liposome ĐVT Rm-N1 Rm-L4 Rm-K3 Rm-P3 Hệ phân tán liposome chứa Ctp-RM g 45,8 45,8 45,8 45,8 Propylen glycol g 15 15 15 15 Tá dược tạo gel g 3 0,2 35 Nipagin M g 0,1 0,1 0,1 0,1 Nước cất g 36,1 36,1 38,9 4,1 - Lưu đồ bào chế 100 g gel chứa liposome Rau má trình bày hình 4.16 Tá dược N, L, K Propylen glycol Nước cất Ủ 2-8 oC/24 Ủ 2-8 oC/24 Ủ 80 oC/3 Gel N Gel L Gel K Tá dược P Bán thành phẩm hệ phân tán liposome chứa Ctp-RM + Nipagin M Gel Rm-N1 Gel Rm-L4 Gel Rm-K3 Nước cất Propylen glycol Gel Rm-P3 Hình 3.16 Lưu đồ bào chế gel liposome chứa Ctp-RM Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 3.3.3 Đánh giá gel mang liposome chứa Ctp-RM 3.3.3.1 Cảm quan - Công thức Rm-N1: Gel màu xanh đậm, trong, có nhiều bọt khí, thể chất mềm mịn, dễ bắt dính lên da có độ dàn mỏng tốt Sau phút cảm giác trơn nhờn không khô Khi rửa với nước tạo cảm giác nhớt - Công thức Rm-L4: Gel màu xanh đậm, mờ, thể chất mềm mịn, dễ bắt dính lên da có độ dàn mỏng tốt Sau phút khơng cịn cảm giác trơn nhờn da Khi rửa với nước không tạo cảm giác nhớt - Công thức Rm-K3: Sau 24 bảo quản 2-8 ℃, gel bị chảy lỏng lắng cặn - Công thức Rm-P3: Gel màu xanh đậm, trong, thể chất lỏng sánh, dễ bắt dính lên da có độ dàn mỏng tốt Sau phút cịn cảm giác trơn nhờn khơng khô ráo, tăng lực ma sát tạo thành lớp màng mỏng màu trắng da Khi rửa với nước không tạo cảm giác nhớt Kết luận: Công thức Rm-K2 không đạt yêu cầu cảm quan nên phải đánh giá lại Lựa chọn công thức gel Rm-N1, Rm-L4 Rm-P3 để tiếp tục thí nghiệm sau 3.3.3.2 Độ dàn mỏng Kết độ dàn mỏng gel liposome Ctp-RM trình bày bảng 4.18 Bảng 3.18 Kết đánh giá độ dàn mỏng gel liposome Công thức Lần Lần Lần Stb (cm2) Gel Rm-N1 Gel Rm-L4 Gel Rm-P3 d1 (cm) 5,7 6,2 7,7 d2 (cm) 5,7 6,1 7,7 S (cm2) 25,50 29,69 46,54 d1 (cm) 5,8 6,2 7,5 d2 (cm) 5,9 6,3 7,6 S (cm2) 26,86 30,66 44,75 d1 (cm) 5,7 6,2 7,8 d2 (cm) 5,8 6,2 7,7 S (cm2) 25,95 30,18 47,15 26,11 ± 0,40 30,18 ± 0,28 46,15 ± 0,72 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 67 3.3.3.3 Độ ổn định chu kỳ nhiệt Cả công thức gel Rm-N1, Rm-L4 Rm-P3 ổn định qua chu kỳ nhiệt 3.3.3.4 pH Kết đánh giá pH 25 ℃ gel Rm-N1, Rm-L4 Rm-P3 trình bày bảng 4.19 Bảng 3.19 Kết đánh giá pH gel liposome Công thức Gel Rm-N1 Gel Rm-L4 Gel Rm-P3 Ngày 5,99 5,93 5,98 6,10 6,02 6,02 5,77 5,94 5,86 Ngày 6,09 6,10 5,96 5,93 5,98 5,91 5,95 5,71 5,84 Ngày 6,06 6,13 6,02 6,04 6,03 6,09 5,81 5,85 5,86 6,03 ± 0,01 Trung bình 6,01 ± 0,01 5,84 ± 0,01 3.3.3.5 Đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro - Kết đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro chế phẩm trình bày hình 4.17 0,1800 0,1600 0,1400 Q (mg/cm²) 0,1200 0,1000 0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 0,0000 0,5 1,0 2,0 4,0 6,0 Thời gian (giờ) Rm-N1 Rm-L4 Rm-P3 Hình 3.17 Khả phóng thích hoạt chất in vitro gel liposome - Nồng độ mẫu thử tính dựa phương trình hồi quy xây dựng phần 3.1.4.2 Kết tính tốn trình bày chi tiết bảng 4.20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 Bảng 3.20 Kết đánh giá khả giải phóng hoạt chất in vitro gel liposome Thời điểm lấy mẫu 0,5 Gel Rm-N1 Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Spic 597 857 4.122 4.509 3.365 3.420 2.021 2.872 C0,5 0,0072 0,0073 0,0073 0,0079 0,0080 0,0078 0,0078 0,0075 0,0077 0,0440 ± 0,0012 1.542 1.721 15.204 12.904 17.560 9.443 9.684 7.925 C1,0 0,0074 0,0075 0,0075 0,0099 0,0095 0,0104 0,0089 0,0089 0,0086 0,0474 ± 0,0008 0,0627 ± 0,0064 0,0558 ± 0,0027 Spic 8.315 6.898 9.223 32.341 28.235 41.986 22.599 20.051 24.329 C2,0 0,0087 0,0084 0,0089 0,0130 0, 123 0,0148 0,0113 0,0108 0,0116 0,0547 ± 0,00132 0,0841 ± 0,0196 0,0707 ± 0,0060 Spic 17.230 14.073 19.629 36.897 44.846 53.954 34.438 26.437 29.667 C4,0 0,0103 0,0097 0,0107 0,0139 0,0153 0,0170 0,0134 0,0120 0,0126 QTB-4,0 ± SD 6,0 0,0465 ± 0,0019 1.125 QTB-2,0 ± SD 4,0 0,0478 ± 0,0016 Spic QTB-1,0 ± SD 2,0 Gel Rm-P3 Lần QTB-0,5 ± SD 1,0 Gel Rm-L4 0,0648 ± 0,0078 0,0973 ± 0,0242 0,0801 ± 0,0113 Spic 39.130 32.831 44.699 60.424 72.832 85.624 64.526 55.989 74.417 C6,0 0,0143 0,0131 0,0153 0,0181 0,0204 0,0227 0,0189 0,0173 0,0207 QTB-6,0 ± SD Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 0,0893 ± 0,0166 0,1283 ± 