Nghiên cứu bào chế gel in situ nổi trong dạ dày chứa furosemid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VƯƠNG QUỲNH CHINH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL IN SITU NỔI TRONG DẠ DÀY CHỨA FUROSEMID LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VƯƠNG QUỲNH CHINH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL IN SITU NỔI TRONG DẠ DÀY CHỨA FUROSEMID NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM & BÀO CHẾ MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN THIỆN HẢI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn “Nghiên cứu bào chế gel in situ dày chứa furosemid” cơng trình nghiên cứu tơi, với hướng dẫn tận tình thầy PGS.TS Nguyễn Thiện Hải Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan Những tài liệu tham khảo sử dụng luận văn trích dẫn nêu rõ mục Tài liệu tham khảo Tác giả luận văn Vương Quỳnh Chinh iii Luận văn Thạc sĩ – khóa 2019 – 2021 Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 8720202 Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ GEL IN SITU NỔI TRONG DẠ DÀY CHỨA FUROSEMID Vương Quỳnh Chinh Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thiện Hải Mở đầu Furosemid (FUR) sử dụng điều trị triệu chứng bệnh nhân suy tim, giúp kiểm soát tiến triển bệnh FUR cho hấp thu tối ưu môi trường acid dày; nhiên cản trở đặc tính lý hóa, sinh lý tiêu hóa làm q trình hấp thu FUR khơng ổn định sử dụng dạng bào chế đường uống thông thường Các hệ thống kéo dài thời gian lưu dày giúp tăng khắc phục nhược điểm Mục tiêu đề tài nghiên cứu bào chế gel in situ dày chứa FUR nhằm tăng thời gian lưu trữ, tăng hấp thu, tăng hiệu điều trị Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Gel in situ dày chứa FUR Phương pháp nghiên cứu: Gel in situ dày chứa FUR điều chế dựa sở cải thiện độ tan, độ bền vững FUR môi trường, kết hợp sàng lọc polymer tạo gel in situ polymer kiểm sốt phóng thích đồng thời bắt giữ khí CO2 tạo hệ thống giúp tồn lưu lâu dày Chế phẩm xây dựng tiêu chuẩn sở, nâng lô đánh giá theo tiêu chuẩn xây dựng sơ đánh giá độ ổn định FUR thử nghiệm định lượng phương pháp UV HPLC Kết Gel in situ dày chứa FUR bào chế thành công quy mô 50 – 2500 mL sử dụng tá dược tạo gel in situ Na alginat, tá dược kiểm sốt phóng thích FUR carbomer 974P NaCMC với tỷ lệ 2, 0,35, 0,15% kết hợp 0,2% Ca glucoheptonat 1% NaHCO3 tạo khí Gel in situ đạt tiêu chuẩn xây dựng cảm quan, tiềm thời nổi, tỷ lệ tải, khả giải phóng hoạt chất kéo dài Phương pháp UV-Vis HPLC định lượng FUR dược thẩm định đạt yêu cầu quy trình phân tích Sản phẩm ổn định sau tháng bảo quản điều kiện dài hạn lão hóa cấp tốc Kết luận Gel in situ dày chứa FUR bào chế thành công với quy mơ 2500 mL Cơng thức quy trình bào chế cho thấy ổn định lặp lại, nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tiễn Từ khóa: GRDF, gel in situ dày, furosemid iv The Abtract of Master's Thesis – Academic course: 2019 – 2021 Specialty: Pharmaceutical technology and Pharmaceutics Code: 8720202 FORMULATION OF GASTRIC-FLOATING IN SITU GEL CONTAINING FUROSEMIDE By Vuong Quynh Chinh Supervisor: Assoc Prof Dr Nguyen Thien Hai Introduction Furosemide (FUR) is used symptomatically in patients with heart failure to help control disease progression FUR is thought to be optimally absorbed in the acidic environment of the stomach; however, the interference of physico-chemical and physiological properties makes the absorption of FUR unstable when using conventional oral dosage forms Gastroretentive dosage forms will overcome these disadvantages The aim of the study is to formulate an gastric-floating in situ gel containing FUR in order to prolonged gastric residence times, increase absorption, and the effectiveness of treatment Research subject and method Subject: gastric-floating in situ gel containing FUR Method: The gastric-floating in situ gel containing FUR was established by improving the solubility and stability of FUR in the medium, and screening of in situ gelling polymer and controlled-release and gas-capture polymer The floating system was forming that helps to prolonged gastric residence times Developing specifications, scale up the batch size to 2500 mL, evaluating the quality according to established specifications, and preliminary evaluating the stability for product UV-Vis spectroscopy and HPLC methods were used determine FUR in products Results The gastric-floating in situ gel containing FUR was successfully established in the batch size of 50 - 2500 mL by using Na alginate as a in situ gelling excipient, v carbomer 974P, and NaCMC as retandants with ratio 2, 0.35, 0.15% respectively, combined with 0.2% Ca (glucoheptonate salt), and 1% NaHCO3 as gas-forming excipient In situ gel meets the established specifications of properties, floating lag time, floating time, loading rate, ability to extended-release drug The UV-Vis and HPLC methods for quantitative FUR were successfully validated The final product was stable after months of storage under accelerated and long-time conditions Conclusion Gastric-floating in situ gel containing furosemide was successfully prepared in the batch size of 2500 mL The manufacturing process showed stability, repeatability, and could apply in practicality Keywords: GRDF, floating in situ gel, furosemide vi MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi Chương 1: 1.1 TỔNG QUAN Furosemid 1.1.1 Cấu tạo danh pháp 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Độ ổn định 1.1.4 Kiểm nghiệm 1.1.5 Tính chất dược lý 1.1.6 Một số chế phẩm chứa furosemid thị trường 1.2 Phương pháp cải thiện độ tan 1.3 Hệ thống dày 10 1.3.1 Sự phát triển hệ thống dày 10 1.3.2 Đặc điểm 12 1.3.3 Phân loại 12 1.3.4 Một số yếu tố sinh lý ảnh hưởng GRDFs 13 1.4 Hệ thống hình thành màng gel in situ .14 1.4.1 Đặc điểm 14 1.4.2 Cơ chế hình thành gel in situ 15 1.4.3 Các tiêu chí đánh giá đặc tính hệ gel in situ GRDF 16 1.5 Một số nghiên cứu tạo hệ thống dày furosemid 17 1.6 Polymer 17 1.6.1 Polymer nhạy với pH 18 1.6.2 Hỗn hợp polymer 20 1.7 Calci chất tạo phức 20 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Nguyên liệu thiết bị 23 vii 2.2.1 Ngun liệu, hóa chất, dung mơi 23 2.2.2 Trang thiết bị 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu .24 2.3.1 Xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid 24 2.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu 34 2.3.3 Xây dựng qui trình bào chế chế phẩm qui mơ 500 mL - 2500 mL 44 2.3.4 Đánh giá sơ độ ổn định 44 Chương 3: 3.1 KẾT QUẢ 45 Xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid 45 3.1.1 Thẩm định quy trình định lượng FUR phương pháp quang phổ UV-Vis trình khảo sát thử độ hòa tan 45 3.1.2 Khảo sát tính chất chế phẩm tham khảo đối chiếu 47 3.1.3 Khảo sát phương pháp hòa tan furosemid 48 3.1.4 Khảo sát tạo phức calci 50 3.1.5 Khảo sát số đặc tính gel Na alginat số polymer thứ cấp 52 3.1.6 Xây dựng công thức quy trình bào chế gel in situ furosemid 55 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu 59 3.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng furosemid hỗn hợp paraben chế phẩm phương pháp quang phố UV-Vis 59 3.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng furosemid chế phẩm phương pháp HPLC 62 3.2.3 Xây dựng quy trình thử độ hịa tan furosemid hệ gel in situ 65 3.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở dự kiến cho sản phẩm nghiên cứu 66 3.4 Xây dựng quy trình bào chế chế phẩm qui mơ 500 mL - 2500 mL 67 3.5 Độ ổn định sơ chế phẩm 69 Chương 4: BÀN LUẬN 71 KẾT LUẬN VẦ KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii DANH MỤC VIẾT TẮT STT Từ viết tắt β-CD BP CMC CT CTP cs Dd DĐVN DSC 10 EDTA 11 FUR 12 G Từ tiếng Anh β-cyclodextrin British Pharmacopoeia Carboxymethyl cellulose Differential Scaning Calorimetry Etylendiamine tetraacetic acid Furosemid 13 GRDFs Gastroretentive dosage forms 14 15 HPLC HPMC 16 ICH 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 High-performance liquid chromatography Hydroxy propyl methyl cellulose International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use M MMC kk/tt LCST LOD LOQ MP PARs PP RSD SD TB TEA TG USP UV-Vis Migrating Motor Complex Lower critical solution temperature Limit of detection Limit of quantification Methyl paraben Parabens Propyl paraben Relative standard deviation Standard deviation Triethanolamine Thermogravimetry United States Pharmacopoeia Ultraviolet-visible Ý nghĩa tiếng Việt Dược điển Anh công thức chất tạo phức cộng Dung dịch Dược điển Việt Nam Phân tích nhiệt quét vi sai acid α-L-guluronic Hệ thống phân phối thuốc tồn lưu dày Sắc ký lỏng hiệu cao Hội nghị Quốc tế Hài hịa hóa Thủ tục đăng ký Dược phẩm sử dụng cho người acid β-D-mannuronic Sóng co thắt lưu động khối lượng/thể tích Nhiệt độ dd tới hạn Giới hạn phát Giới hạn định lượng Hỗn hợp paraben Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Trung bình Phân tích nhiệt trọng lượng Dược điển Mỹ Tử ngoại – khả kiến ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Độ tan (mg/mL) furosemid tỷ lệ Liều/ Độ tan (D/S) (mL) tương ứng ba sản phẩm viên nén có hàm lượng khác Bảng 