0,0355 0,1187 ± 0,0257 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 Kết luận: - Các cơng thức có khả giải phóng hoạt chất in vitro điều kiện thí nghiệm Phân tích ANOVA yếu tố thời điểm 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 4,0 ; 6,0 cho thấy khả giải phóng hoạt chất công thức gel Rm-N1, Rm-L4 Rm-P3 khác có ý nghĩa thống kê mức tin cậy ! = 0,05 Kết trình bày bảng 4.21 Bảng 3.21 Giá trị p (! = 0,05) Qt gel liposome thời điểm Thời điểm lấy mẫu 0,5 Q0,5 Gel Rm-N1 Gel Rm-L4 Gel Rm-P3 Lần 0,0434 0,0480 0,0466 Lần 0,0441 0,0471 0,0457 Lần 0,0444 0,0484 0,0472 p-value 1,0 Q1,0 0,0009 Lần 0,0474 0,0626 0,0562 Lần 0,0470 0,0601 0,0545 Lần 0,0477 0,0652 0,0565 p-value 2,0 Q2,0 0,0001 Lần 0,0549 0,0821 0,0711 Lần 0,0534 0,0774 0,0682 Lần 0,0559 0,0928 0,0730 p-value 4,0 Q4,0 0,0009 Lần 0,0651 0,0968 0,0796 Lần 0,0616 0,0878 0,0759 Lần 0,0678 0,1073 0,0849 p-value 6,0 Q6,0 0,0026 Lần 0,0896 0,1282 0,1182 Lần 0,0825 0,1141 0,1086 Lần 0,0959 0,1427 0,1293 p-value Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 0,0112 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 70 - Tá dược L có nhiều ưu điểm khác so với tá dược lại khác tạo gel có khả dàn mỏng tốt, khơng tạo cảm giác trơn nhờn da, có pH phù hợp với pH sinh lý da đề nghị lựa chọn tá dược L để tiến hành nghiên cứu khác có nhiều tiềm sản xuất dạng bào chế bán rắn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 BÀO CHẾ CTP-RM Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phụ thuộc tính khả thi mặt kinh tế mục tiêu chiết Một số điểm khác biệt quy trình chiết xuất Rau má theo phương pháp ngấm kiệt liệt kê bảng 4.22 đây, thể tích dung mơi dùng thí nghiệm 100 mL 51-54 Bảng 4.1 Một số điều kiện chiết xuất Rau má phương pháp ngấm kiệt STT Các thơng số quy trình chiết xuất Hợp chất chiết xuất Ethanol 95% ; 60 ℃ ; 120 phút Khối lượng dược liệu: 20 g Madecassosid, asiaticosid Acid asiatic, acid madecassic Nước, ethanol, methanol, tsôi, Khối lượng dược liệu: g Asiaticosid Acid asiatic Methanol ; 66 ℃ ; Khối lượng dược liệu: 10 g Phenolic Saponin Ethanol 80% (tt/tt) ; nhiệt độ phòng ; 24 Phenolic Khối lượng dược liệu: g Saponin Ethanol tuyệt đối ; nhiệt độ phòng ; 24 Khối lượng dược liệu: 2-20 g Saponin Ethanol 95% (tt/tt), nhiệt độ phòng ; 72 Khối lượng dược liệu (đã sấy 35-40 ℃ ngày): 33 g, chiết lần Saponin Ethanol 70% ; nhiệt độ phòng ; 24 Khối lượng dược liệu: 1-10 g Dùng máy lắc rung 200 RPM Saponin Điều chế cao thuốc thường gồm giai đoạn điều chế dịch chiết, loại tạp chất dịch chiết (nếu cần), cô đặc làm khô để đưa dịch chiết đến thể tích định, điều chỉnh hàm lượng hoạt chất cao 23 Dược liệu để điều chế cao thuốc thường dược liệu khô, phân chia thành bột có kích thước 0,2 – mm tùy theo loại dược liệu dung môi Dung môi chiết xuất chọn tùy theo chất hoạt chất, tạp chất dược liệu tùy theo phương pháp chiết Với dung mơi nước, áp dụng phương pháp ngâm lạnh, hầm, hãm, sắc Với dung môi ethanol thường áp dụng phương pháp ngấm kiệt, ngâm lạnh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 72 Trong sản xuất lớn, áp dụng phương pháp ngấm kiệt cải tiến ngấm kiệt phân đoạn Quá trình loại tạp chất thường gắn liền với q trình đặc dịch chiết Cơ đặc dịch chiết giai đoạn có ảnh hưởng đến hoạt chất chất lượng cao Các nguyên tắc cô nhiệt độ thấp tốt, thời gian cô nhanh tốt, dung môi thu hồi tối đa để tránh gây nhiễm mơi trường Có thể bếp cách thủy dụng cụ có bề mặt bốc rộng bát sứ, khay men, chảo rộng miệng,… Trong cô, cần khuấy trộn để tránh tạo váng bề mặt cản trở bay Dược điển Việt Nam V quy định cô đặc sấy khô dịch chiết thiết bị áp suất giảm nhiệt độ không 60 ℃ Nếu khơng có thiết bị đặc sấy áp suất giảm phép cách thủy sấy nhiệt độ không 80 ℃ Cao thuốc phải tiêu chuẩn hóa mặt lý, hóa nhằm làm cho chất lượng tác dụng trị liệu đồng với tất lô mẻ sản xuất 23 Để xác định điều kiện bào chế Ctp-RM, nghiên cứu thiết kế sau: - Kiểm nghiệm nguyên liệu: Đạt tiêu chuẩn theo DĐVN (định tính, hàm ẩm, hàm lượng chất chiết được) Dược điển Châu Âu 10 (vi học) - Điều kiện chiết xuất: Ngấm kiệt điều kiện thường - Dung môi chiết xuất: Những dung môi hữu thường dùng ethanol, methanol, hay hỗn hợp cồn-nước sử dụng phổ biến Nghiên cứu lựa chọn ethanol khảo sát nồng độ 60 – 70 – 80% (tt/tt) Tất dung mơi kiềm hố đến pH = với ammoniac đặc saponin triterpen Rau má saponin acid (pKa ≈ 4,7) Nghiên cứu lựa chọn sử dụng tác nhân kiềm hố ammoniac dễ dàng loại bỏ q trình bào chế Tuy nhiên không nên điều chỉnh pH > để hạn chế phản ứng thuỷ phân ester saponin Rau má pseudoglycosid (phần đường liên kết với phần genin thông qua liên kết ester) - Tỷ lệ dược liệu : dung môi lựa chọn sắc ký lớp mỏng với điều kiện tiến hành quy định chuyên luận “Rau má” DĐVN Chủng loại dung môi lựa chọn khả chiết xuất hàm lượng cao saponin toàn phần, thể qua cường độ tạo màu với thuốc thử vanillin-sulfuric xác định máy quang phổ UV-Vis Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 73 - Hàm lượng asiaticosid đánh giá phương pháp HPLC, sử dụng chất đối chiếu cao Rau má chuẩn hố (TECA) có chứa 39% (kl/kl) asiaticosid Chất đánh dấu chọn asiaticosid saponin quan trọng dược liệu Rau má Mặt khác sắc ký đồ mẫu đối chiếu, pic asiaticosid có độ phân giải độ tinh khiết đạt yêu cầu Phương pháp định lượng thẩm định theo hướng dẫn AOAC (2019) - Dịch chiết cồn cô quay chân không đến thể chất cao lỏng cô cách thuỷ 80℃ đến đạt thể chất cao đặc Kết nghiên cứu bào chế 1,1 kg cao đặc từ kg bột dược liệu với hàm ẩm cao đặc 7,92 % 4.2 KHẢO SÁT CÔNG THỨC BÀO CHẾ LIPOSOME TRẮNG Nghiên cứu khảo sát 120 công thức bào chế liposome trắng với thí nghiệm mã hố theo cơng thức XX.Y.Z.T - XX số lô tỷ lệ khối lượng phospholipid cholesterol: Khảo sát lô với hàm lượng (kl/tt) phospholipid 1% (lô 1) ; 2% (lô 2) ; 3% (lô 3) Trong lô, khảo sát tỷ lệ khối lượng phospholipid cholesterol theo tỷ lệ A (9:1) ; B (8:2) ; C (7:3) ; D (6:4) ; E (5:5) - Y thể tích (mL) pha hữu tiêm vào pha nước: Thể tích tiêm 10 mL tương ứng Y = 10 thể tích tiêm mL tương ứng Y = 05 - Z nhiệt độ (℃) phối hợp (Z = 45 60) - T thời gian (phút) khuấy trộn (T = 30 60) Sau khuấy trộn, mẫu liposome siêu âm 30 phút bảo quản ống nghiệm điều kiện 2-8 ℃ tối thiểu 24 Tiến hành khảo sát hình thái phân bố kích thước tiểu phân theo tiêu sau: - Cảm quan: Không tồn mảng cholesterol lắng đọng đáy ống mẫu - Đánh giá phân bố kích thước tiểu phân: Yêu cầu PDI phải 0,50 Nếu mẫu có PDI xấp xỉ cần đánh giá thêm biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân Kết thu có 16 cơng thức thỗ mãn u cầu cảm quan có công thức thảo mãn hai yêu cầu Kết khảo sát được trình bày cụ thể sau Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 4.2.1 Thống kê theo lô 25 20 15 10 Không tách pha Tách pha < 0,05 mL Tách pha đến 0,5 mL L1 L2 Tách pha đến mL Tách pha > mL L3 Hình 4.1 Kết khảo sát liposome trắng theo hàm lượng phospholipid Nhận xét: Đa số công thức bị tách pha mức độ 0,5 mL Sự tách pha có gia tăng tăng nồng độ phospholipid 2% (kl/tt) (lô L2) 3% (kl/tt) (lô L3) pha hữu so với nồng độ 1% (lô L1) 4.2.2 Thống kê theo tỉ lệ phospholipid cholesterol 18 16 14 12 10 Không tách pha Tách pha < 0,05 mL Tách pha đến 0,5 mL A B C D Tách pha đến mL Tách pha > mL E Hình 4.2 Kết khảo sát liposome trắng theo tỉ lệ PL cholesterol Nhận xét: Đa số công thức bị tách pha mức độ 0,5 mL Sự tách pha xảy không lô Kết cho thấy tỉ lệ khối lượng 9:1 5:5 phospholipid cholesterol không phù hợp nên tất công thức bị tách pha Tỉ lệ 8:2 7:3 khối lượng phù hợp với tỷ lệ công thức bị tách pha 67% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 75 4.2.3 Thống kê theo thể tích tiêm mẫu 35 30 25 20 15 10 Không tách pha Tách pha < 0,05 mL Tách pha đến 0,5 mL Tiêm mL Tách pha đến mL Tách pha > mL Tiêm 10 mL Hình 4.3 Kết khảo sát liposome trắng theo thể tích tiêm mẫu Nhận xét: Khi sử dụng 10 mL pha hữu (tỷ lệ 1:5 so với pha nước) tỷ lệ tách pha cao tỷ lệ 1:10 Nhưng tỷ lệ tách pha 0,05 mL chiếm đa số nên cần phải dựa khảo sát khác tốc độ, nhiệt độ thời gian khuấy trộn để đánh giá xác 4.2.4 Thống kê theo nhiệt độ khuấy trộn 30 25 20 15 10 Không tách pha Tách pha < 0,05 mL Tách pha đến 0,5 mL 45 ºC Tách pha đến mL Tách pha > mL 60 ºC Hình 4.4 Kết khảo sát liposome trắng theo nhiệt độ đồng hoá Nhận xét: Nhiệt độ đồng hoá phương pháp phân tán dung môi phải phù hợp với nhiệt độ sôi dung môi (ts diethyl ether 34,6 ℃) Khi đồng hố nhiệt độ cao (60 ℃) thì tỷ lệ tách pha cao ether loại bỏ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 76 khỏi pha nước với tốc độ nhanh nên phân tán chưa kịp xảy ra, kích thước tiểu phân lớn nên dễ bị kết tập 4.2.5 Thống kê theo thời gian khuấy trộn 30 25 20 15 10 Không tách pha Tách pha < 0,05 mL Tách pha đến 0,5 mL 30 phút Tách pha đến mL Tách pha > mL 60 phút Hình 4.5 Kết khảo sát liposome trắng theo thời gian khuấy trộn Nhận xét: Khi tăng thời gian khuấy trộn khác lô mức độ tách pha 0,05 mL không đáng kể Cần phải dựa khảo sát khác tốc độ, nhiệt độ thời gian khuấy trộn để đánh giá xác Kết luận - Tỉ lệ phối hợp phospholipid cholesterol 8:2 7:3 Tỉ lệ phối hợp pha hữu pha nước 1:10 Nhiệt độ phối hợp pha 45 ℃ Thời gian phối hợp 45 phút - Hệ phân tán liposome tạo thành zeta tương tự đệm PBS 5,5 nên dự đốn tiểu phân khơng mang điện tích Các hệ phân tán có giá trị tuyệt đối zeta khoảng 30-60 mV xem bền vững Tuy nhiên với công thức đạt yêu cầu cảm quan giá trị PDI khơng xuất hiện tượng kết tách pha ngày thứ 7, 14, 21 28 ngày sau bào chế, công thức bảo quản 2-8 ℃ suốt thời gian thử nghiệm 4.3 BÀO CHẾ BÁN THÀNH PHẨM LIPOSOME CHỨA CTP-RM - Tiểu phân liposome có sử dụng chất diện hoạt cấu trúc cịn gọi transfersome Asiaticosid có khả thấm qua da thấp trọng lượng phân tử Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 lớn nên tải vào hệ transfersome với mục đích tăng khả thấm qua da Các transfersome sau bào chế đánh giá hiệu tải hoạt chất kích thước tiểu phân Các cơng thức có khả tải hoạt chất tốt đưa vào cơng thức gel, sau tiến hành đánh giá gel - Kết đánh giá (! = 0,05) đặc điểm hoá lý trước sau tải hoạt chất vào transferosome tạo thành cho thấy việc tải hoạt chất vào tiểu phân không làm thay đổi nhiều kích thước (p-value = 0,445) Yếu tố thay đổi có ý nghĩa thống kê phân bố kích thước tiểu phân, thể qua số PDI (p-value = 0,001) zeta tiểu phân (p-value = 0,000) - Hiệu suất tải hoạt chất tương đối thấp, đa số 2% Kết giải thích dựa đặc tính thân nước saponin nên phân bố vào vùng lõi thân nước liposome Ctp-Rm bào chế từ ethanol 70% (tt/tt) tan tốt nước nên dự đốn khả phân bố vào liposome chế phẩm không cao 4.4 BÀO CHẾ GEL MANG LIPOSOME CHỨA CTP-RM 4.4.1 Thiết kế nghiên cứu Các kết thu từ nghiên cứu sử dụng hydrogel làm chất để mang hoạt chất chiết xuất từ Rau má mơ hình rạch da in vivo cho thấy công thức hydrogel kết hợp với TECA khơng gây dấu hiệu kích ứng da thú thử nghiệm, làm lành vết thương nhanh 15% so với kem thương mại nhanh 40% so với vết thương không điều trị 52 Như vậy, hydrogel dạng bào chế phù hợp để tải liposome chứa Ctp-RM Nghiên cứu khảo sát tạo gel mang liposome chứa Ctp-RM sử dụng loại tá dược tạo gel gồm tá dược tạo gel N, L, K P theo phương pháp tạo gel sau phối hợp với bán thành phẩm chứa hệ phân tán liposome - Mỗi tá dược tạo gel khảo sát nồng độ khác Các gel đánh giá dựa tiêu chí cảm quan độ bền vật lý tác động nhiệt Các cơng Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 78 thức đạt yêu cầu lựa chọn để phối hợp với bán thành phẩm hệ phân tán liposome chứa Ctp-RM - Gel mang liposome chứa Ctp-Rm bảo quản nhiệt độ phòng tối thiếu 24 Sau đánh giá mặt cảm quan độ bền vật lý Các công thức thoả mãn hai tiêu chí tiếp tục đưa vào thử nghiệm sau bao gồm đánh giá độ dàn mỏng, pH, độ ổn định sau chu kỳ nhiệt khả giải phóng hoạt chất qua màng nhân tạo 4.4.2 Kết nghiên cứu - Các công thức gel đạt yêu cầu cảm quan độ bền vật lý gồm N1 (3% tá dược N), L4 (3% tá dược L), K3 (0,2% tá dược K) ; P3 (35% tá dược P) - Sau phối hợp với bán thành phẩm chứa hệ phân tán liposome, có công thức gel đạt yêu cầu Rm-N1, Rm-L4 Rm-P3, gel Rm-L4 có khả giải phóng hoạt chất qua màng cellulose aceatat cao Mặc dù độ dàn mỏng gel Rm-P3 cao gel Rm-L4 khả giải phóng hoạt chất thấp công thức Rm-L4 Điều cho thấy khả giải phóng hoạt chất phụ thuộc nhiều vào chất tỷ lệ sử dụng tá dược tạo gel: § Gel Rm-N1: Tá dược tạo gel sử dụng nồng độ 3% tương tự gel Rm-L4 gel Rm-N1 có cấu trúc cồng kềnh thể chất đặc cịn gel Rm-L4 có cấu trúc lỏng lẻo nên có khả giải phóng hoạt chất cao § Gel Rm-P3: Nồng độ chất tạo gel cao (35%) nên cấu trúc gel Rm-P4 tồn ma trận liên kết gel dày đặc, bắt giữ hoạt