1.2 Thời gian bán hủy (t1/2) furosemid môi trường pH điều kiện tiếp xúc ánh sáng phòng thí nghiệm Bảng 1.3 Sự biến đổi màu viên furosemid điều kiện bảo quản Bảng 1.4 Sự biến đổi màu viên nén furosemid bảo quản tác động khơng khí, oxy nitơ .6 Bảng 1.5 Phương pháp định lượng HPLC số chế phẩm Bảng 1.6 Một số chế phẩm chứa furosemid thị trường Bảng 1.7 Một số tác nhân kích thích q trình sol-gel 16 Bảng 1.8 Một số nghiên cứu hệ thống dày chứa furosemid 17 Bảng 1.9 Đặc tính số polymer 20 Bảng 1.10 Đặc tính số muối/phức calci .22 Bảng 2.2 Danh mục chất đối chiếu 23 Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.4 Giai mẫu khảo sát độ tuyến tính quy trình định lượng .26 Bảng 2.5 Một số công thức khảo sát đặc tính gel 31 Bảng 2.6 Công thức khảo sát xây dựng công thức gel in situ 33 Bảng 2.7 Giai mẫu khảo sát độ tuyến tính quy trình định lượng Q-value .36 Bảng 2.8 Giai mẫu khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng HPLC 40 Bảng 2.9 Thành phần mẫu khảo sát độ phương pháp định lượng HPLC .41 Bảng 3.1 Kết thẩm định độ đặc hiệu phương pháp UV-Vis 343 nm .45 Bảng 3.2 Kết độ tuyến tính quy trình định lượng (λmax = 343 nm) 46 Bảng 3.3 Kết độ quy trình định lượng (λmax = 343 nm) 46 Bảng 3.4 Kết độ lặp lại quy trình định lượng (λmax = 343 nm) 47 Bảng 3.5 Kết độ xác trung gian quy trình định lượng (λmax = 343 nm) 47 Bảng 3.6 Một số tính chất khảo sát chế phẩm tham khảo đối chiếu 48 Bảng 3.7 Độ tan furosemid môi trường đệm pH dung môi .48 x Bảng 3.8 Độ tan furosemid kết hợp số chất trợ tan HCl 0,1N 48 Bảng 3.9 Ảnh hưởng ion tạo muối đến biến đổi đặc tính dd furosemid điệu kiện nhiệt độ ánh sáng khác 49 Bảng 3.10 Sự biến đổi trạng thái dd muối calci Na citrat với tỉ lệ mol sau khoảng thời gian 50 Bảng 3.11 Khả tạo phức calci Na citrat với tỉ lệ mol khác 50 Bảng 3.12 Khảo sát đặc tính gel ảnh hưởng alginat, bicarbonat calci 52 Bảng 3.13 Khảo sát đặc tính gel ảnh hưởng polymer thứ cấp 54 Bảng 3.14 Kết khảo sát công thức gel in situ (n = 3) 55 Bảng 3.15 R2 mơ hình động học 58 Bảng 3.16 Độ hòa tan F12 số viên nén thị trường 58 Bảng 3.17 Kết độ tuyến tính phương pháp định lượng Q-value .60 Bảng 3.18 Kết độ phương pháp định lượng Q-value .60 Bảng 3.19 Kết độ lặp lại phương pháp định lượng Q-value .61 Bảng 3.20 Kết độ xác trung gian phương pháp định lượng Q-value 61 Bảng 3.21 Kết độ tuyến tính phương pháp định lượng HPLC 63 Bảng 3.22 Kết tính tương thích hệ thống phương pháp định lượng HPLC .63 Bảng 3.23 Kết độ phương pháp định lượng HPLC 64 Bảng 3.24 Kết độ xác phương pháp định lượng HPLC 64 Bảng 3.25 Độ tan điều kiện sink furosemid với nồng độ chất diện hoạt môi trường HCl 0,1 N 65 Bảng 3.26 Kết độ ổn định furosemid môi trường thử độ hòa tan 66 Bảng 3.27 Tiêu chuẩn thành phẩm (DỰ KIẾN) 66 Bảng 3.28 Công thức pha chế quy mô 500 mL 2500 mL 67 Bảng 3.29 Các thơng số kiểm sốt quy trình bào chế 67 Bảng 3.30 Kết đánh giá thành phẩm qui mô 500 mL 2500 mL .69 Bảng 3.31 Kết đánh giá độ ổn định sơ chế phẩm (n=3) .70 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo furosemid Hình 1.2 Sự biến đổi dạng furosemid điều kiện thử nghiệm khắc nghiệt Hình 1.3 Các đường phân hủy quang furosemid Hình 1.4 log[furosemid] theo thời gian dd đệm tiếp xúc ánh sáng Hình 1.5 Sự hình thành hợp chất acid 4-cloro-5-sulfamoylanthranilic màu đỏ tím Hình 1.6 Sự hịa tan kết tủa muối dày rỗng trình vận chuyển vào ruột non 10 Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống GRDFs, từ trái sang phải: nổi, lắng đọng, trương nở, giãn nở (mở ra), kết dính niêm mạc 11 Hình 1.8 Quá trình hình thành gel in situ dày 14 Hình 1.9 Trạng thái chuỗi polymer tùy thuộc vào mức độ ion hóa 18 Hình 1.10 Cấu trúc số polymer 19 Hình 1.11 Sự hình thành liên kết ngang calci chuỗi polymer 21 Hình 1.12 Một số chất tạo phức thường dùng 22 Hình 3.1 Phổ UV (A) mẫu chuẩn, (B) mẫu placebo-ĐL, (C) mẫu giả định, 45 Hình 3.2 Khả hịa tan FUR (0,8%) mơi trường .48 Hình 3.3 Dd muối furosemid TEA-K-Na/pH 8,0; Na/pH 9,0; Na/pH 7,4 sau tháng 40 oC điều kiện 50 Hình 3.4 - Sự biến đổi trạng thái dd muối calci có mặt Na citrat .51 Hình 3.5 Sự gel hóa đánh giá qua tượng Tyndall 51 Hình 3.6 Khả gel đặc tính gel .52 Hình 3.7 Đặc tính hình dạng gel alginat 2% .53 Hình 3.8 Đặc tính gel alginat 2% với tỷ lệ calci:NaHCO3 (0,2:1) polymer (0,5%) sau thời gian khuấy động 54 Hình 3.9 Sự phóng thích hoạt chất theo nồng độ polymer 56 Hình 3.10 Sự phóng thích hoạt chất (A)-theo loại polymer thứ cấp; (B)-theo loại polymer thứ cấp với tỉ lệ phối hợp 57 Hình 3.11 Phổ hấp thu UV (A)-PARs, (B)-FUR, (C)-phổ chồng