chất nên khả thấm qua màng thấp - Giá trị pH gel thay đổi không đáng kể so với gel (giảm từ 0,06 đến 0,93 giá trị pH) diện đệm phosphat pH 5,5 thành phần bán thành phẩm liposome Giá trị pH gel liposome nằm khoảng aid từ 5,8-6,0 phù hợp với pH sinh lý da - Khi đánh giá kết hợp với cảm quan dùng thử sản phẩm da (độ bám dính, mức độ trơn nhờn khả rửa trôi) cho thấy tá dược tạo gel L tá dược có nhiều tiềm cơng nghệ sản xuất dạng bào chế bán rắn Tá dược L Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 79 copolymer tạo thành từ polymer có khả tạo gel (carbomer trung tính hố) gốc tá dược nhũ hóa đa chức (lecithin) nên tá dược L vừa có khả tăng cường độ ẩm cho da làm dịu da, vừa có khả dẫn hoạt chất qua cấu trúc da Điều giải thích lý gel Rm-L4 có khả thấm tốt vào da khơng để lại cịn cảm giác trơn nhờn hay tạo màng da gel Rm-N1 gel Rm-P3 - Nhận xét công thức gel Rm-K3: Tá dược K có chất hydrocolloid sản xuất Sphigomonas elodea phân loại dựa tỷ lệ acyl hoá cấu trúc Tỷ lệ acyl hoá cao, gel tạo thành mịn, có độ đồng cao có tính đàn hồi Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành gel diện cation kim loại pH acid môi trường phân tán Trong công thức khảo sát, tá dược K gel có tính bền vững cao phân tán môi trường nước cất phối hợp với bán thành phẩm hệ phân tán liposome chứa Ctp-RM, gel bị chảy lỏng nguyên nhân tá dược K khơng tương thích với đệm phosphat pH 5,5 dùng để bào chế bán thành phẩm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 80 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đề tài “Nghiên cứu bào chế gel liposome chứa Ctp-RM (Centella asiatica (L.) Urb Apiaceae)” đạt mục tiêu đề ra, là: - Đánh giá nguyên liệu bột dược liệu Rau má theo DĐVN V Dược điển Châu Âu với tiêu điển hình đạt yêu cầu - Chiết xuất saponin toàn phần từ dược liệu phương pháp ngấm kiệt điều kiện thường với dung môi ethanol 70% kiềm hoá đến pH với ammoniac, tỷ lệ dược liệu dung môi 1/15 Tỷ lệ dược liệu dung môi lựa chọn phương pháp sắc ký lớp mỏng Dung môi lựa chọn phương pháp đo quang phổ UV-Vis bước sóng 558 nm sau thực phản ứng taọ màu với thuốc thử vanillin-sulfuric - Dịch chiết loại dung môi để điều chế cao đặc với hàm ẩm 7,92% với hàm lượng asiaticosid 4,26% (kl/kl), tương đương 10,92% so với nguyên liệu TECA - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng asiaticosid Rau má phương pháp HPLC để ứng dụng nghiên cứu - Khảo sát công thức bào chế liposome trắng với tỷ lệ khối lượng phospholipid : cholesterol 80:20, hàm lượng phospholipid chất nhũ hoá Tween 20 pha hữu 1,5% 0,5% (kl/tt) Pha hữu phối hợp với pha nước theo tỷ lệ 1:10, nhiệt độ phối hợp 45 ℃, tốc độ khuấy trộn 500 RPM, thời gian khuấy trộn 30 phút Hệ phân tán liposome bào chế có có kích thước giọt trung bình 422,8 nm, số đa phân tán 0,473, zeta trung bình -11,03 mV - Bào chế công thức gel liposome chứa Ctp-RM tương đương 1% (kl/kl) TECA có cảm quan, độ đồng nhất, độ dàn mỏng, pH phù hợp với chế phẩm dùng da khả giải phóng hoạt chất Kết khảo sát cho thấy tá dược tạo gel có nhiều ưu điểm carbomer-lecithin copolymer (tá dược tạo gel L) với tỷ lệ sử dụng 3% (kl/kl) Phương pháp tạo gel sử dụng phương pháp tạo gel Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 phối hợp với bán thành phẩm hệ phân tán liposome dung dịch đệm phosphat pH 5,5 chứa Ctp-RM 20% (kl/kl) 5.2 ĐỀ NGHỊ Một số đề nghị để đề tài hoàn thiện phát triển bao gồm: - Xây dựng tiêu chuẩn sở Ctp-RM dựa chuyên luận Dược Điển Việt Nam cao thuốc - Xây dựng thẩm định quy trình kiểm nghiệm dung môi tồn dư ứng dụng kiểm nghiệm dung môi tồn dư bán thành phẩm liposome chứa Ctp-RM - Xây dựng quy trình đánh giá hình thái cấu trúc liposome phân bố kích thước tiểu phân kỹ thuật chụp TEM sau thêm tá dược tạo gel để đánh giá tác động tá dược tạo gel lên cấu trúc liposome - Xây dựng quy trình đánh giá khả chảy dược chất khỏi liposome sau thời gian bảo quản đánh giá tác động tá dược tạo gel lên trình Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngô Vân Thu, Trần Hùng Dược liệu học (Tập I) NXB Y học Hà Nội ; 2007 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam (in lần thứ V) NXB Y học Hà Nội ; 2017 Trương Thị Đẹp Thực vật dược NXB Giáo dục