PARs-FUR 59 xii Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu phân tích 62 Hình 3.13 Đồ thị hồi quy tuyến tích chất phân tích 62 Hình 3.14 Quy trình bào chế gel in situ furosemid 68 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh tim mạch có xu hướng gia tăng nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới tỉ lệ bệnh nhân suy tim với số ca tử vong tăng dần qua năm Thống kê cho thấy có khoảng 26 triệu trường hợp suy tim toàn giới với tỷ lệ tử vong cao (17%) 45% số ca tử vong xảy vòng năm sau chẩn đoán phần lớn năm sau nhập viện Đông Nam Á, tỷ lệ tử vong năm lên đến 15% Việc kiểm soát bệnh mối quan tâm hàng đầu y học giới Thực tế cho thấy việc kiểm soát suy tim không đạt hiệu mong muốn nhiều nguyên nhân, đáp ứng với thuốc điều trị (giúp làm chậm tiến triển bệnh, cải thiện triệu chứng giảm số lần nhập viện) tuân thủ bệnh nhân xem rào cản lớn Các thuốc lợi tiểu xem cơng cụ kiểm sốt tiến triển suy tim; furosemid thường định số bệnh nhân ngoại trú, để kiểm soát cân dịch ngày Furosemid thuốc lợi tiểu quai điển hình, cho tác dụng lợi tiểu nhanh mạnh nhiên thời gian bán thải ngắn khoảng với hiệu lực kéo dài - nên việc sử dụng liều lặp lại sau khoảng thời gian cần thiết tượng “giữ natri sau lợi tiểu” thận Sinh khả dụng đường uống furosemid không ổn định (khoảng 51%) ảnh hưởng độ tan, độ thấm (nhóm IV theo BCS) hệ thống bơm P-glycoprotein diện thành tế bào ruột Furosemid cho hấp thu tốt dày phần tá tràng; nhiên thời gian lưu thuốc nơi ngắn dẫn đến giới hạn lâm sàng furosemid Việc cải thiện thời gian lưu, kiểm sốt phóng thích dày với hệ thống mối quan tâm nhà bào chế giới nước furosemid dược chất tương tự Đề tài “Nghiên cứu bào chế gel in situ dày chứa furosemid” thực nhằm điều chế dạng gel in situ chứa furosemid dày cải thiện độ tan, tăng thời gian tồn lưu, giải phóng hoạt chất kéo dài giúp trình hấp thu thuốc hiệu hơn, giảm tần suất sử dụng, tăng tuân trị cho bệnh nhân Để hoàn thành mục tiêu đề ra, nội dung cần thực hiện: - Xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid - Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu - Nâng cỡ lô qui mô 2500 mL - Đánh giá sơ độ ổn định sản phẩm Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Furosemid 1.1.1 Cấu tạo danh pháp Cơng thức cấu tạo (hình 1.1) Cơng thức phân tử: C12H11ClN2O5S Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo furosemid Danh pháp IUPAC: 4-chloro-2-(furan-2-ylmethylamino)-5-sulfamoylbenzoic acid Khối lượng phân tử: 330,74 g/mol 1.1.2 Tính chất lý hóa Cảm quan: bột tinh thể màu trắng đến vàng, không mùi, khơng vị Nhiệt độ nóng chảy: 206 oC; logP = 2,30; pKa: 3,8 - 3,9 (carboxyl) Độ tan: 0,0731 mg/mL 30 °C; tan nước, ethanol, cloroform, ether; tan aceton, methanol, dimethyl formamid, dung dịch (dd) nước có pH > 8,0.6 Bảng 1.1 Độ tan (mg/mL) furosemid tỷ lệ Liều/ Độ tan (D/S) (mL) tương ứng ba sản phẩm viên nén có hàm lượng khác D/S (mL) 37 °C Môi 25°C 30°C 37°C 20 mg 40 mgb 500 mg trường Nước 0,018 pH 1,0 0,014 1429b 2857b 35,714c pH 1,2 0,024 833b 1667b 20833c pH 2,0 0,01 pH 2,3 0,18 pH 2,8 0,034 588b 1176b 14,705b pH 3,8 0,04 500b 1000b 12,500 pH 4,6 0,008 D/S (mL) 37 °C Môi 25°C 30°C 37°C 20 mg 40 mga 500 mg trường pH 4,8 0,156 128 256b 3205b pH 5,0 0,27-0,33 74 148 1852b pH 6,5 1,5-3,94 5,1 10 127 pH 7,4 1,9 pH 7,5 6,91 2,9 5,8 72 pH 8,0 21,9 8,91 2,2 4,5 56 pH 10 13,36 a Hàm lượng danh sách thuốc thiết yếu WHO b giá trị D/S vượt điểm tới hạn 1.1.3 Độ ổn định Furosemid (FUR) có độ tan kém, tiếp xúc với ánh sáng gây đổi màu Do vậy, nên bảo quản chế phẩm furosemid tránh ánh sáng; dd uống hay dd tiêm nên bảo quản 15 - 30 °C tránh đông lạnh, tránh trộn với dd có tính acid mạnh có khả tái kết tinh 1.1.3.1 Biến đổi vật lý cấu trúc FUR có tính đa hình Đặc điểm khiến FUR khơng ổn định đặc tính lý hóa độ nóng chảy, độ tan, hình thái hạt, tính chất quang học, phản ứng hóa học, ổn định thể chất Sự biến đổi đa hình làm ảnh hưởng trình sản xuất độ ổn định dạng bào chế Theo Yoshihisa Matsuda cộng (cs.) (1990) 9, FUR tồn với dạng gồm dạng kết tinh (dạng I II, III), dạng solvat (DMS solvat dioxan solvat), dạng vơ định hình dạng kết tinh sản xuất thương mại (dạng VI) khoảng thời gian nghiên cứu Các dạng có khả biến đổi lẫn số điều kiện định (hình 1.2) Hình 1.2 Sự biến đổi dạng furosemid điều kiện thử nghiệm khắc nghiệt Claudia Garnero cs (2016) 10 cho thấy việc tạo phức với β-cyclodextrin (β-CD) giúp cải thiện độ ổn định tính đa hình FUR Nghiên cứu thực đánh giá độ ổn định FUR dạng I, II phức hợp hai dạng với β-CD điều kiện lão hóa cấp tốc, cho