Tp Hồ Chí Minh ; 2010 Wiesława B, Paulina ZA, Elżbieta SS et al “Centella asiatica in dermatology: An overview” Phytother Res 2014 ; 28(8):1117-1124 DOI: 10.1002/ptr.5110 Cosmetic Ingredient Review “Safety assessment of Centella asiatica-derived ingredients as used in cosmetics” Updated on July 10, 2015 Accessed on October 21, 2022 https://www.cir-safety.org/sites/default/files/centel062015FR.pdf Surini S, Sarah S, Djajadisastra J “ Formulation and in vitro penetration study of transfersomes gel containing Gotu Kola leaves extract (Centella asiatica (L.) Urban)” J Young Pharm 2018 ; 10(1):27-31 DOI: 10.5530/jyp.2018.10.8 Nguyễn Thị Kim Liên, Lê Xuân Trường, Trần Văn Thành, “Bào chế gel vi nhũ tương từ cao khô Rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) Aug DC., Molluginaceae)” Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 2018 ; 61(5):11-15 Ibrahim MM, Nair AB et al “Hydrogels and their combination with liposomes, niosomes, or transfersomes for dermal and transdermal drug delivery” Angel Catala (eds): Liposomes InTechOpen ; 2017:155-186 Lorena T “Liposomal gels in enhancing skin delivery of drugs” Nina DC, Howard IM (eds): Percutaneous penetration enhancers chemical methods in penetration enhancement: Drug manipulation strategies and vehicle effects Springer, USA ; 2015:329-340 10 Armen T Flowering Plants 2nd ed Springer ; 2009: 435-510 11 uphcm.edu.vn “Loài Centella asiatica (L.) Urban (Cây Rau má)” Cập nhật ngày 23/02/2010, truy cập ngày 21/10/2022 http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php ?q=node/142, 12 Vo NNQ, Fukushima EO, Muranaka T “Structure and hemolytic activity relationships of triterpenoid saponins and sapogenins” J Nat Med 2017 ; 71(1): 50-58 DOI: 10.1007/s11418-016-1026-9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 13 Laurence V, Catherine L, Georges M et al “Structure-activity relationships of haemolytic saponins” Pharm Biol 2008 ; 40(4):253-262 DOI: 10.1076/phbi.40.4.253.8470 14 Lazarus GS, Cooper DM, Knighton DR et al “Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing” Arch Dermatol 1994 ; 130(4):489-493 PMID: 8166487 15 Joshua S, Boateng KHM, Howard N et al “Wound healing dressings and drug delivery systems: A review” J Pharm Sci 2008 ; 97(8):2892-2923 DOI: 10.1002/jps.21210 16 Percival NJ “Classification of wounds and their management” Surgery (Oxford) 2002 ; 20(5):114-117 DOI:https://doi.org/10.1383/surg.20.5.114.14626 17 Loyd VAJ, Nicholas GP, Howard CA Ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems (10th ed.) Lippincott William & Wilkins, USA ; 2013 18 Danilo DL, Papahadjopoulos D Medical applications of liposomes Elsevier Science B.V ; 1998 19 Guijun W “Liposomes as drug delivery vehicles” Wang B, Siahaan T, Soltero R (eds): Drug delivery: Principles and applications John Wiley & Sons, USA ; 2005:411-434 20 Lê Quan Nghiệm Sinh dược học hệ thống trị liệu NXB Y học Tp HCM ; 2007 21 Nguyễn Tấn Quang, Phạm Thị Minh Huệ “Nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2018 ; 2(8):43-46 22 Sophia GA, Paraskevi K, Dimitrios GF “Liposome and drug delivery” Shayne CG (eds): Pharmaceutical manufacturing handbook: Production and processes John Wiley & Sons Inc., Canada ; 2008: 443-532 23 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hoá Bào chế sinh dược học (Tập II) NXH Y học Tp Hồ Chí Minh ; 2011 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 24 Lasch J, Laub R, Wohlrab W “How deep intact liposomes penetrate into human skin” J Control Release 1992 ; 18(1):55-58 DOI: 10.1016/01683659(92)90211-9 25 Gillet A, Compère P, Lecomte F et al “Liposome surface charge influence on skin penetration behaviour” Int J Pharm 2011 ; 411(1-2):223-231 DOI: 10.1016/j.ijpharm.2011.03.049 26 Raymond CR, Paul JS, Marian EQ Handbook of pharmaceutical excipients (8th ed.) Pharmaceutical Press, UK ; 2017 27 Terence C Colloid science: Principles, methods and applications (2nd ed.) John Wiley & Sons Inc., USA ; 2010 28 Bozzuto G, Molinari A “Liposomes as nanomedical devices” Int J Nanomedicine 2015 ; 10(2):975-999 DOI: 10.2147/IJN.S68861 29 Briuglia ML, Rotella C, McFarlane A et al “Influence of cholesterol on liposome stability and on in vitro drug release” Drug Deliv Transl Res 2015 ; 5(6):231242 DOI: 10.1007/s13346-015-0220-8 30 Akbarzadeh A, Rogaie RS, Soodabeh D et al “Liposome: Classification, preparation, and applications” Nanoscale Res Lett 2013 ; 8(2):102-110 DOI: 10.1186/1556-276X-8-102 31 Gregory G Liposome technology (Volume I and II) (3rd ed.) Informa Healthcare, USA ; 2007 32 Schubert R “Liposome preparation by detergent removal” Methods Enzymol 2003 ; 367(2):46-70 DOI: 10.1016/S0076-6879(03)67005-9 33 Trần Thị Hải Yến, Trần Thị Như Quỳnh, Dương Thị Thuấn cộng sự, “Nghiên cứu bào chế liposome-natri deoxycholat berberin phương pháp tiêm ethanol” Tạp chí Nghiên cứu Dược Thông tin thuốc 2020 ; 11(4):11-17 34 Trịnh Thị Loan, Dương Thị Thuấn, Trần Thị Hải Yến cộng “Nghiên cứu bào chế liposome berberin phương pháp tiêm ethanol” Tạp chí Dược học 2019 ; 59(3):54-58 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 Wan LL, Xian RQ Biomaterial engineering: Liposome-based drug delivery systems Springer, Germany ; 2021 36 Blanco MD, Olmo RM, Teijón JM “Hydrogels” James S(eds): Encyclopedia of pharmaceutical technology (3rd ed.) Informa Healthcare, USA ; 2007:2021-2039 37 Clyde MOI, Klech GCM “Gel and jellies” James S (eds): Encyclopedia of pharmaceutical technology (3rd ed.) Informa Healthcare, USA 2007:1875-1890 38 Mahalingam R, Li X, Jasti BR et al “Semisolid dosages: Ointments, creams and gels” Shayne CG (eds): Pharmaceutical manufacturing handbook: Production and processes John Wiley & Sons Inc., Canada ; 2008: 267-312 39 Christopher M “Rheology” Michael EA, Kevin MGT (eds): Aulton’s Pharmaceutics: The design and manufacture of medicines (5th ed.) Churchill Livingstone, UK ; 2013:94-114 40 Ahmed EM “Hydrogel: Preparation, characterization, and applications: A review” J Adv Res 2015 ; 6(2):105-121 DOI: 10.1016/j.jare.2013.07.006 41 Hong SS, Kim JH, Li H et al “Advanced formulation and pharmacological activity of hydrogel of the titrated extract of Centella asiatica” Arch Pharm Res 2005 ; 28(4):502-508 DOI: 10.1007/BF02977683 42 Alhamdany A, Yousif N, Salman DZ “An innovative mucoadhesive thermosensitive in situ gelling liquid suppository of metoclopramide hydrocloride for treatment of nausea and vomiting associated with diseases” Indian J Pharm Sci 2020 ; 82(4):650-664 DOI: 10.36468/pharmaceutical-sciences.691 43 Alka G, Deepika A, Sanjay G et al “Spreading of semisolid formulations: An update” Pharm Technol 2002 ; 26(9):84-105 44 Alves MP, Raffin RP et al “Rheological behavior of semisolid formulations containing nanostructured systems” Beck R, Guterres S, Pohlmann A (eds): Nanocosmetics and nanomedicines Springer, Germany ; 2011:37-45 45 Donald MC, Pankaj K “Models, methods and measurements in transdermal drug delivery” Nina DC, Howard IM (eds): Percutaneous penetration enhancers drug Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh penetration into/through the skin: Methodology and general considerations Springer, USA ; 2017:153-184 46 Ulrich FS, Selzer D, Hansen S et al “Human native and reconstructed skin preparations for in vitro penetration and permeation studies” Nina DC & Howard IM (eds): Percutaneous penetration enhancers drug penetration into/through the skin, Methodology and general considerations Springer, USA ; 2017:185-204 47 Zsikó C, Erzsébet C, Anita K et al “Methods to evaluate skin penetration in vitro” Sci Pharm 2019 ; 87(3):19-40 DOI: 10.3390/scipharm87030019 48 Petró É, Balogh A, Blazsó G et al “In vitro and in vivo evaluation of drug release from semisolid dosage forms” Die Pharmazie 2011 ; 66(12):936-941 DOI: 10.1691/ph.2011.1079 49 Le AV, Parks SE, Nguyen, MH et al “Improving the Vanillin-Sulphuric Acid Method for Quantifying Total Saponins” Technologies 2018 ; 6(3): 84-96 DOI: 10.3390/technologies6030084 50 Trần Văn Thành, Huỳnh Văn Hoá, Trần Anh Vũ cộng “Nghiên cứu bào chế mỹ phẩm gel Dương cam cúc (Matricaria chamomilla L.) - Liposomes hỗ trợ điều trị da bị viêm dị ứng” Sở Khoa học Công nghệ Tp HCM - Trung tâm thông tin thống kê Khoa học Công nghệ Tp.HCM Đăng ngày 01/10/2019 Truy cập ngày 01/09/2022 