tiếp xúc với ánh sáng, đặt tủ vi khí hậu thời gian tháng Kết quả, dạng II bị biến đổi vòng tháng, dạng I khơng có thay đổi đáng kể phức hợp với β-CD ổn định mặt hóa học vật lý điều kiện thử nghiệm 1.1.3.2 Độ ổn định điều kiện môi trường Sự phân hủy quang học furosemid môi trường pH Khi tiếp xúc với tia UV, thời gian bán hủy FUR thay đổi khoảng từ - 24 tùy thuộc vào nguồn sáng, môi trường pH FUR cho thấy tính ổn định môi trường kiềm, dung môi hữu môi trường micellar có tính acid, tránh ánh sáng.11 Dd FUR pH - 10, không bị phân hủy 24 tiếp xúc với ánh sáng phịng thí nghiệm ánh sáng ban ngày bình thường 12-14 Trong dd nước dung môi hữu cơ, FUR bị phân hủy quang thành acid 4chloro-5-sulfamoylanthranilic (CSA) furfuryl alcohol, nhanh chóng chuyển thành acid levulinic (hình 1.3) 11 Đặc biệt dd acid, phân hủy diễn nhanh, theo động học bậc (hình 1.4); nhanh pH 1-2 sau giảm dần tăng pH (bảng 1.2) 12 Có thể thấy, hàm lượng FUR bị suy giảm nhiều điều kiện chiếu sáng, đặc biệt mơi trường acid Vì vậy, trình nghiên cứu, cần thận trọng bảo vệ hoạt chất tránh phân hủy quang học O O H2N S OH O Cl N H furosemid O hv O H2N S O Cl O O OH OH NH2 furfuryl alcohol axit 2-amino-4-chloro-5sulfamoylbenzoic (CSA) O OH O axit levulinic Hình 1.3 Các đường phân hủy quang furosemid Hình 1.4 log[furosemid] theo thời gian dd đệm tiếp xúc ánh sáng Bảng 1.2 Thời gian bán hủy (t1/2) furosemid môi trường pH điều kiện tiếp xúc ánh sáng phịng thí nghiệm pH 1,0 2,0 3,0 3,5 t1/2 (phút) 150 155 201 310 pH 4,0 4,5 4,9 t1/2 (phút) 440 1150 2010 Ảnh hưởng pH lên độ ổn định furosemid điều kiện tránh sáng Bundgaard cs (1988) 12 xác định tốc độ thủy phân FUR 37 °C, môi trường acid, tránh sáng Kết FUR ổn định pH 1,0 (t1/2 = 17,2 giờ); thủy phân xảy chậm so với báo cáo trước (t1/2 = 15) Như vậy, điều kiện tránh ánh sáng, thủy phân môi trường acid dày yếu tố quan trọng dẫn đến hấp thu khơng hồn tồn FUR 12,16 Ảnh hưởng oxy độ ẩm khơng khí lên độ ổn định furosemid điều kiện tránh sáng Katsura cs (2017) 17 đánh giá ảnh hưởng độ ẩm khơng khí (khơng khí, oxy nitơ) đến đổi màu viên FUR (dạng I – dạng thù hình ổn định nhất) mơi trường tránh sáng Kết quả, chất phân hủy màu vàng (CSA) xuất khơng có chuyển đổi dạng tinh thể xảy trình tạo viên Sự biến đổi màu tăng nhanh q trình oxy hóa; độ ẩm khơng ảnh hưởng đến q trình phân hủy Bảng 1.3 Sự biến đổi màu viên furosemid điều kiện bảo quản 17 Điều kiện bảo quản 15 °C/ 40-60% RH 25 °C/ 40-60% RH 25 °C/ 75% RH 40 °C/ 40-60% RH Sự biến đổi màu (ΔE) tuần 0,3 0,2 0,4 0,3 tuần 0,2 0,6 0,5 0,5 Điều kiện bảo quản 40 °C/ 75% RH 50 °C/ 40-60% RH 60 °C/ 40-60% RH Sự biến đổi màu (ΔE) tuần 0,5 0,4 0,6 tuần 0,4 1,1 1,5 Bảng 1.4 Sự biến đổi màu viên nén furosemid bảo quản tác động khơng khí, oxy nitơ 17 Điều kiện bảo quản Sự biến đổi màu (ΔE) ngày Không khí 0,5 Oxy 1,2 Nitơ 0,5 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ ổn định furosemid điều kiện tránh sáng Nghiên cứu Melane (2002) 18 cho thấy đường cong phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) phân tích nhiệt trọng lượng (TG) FUR hỗn hợp vật lý FUR : β-CD chắn sáng điều kiện chiếu xạ (16 giờ, 550 W/m2) khơng có thay đổi đáng kể so với mẫu ban đầu Trong điều kiện chiếu xạ, sản phẩm phân hủy làm giảm điểm nóng chảy FUR, tăng cường phân hủy nhiệt 1.1.4 Kiểm nghiệm 1.1.4.1 Nguyên liệu Định tính Một số phương pháp sử dụng: - Phổ hấp thụ hồng ngoại 19 - Quang phổ UV-Vis 19: có cực đại hấp thụ bước sóng 228 nm, 270 nm 333 nm Tỷ số độ hấp thụ bước sóng 270 nm 228 nm phải từ 0,52 đến 0,57 - Phản ứng tạo chất màu đỏ tím đặc trưng (hình 1.5) 19 - Sắc ký lớp mỏng 20 O H2N S O Cl O NH O OH O H2 N S O H H 2O Cl NH2 O furosemide HO O OH NaNO2 O H2N S O Cl HN N OH O O H2N S O N Cl N O OH N HN Hình 1.5 Sự hình thành hợp chất acid 4-cloro-5-sulfamoylanthranilic màu đỏ tím 21 Định lượng - Chuẩn độ đo điện 19 - Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 20, 22 1.1.4.2 Thành phẩm Định tính - Viên nén: Quang phổ hấp thụ UV - Dd tiêm: Phản ứng màu Định lượng - Sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 22 Bảng 1.5 Phương pháp định lượng HPLC số chế phẩm22 USP 44 Dd uống Viên nén Dd tiêm Dd chuẩn mg/mL FUR chuẩn mg/mL FUR chuẩn 1,0 mg/mL FUR chuẩn Dd thử 1,0 mg/mL FUR chế phẩm 1,0 mg/mL FUR chế phẩm 1,0 mg/mL FUR chế phẩm Nước : acetonitril : acid nước : acetonitril : acid acetic băng (22:22:1) acetic băng (489:489:22) Nước : acetonitril : acid Nước : tetrahydrofuran : Nước : tetrahydrofuran : acetic băng (165:35:2) acid acetic băng (70:30:1) acid acetic băng (70:30:1) UV 254 nm UV 254 nm UV 254 nm Cột L10 (25 cm × 4,6 mm) L10 (25 cm × 4,6 mm) L1 (25 cm × 4,6 mm) Tốc độ dòng mL/ phút 1,0 mL/ phút 1,0 mL/ phút Thể tích tiêm 10 µL 20 µL 20 μL Dung môi Pha động Điều kiện sắc ký - Bước sóng phát 22 mL acid acetic băng hỗn hợp acetonitril : nước (50:50) vừa đủ 1000 mL Phương pháp đo quang phổ UV-Vis: dd tiêm 19,20, viên nén 19 + Dd thử: 10 µg/mL + Dung mơi pha loãng: nước, NaOH 0,1 M + Đo độ hấp thụ bước sóng 271 nm 1.1.5 Tính chất dược lý Dược lý chế tác dụng FUR thuốc lợi tiểu dẫn chất sulfonamid, tác dụng mạnh, nhanh, phụ thuộc liều lượng Thuốc ức chế hệ thống đồng vận Na+ K+ 2Cl- đoạn dày nhánh lên quai Henle, làm tăng thải trừ chất điện giải nước, có tăng đào thải Ca++ Mg++ Tác dụng lợi tiểu mạnh kéo theo tác dụng hạ huyết áp yếu 23 Dược động học FUR hấp thu nhanh khơng hồn tồn qua đường uống, chậm bệnh nhân bị phù nề, đặc biệt bệnh nhân suy tim bù FUR có tác dụng sau 1/2 giờ, đạt nồng độ tối đa sau - trì tác dụng từ - giờ, kéo dài với tác dụng chống tăng huyết áp 23 FUR chuyển hóa thành furosemid glucuronid, có tác dụng lợi tiểu FUR thải trừ chủ yếu qua nước tiểu 5,23, hoàn toàn 24 giờ, phần lớn dạng khơng chuyển hóa 23 Ngoài ra, FUR chịu ảnh hưởng hệ thống P-glycoprotein đường tiêu hóa 7, dẫn đến FUR bị bơm ngược trở sau vận chuyển qua màng Sự hấp thu FUR kéo dài giảm thức ăn 23 Chỉ định FUR định phù phổi cấp; phù tim, gan, thận loại phù khác; tăng huyết áp có tổn thương thận; tăng calci huyết 23 Liều lượng - Phù: Liều khởi đầu thường dùng 40 mg/ngày Chỉnh liều cần thiết - Tăng huyết áp người có tổn thương thận: Liều dùng đường uống 40 - 80 mg/ngày, dùng đơn độc phối hợp với thuốc hạ huyết áp khác - Tăng calci máu: 120 mg/ngày uống lần chia làm liều nhỏ 23 1.1.6 Một số chế phẩm chứa furosemid thị trường Hiện nay, thị trường nước, furosemid lưu hành chủ yếu dạng viên nén dd tiêm Các dd uống lưu hành số nước chưa có thị trường Việt Nam Bảng 1.6 Một số chế phẩm chứa furosemid thị trường 6,24 Đường dùng Dạng bào chế Uống Viên nén Hàm lượng Brand generic (Nhà sản xuất) 20; 40; 80 mg Lasix (Sanofi-Aventis) Uloviz (Slavia Pharm S.R.L Romania) 40 mg Becosemid (Meyer – BPC) Polfurid Polfarmex S.A - Poland Tiêm 1.2 Dd tiêm 10 mg/mL Furosol (Danapha - Việt Nam) Phương pháp cải thiện độ tan Nhiều hoạt chất tan gây ảnh hưởng sinh khả dụng, ảnh hưởng hiệu điều trị Vì vậy, nhiều phương pháp cải thiện độ tan ứng dụng, nâng cao hiệu điều trị nhiều hoạt chất Một số phương pháp thường sử dụng bao gồm: điều chỉnh pH/ tạo muối chỗ, đồng dung môi, chất diện hoạt, tạo phức, dạng bào chế đặc biệt… 10 Thực tế, môi trường pH dày, muối acid yếu (cụ thể FUR) hòa tan nhờ tác dụng tự đệm muối Các tiểu phân hoạt chất dd dày phần di chuyển xuống ruột hấp thu đó, phần khác chuyển thành acid tự khơng ion hóa dày, thường dẫn đến bão hòa tăng nguy kết tủa Các kết tủa tồn dạng hạt mịn (vơ định hình tinh thể) tạo thành lớp acid tự hòa tan xung quanh hạt muối, ức chế hòa tan dày Khi trình làm rỗng dày xảy ra, kết tủa lại có xu hướng hịa tan mơi trường có pH cao ruột non Q trình miêu tả cụ thể hình 1.6 Hình 1.6 Sự hịa tan kết tủa muối dày rỗng trình vận chuyển vào ruột non 25 Vì vậy, sử dụng số phương pháp kết hợp với tạo muối để cải thiện độ tan giúp hình thành tủa dạng vơ định hình FUR cần thiết trường hợp dạng bào chế trì thời gian dài điều kiện acid dày 1.3 Hệ thống dày 1.3.1 Sự phát triển hệ thống dày Các hệ thống phân phối thuốc tồn lưu dày (Gastro Retentive Dosage Forms - GRDFs) đời phát triển dựa tỷ trọng dạng bào chế GRDFs phân thành dạng hệ thống có tỷ trọng cao hệ thống có tỷ trọng thấp 11 1.3.1.1 GRDFs tỷ trọng cao GRDFs tỷ trọng cao hay gọi hệ thống lắng, có tỷ trọng cao tỷ trọng dịch dày (~3 g/cm3) Khi vào tới khoang dày, hệ thống chìm xuống đáy, kẹt nếp gấp antrum, tránh tác động sóng nhu động, nên giữ lại dày Tá dược thường sử dụng bari sulfat, oxit kẽm, bột sắt titan dioxid Những tá dược làm hạn chế tính ứng dụng hệ thống, tương tác với thành phần cơng thức, giảm tính ổn định dạng thuốc.26 1.3.1.2 GRDFs tỷ trọng thấp GRDFs tỷ trọng thấp phổ biến Trái ngược với hệ thống tỷ trọng cao, hệ thống tỷ trọng thấp nằm lơ lửng phần dày nhằm kéo dài thời gian lưu trữ, nên gọi hệ thống Hệ thống nêu rõ phần sau Ngoài ra, số dạng GRDFs khơng theo ngun tắc tỷ trọng, mà dựa vào kích thước hệ thống hệ thống mở rộng, hệ thống trương phồng,… Các hệ thống thay đổi kích thước, trì hỗn việc rời khỏi dày nhờ kích thước đủ lớn tạo ảo giác trạng thái đầy dày, làm chậm lại sóng nhu động quét thức ăn xuống ruột non Một dạng GRDFs khác hệ thống kết dính màng sinh học, phát triển dựa khả kết dính bề mặt niêm mạc đường tiêu hóa, thơng qua lực dính hydrat hóa liên kết thơng qua số thụ thể tương ứng, giúp cho thuốc tiếp cận vị trí hấp thu vị trí tác động niêm mạc đường tiêu hóa Hiện nay, số dạng GRDFs cải tiến đời: hệ thống xung nổi, hydrogel siêu xốp, hệ thống làm việc kép, hệ thống thẩm thấu nổi,… cải thiện số hạn chế GRDFs truyền thống.26 Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống GRDFs, từ trái sang phải: nổi, lắng, trương nở, giãn nở (mở ra), kết dính niêm mạc 27 12 1.3.2 Đặc điểm Hệ thống giúp hoạt chất kéo dài thời gian lưu trữ dày, bào chế dạng giải phóng hoạt chất (GPHC) kéo dài, giúp giảm phụ thuộc liều; giảm tần suất dùng thuốc; cải thiện tuân thủ bệnh nhân; làm tăng sinh khả dụng thuốc hấp thu chủ yếu từ dày hay thuốc có t1/2 ngắn Tuy nhiên, cần cân nhắc số hạn chế hệ thống trình thiết kế dạng thuốc, bao gồm: thể tích dịch dày phải đủ lớn để đạt độ nổi, tính khơng phù hợp thuốc có vấn đề độ hịa tan, ổn định dịch dày hay tính kích ứng niêm mạc dày Ngồi ra, đơi bị cản trở với diện khối dưỡng trấp Trên thực tế, nghiên cứu hệ thống phụ thuộc nhiều vào thức ăn để kéo dài trình làm rỗng dày Thể tích dày trạng thái rỗng khơng đủ cho dạng bào chế để đạt đủ độ nổi, theo đó, chúng coi có hiệu trạng thái no Khi thiết kế hệ thống nổi, vấn đề hoạt chất, cần lưu ý thông số thời gian từ dạng bào chế tiếp xúc với dịch dày đến (thời gian tiềm thời) Nếu thời gian bắt đầu trễ, thuốc chịu tác động sóng nhu động, đẩy thuốc vào ruột, làm mục đích thiết kế hệ thống ban đầu.26 1.3.3 Phân loại Các hệ thống thiết kế cách sử dụng hai cách tiếp cận riêng biệt: sủi bọt không sủi bọt 1.3.3.1 Hệ thống không sủi bọt Các hệ thống chứa lượng lớn polymer có khả tạo gel với độ trương nở cao, bao gồm polysaccharid, polystyren, polycarbophil, polyacrylat, polymethacrylat dẫn chất cellulose Sau đến khoang dày, polymer trương phồng lên hydrat hóa, hình thành gel Lớp gel cản trở xâm nhập dịch dày bên hệ thống phân phối, đơi trì giải phóng hoạt chất Độ dạng bào chế nhờ phần khơng khí bị kẹt bên lớp gel trương nở, cuối làm giảm tỷ trọng dạng bào chế 26 13 1.3.3.2 Hệ thống sủi bọt Các hệ thống sủi bọt nhờ sử dụng thành phần NaHCO3, acid citric, acid tartaric tạo CO2 thông qua phản ứng acid hữu kiềm bicarbonat hay carbonat Hệ thống kết hợp dung mơi hữu dễ bay 1.3.4 Một số yếu tố sinh lý ảnh hưởng GRDFs Các hệ thống GRDF muốn đạt mục đích thiết kế, phải cân nhắc nhiều sinh lý dày Một số yếu tố xét đến: 1.3.4.1 Động lực học thời gian qua dày Cản trở lớn dạng thuốc GRDFs sóng nhu động dày, sóng co thắt lưu động (MMC) giai đoạn III với chu kì 1,5–2 giờ, tạo co thắt mạnh mẽ, tống vật thể lớn khỏi dày Thời gian tồn lưu sau dùng thuốc thời điểm dày rỗng (sau thời gian nhịn ăn giờ) phụ thuộc chủ yếu MMC, thường không 1-2 Tuy nhiên, MMC lúc dày có khác biệt thời gian tái khởi động MMC cá thể Một số nghiên cứu cho thấy chu kì tới 180 phút 27 Ở trạng thái no, tốc độ đẩy thức ăn khỏi dày điều hồ tín hiệu thần kinh hormon từ dày tá tràng, chủ yếu tín hiệu điều hịa ngược từ tá tràng, ức chế thoát thức ăn xuống tá tràng 28 Lúc này, kích thước định đến thời gian tồn lưu dày dạng bào chế Các hạt nhỏ pellet trộn vào dưỡng trấp đẩy khỏi dày q trình tiêu hóa thức ăn Ngược lại, hệ thống lớn khó tiêu sử dụng sau bữa ăn có khả tồn dày kết thúc trình làm rỗng dày Sự vận chuyển bị đảo ngược trạng thái rỗng dày 27 1.3.4.2 pH Môi trường acid dày (pH - 3,5) có khả phân giải, biến đổi hầu hết chất, đặc biệt phân tử thuốc bền, làm giảm đáng kể hiệu lực điều trị thuốc 29 Sau đó, pH biến đổi theo chiều hướng tăng dần đường tiêu hóa Sự biến động pH dày liên quan nhiều đến thức ăn Ở trạng thái rỗng, dày thường chứa khoảng 10 - 50 mL dịch acid Việc sử dụng thuốc với 240 14 mL nước dẫn đến tăng thể tích đồng thời tăng pH tới 4,6 Sau đó, pH giảm nhanh chóng dịch đẩy khỏi dày khoảng 30 phút Sự biến đổi xáy với thức ăn Sau bữa ăn, giá trị pH ban đầu tương tự pH trạng thái dày rỗng, thường tăng thời gian dài hơn, thành phần thức ăn đệm dịch tiết dày Với bữa ăn tiêu chuẩn có hàm lượng calo chất béo cao, giá trị pH giảm từ khoảng 4,6 đến 1,0 gần tuyến tính vịng Kết tương tự thu bữa ăn lỏng 27 Có thể thấy, yếu tố biến động nhiều trạng thái dày rỗng no Một mối quan hệ tuyến tính thời gian cư trú dày hàm lượng calo bữa ăn trước dùng thuốc xác định 30 Sự ảnh hưởng thực phẩm nên hạn chế phải kéo dài đủ thời gian để hệ thống thể đặc tính thiết kế mong muốn Một khuyến nghị dùng bữa ăn nhẹ 250 kcal, thời gian cư trú dày dự kiến tối đa cho dạng bào chế kích thước lớn, khơng tan rã khoảng 27 1.4 Hệ thống hình thành màng gel in situ 1.4.1 Đặc điểm Hệ thống màng gel in situ có ưu điểm vượt trội dạng viên cải thiện vấn đề sử dụng cho bệnh nhân gặp khó khăn với vấn đề nuốt, khả phân liều dễ dàng so với dạng viên phóng thích kéo dài khơng thể bị phá vỡ cấu trúc, khả phụ thuộc vào kích thước hoạt chất tan mơi trường acid hịa tan tốt dd tạo gel Các hệ thống gel in situ trạng thái lỏng nhiệt độ phòng (hay dạng bột thuốc hòa tan tạo dd), vào thể chuyển đổi thành gel, tạo thành lớp màng bề mặt dịch dày (hình 1.8) 26, cung cấp khả lưu giữ dày mong muốn để kéo dài thời Hình 1.8 Quá trình hình thành gel in situ gian tiếp xúc, đồng thời tạo giải dày 15 phóng thuốc liên tục chậm qua lớp gel hình thành Khả đạt tỷ trọng lớp gel hình thành nhẹ tỷ trọng dịch dày không khí tạo thành bị mắc kẹt khối gel 26 Sau phóng thích thuốc, hệ thống đẩy khỏi dày 1.4.2 Cơ chế hình thành gel in situ Sự hình thành gel in situ vật liệu sinh học diễn dựa theo yếu tố: kích thích sinh lý (nhiệt độ pH), biến đổi vật lý vật liệu sinh học (trao đổi dung mơi trương nở), phản ứng hóa học (q trình trùng hợp nhờ enzym, hóa chất quang hóa) 31 - Nhiệt độ: hydrogel có khả chuyển pha sol-gel nhiệt độ môi trường sinh lý, tạo dd lỏng nhiệt độ phòng (20 - 25 ºC) gel hóa tiếp xúc thể (35 - 37 ºC) Polymer có thay đổi đột ngột độ hòa tan để đáp ứng với gia tăng nhiệt độ môi trường (vượt nhiệt độ dd tới hạn, LCST), dẫn đến biến đổi thể chất, tạo gel Ngồi ra, số polymer lưỡng tính làm tăng LCST polymer N-isopropylacrylamid-co-butylmethacrylat - pH: kích hoạt trình sol-gel polymer chứa nhóm chức acid kiềm, đặc biệt với polymer có số lượng lớn nhóm ion hóa (polyelectrolyte) Sự trương nở hydrogel tăng pH môi trường tăng trường hợp nhóm anion, giảm polymer chứa nhóm cation - Trương nở: vật liệu hấp thụ nước từ môi trường xung quanh mở rộng - Khuếch tán: dung môi từ dd polymer vào mô xung quanh dẫn đến kết tủa hóa rắn khung xốp polymer - Phản ứng hóa học dẫn đến keo hóa chỗ liên quan đến kết tủa chất rắn vơ từ dd ion siêu bão hịa, trình enzym trình quang học - Liên kết ion: polymer trải qua q trình chuyển pha với có mặt ion khác nhau, thường ion đa hóa trị Ví dụ keo hóa acid alginic với có mặt cation đa hóa trị tương tác với acid glucuronic - Liên kết enzym: gel in situ xúc tác enzym tự nhiên chưa nghiên cứu rộng rãi, ưu điểm sử dụng enzym hoạt động hiệu điều kiện 16 sinh lý thể mà khơng cần hóa chất có khả gây hại Sự kiểm sốt tốc độ hình thành gel phù thuộc vào lượng enzym - Phản ứng trùng hợp nhờ ánh sáng: thường sử dụng cho vật liệu sinh học Dd monomer macromer tiêm vào mô sử dụng xạ điện từ để tạo gel Thơng thường bước sóng cực tím dài bước sóng khả kiến sử dụng để đảm bảo tính an tồn Nhiều loại polymer dùng để tạo gel in situ dày có nguồn gốc từ thiên nhiên alginat, pectin, chitosan, gôm guar, gôm gellan, xyloglucan, … số polymer tổng hợp HPMC, carbomer,… Các polymer in situ dùng nên tương thích sinh học pseudoplastic Bảng 1.7 Một số tác nhân kích thích q trình sol-gel Loại kích thích Vật lý Hóa học Sinh học Một số tác nhân Nhiệt độ Chitosan-poly (acrylamid) Ánh sáng Poly (trimethylenium iminium trifluorosulfonimid) 2,6-bis(benzoxal-2-yl) pyridin Áp suất Poly (N-isopropylacrylamid), poly(N,N-diethylacrylamid) Dòng điện Polythiophen polypyrrol Từ trường Magnetite nanoparticles poly(acrylamid) composite hydrogels Siêu âm Ca alginat; poly(lactic acid) pH Poly (acid acrylic), Guar gum succinat, Kappa-carrageenan/poly(vinyl alcohol) Nồng độ ion Kappa carrageenan-g-poly(acrylic acid) hydrogels CO2 Poly (2-hydroxyethylmethacrylat)-co-(2-dimethylaminoethylmethacrylat) Glucose Poly (acrylamid)-co-(3-acrylamidophenylboronic acid) Enzym Glycidylmethacrylat dextran-g-poly (acrylic acid) DNA Single stranded DNA probe-g-poly(acrylamid) hydrogels Kháng nguyên N-succinimidyl acrylat 1.4.3 Các tiêu chí đánh giá đặc tính hệ gel in situ GRDF 26 Hệ gel in situ dày dạng bào chế Vì vậy, tiêu chuẩn kiểm nghiệm chưa quy định cụ thể dược điển Để đánh giá hệ gel 17 in situ, số đặc tính đề nghị dựa hướng dẫn ICH, hay chuyên luận chung dược điển, thực tế sản xuất đề Tiêu chuẩn chung: cảm quan dạng bào chế, định tính, định lượng, độ hịa tan, đồng hàm lượng/ khối lượng, pH… In vitro: - Tỷ trọng riêng - Độ / khả - Thời gian tiềm thời (thời gian tính từ lúc hệ gel in situ tiếp xúc với môi trường đến bề mặt mơi trường) - Phân tích kết cấu gel In vivo: xạ hình (γ-Scintigraphy), X-ray, MRI, kiểm tra thở 13 C acid octanoic, nội soi dày, siêu âm 1.5 