https://cesti.gov.vn/bai-viet/mo-hinh-cong-ngheung-dung-vao-san-xuat/bao-che-my-pham-gel-duong-cam-cuc-liposomes-hotro-dieu-tri-da-bi-viem-va-di-ung-01009789-0000-0000-0000-000000000000 51 Idris FN, Nadzir MM “Comparative studies on different extraction methods of Centella asiatica and extracts bioactive compounds effects on antimicrobial activities” Antibiotics 2021 ; 10(4): 457-81 DOI: 10.3390/antibiotics10040457 52 Ahmed SA, Taher M, Mandal UK et al “Pharmacological properties of Centella asiatica hydrogel in accelerating wound healing in rabbits” BMC Complement Altern Med 2019 ; 19(8): 213-220 DOI: https://doi.org/10.1186/s12906-0192625-2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 53 James JT, Dubery IA “Pentacyclic triterpenoids from the medicinal herb, Centella asiatica (L.) Urban” Molecules 2009 ; 14(10): 3922-3941 DOI: 10.3390/molecules14103922 54 Łyko AR, Arct J, Pytkowska K “Moisturizing and anti-inflammatory properties of cosmetic formulations containing Centella asiatica extract: Indian J Pharm Sci 2016 78(1):27-33 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM I YÊU CẦU CHUNG Thông tin khái quát - Tên sản phẩm: Gel liposome Rau má - Ký hiệu, số hiệu: 01102022/LPS-RM - Tiêu chuẩn: TCCS - Ngày có hiệu lực: 01/10/2022 - Tên đơn vị đề nghị công bố tiêu chuẩn: Công ty TNHH X - Tên quan công bố tiêu chuẩn: Trung tâm kiểm nghiệm H - Thông tin thay thế, sửa đổi tiêu chuẩn: Không Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho gel chứa hệ phân tán liposome Rau má, tương đương asiaticosid 0,39% Công ty TNHH X sản xuất chịu trách nhiệm II YÊU CẦU KỸ THUẬT Thành phần STT Tên nguyên liệu Tên khoa học Tiêu chuẩn áp dụng TCCS Tỷ lệ Hệ phân tán LPS-RM 46% Tá dược tạo gel L Carbomer-lecithin copolymer TCCS 3% Propylen glycol Propan-1,2-diol USP 43 15% Nipagin M Methyl paraben USP 43 0,1% Nước tinh khiết USP 43 vđ 100% Yêu cầu cảm quan Gel màu xanh đậm, mờ, thể chất mềm, có mùi đặc trung dược liệu, dễ bắt dính lên da có độ dàn mỏng tốt Sau phút khơng cịn cảm giác trơn nhờn da Khi rửa với nước không tạo cảm giác nhớt Các tiêu chất lượng/kỹ thuật 3.1 Các tiêu hoá-lý Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 3.1.1 pH - Đo máy đo pH HANNA model HI 2211 25 ℃, pH phải đạt từ 5,5-6,0 3.1.2 Độ ổn định - Chế phẩm không tách lớp sau chu kỳ tăng giảm nhiệt độ Mỗi chu kỳ, sản phẩm bảo quản nhiệt độ ℃ 16 giờ, 50 ℃ giờ, chu liên tục 3.1.3 Độ nhớt - Đo nhớt kế Brookfield S-62, model LVDV-E 25 ℃, tốc độ quay 12 RPM 3.1.4 Định tính - Phương pháp HPLC, sắc ký đồ mẫu thử phần định lượng phải có pic tương ứng thời gian lưu so với pic asiaticosid mẫu đối chiếu 3.1.5 Định lượng - Phương pháp HPLC, hàm lượng asiaticosid phải đạt từ 0,37-0,43% (kl/kl) 3.2 Các tiêu an tồn 3.2.1 Chỉ tiêu kích ứng da - Phương pháp thử: TCVN 7391-10:2007 ISO 10993-10:2002, Phần 10, mục 6.3 3.2.2 Giới hạn kim loại nặng - Phương pháp thử: ACM THA 05 Testing Method - Chỉ tiêu: 1) Thuỷ ngân : Nồng độ tối đa cho phép có sản phẩm ppm 2) Arsen: Nồng độ tối đa cho phép có sản phẩm ppm 3) Chì: Nồng độ tối đa cho phép có sản phẩm 20 ppm 3.2.3 Giới hạn vi sinh vật - Phương pháp thử: ACM THA 06 Testing Method - Chỉ tiêu: 1) Tổng số vi sinh vật đếm được: < 1000 CFU/g 2) Pseudomonas aeruginosa: Khơng có 0,1 g mẫu thử 2) Staphylococcus aureus: Không có 0,1 g mẫu thử 3) Cadida albicans: Khơng có 0,1 g mẫu thử Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 3.3 Các tiêu khác 3.3.1 Chất bị cấm dùng mỹ phẩm (ACC 32, Annex II): - Khơng có (bao gồm chất bảo vệ thực vật) 3.3.2 Giới hạn chất bảo quản (ACC 32, Annex VI) - Methyl paraben: Tối đa 0,4% (kl/kl) 3.3.3 Các chất khác - Ammoniac (ACC 32, Annex III): Tối đa 6% (kl/kl) Đóng gói bảo quản 4.1 Đóng gói Gel đóng chai nhựa PET 50 mL có vịi nhấn 4.2 Nhãn sản phẩm GEL LIPOSOME RAU MÁ Thành phần: Chiết xuất Rau má (chứa hệ phân tán liposome), carbomer-lecithin copolymer, propylen glycol, Nipagin M, nước tinh khiết Công dụng: Dưỡng da, giữ ẩm, nhanh liền sẹo Cách sử dụng: Bôi lên da từ 3-4 lần/ngày Bảo quản: … Hạn sử dụng: … Quy cách đóng gói: Chai nhựa 50 mL có vịi nhấn Chịu trách nhiệm sản phẩm: Công ty TNHH X Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn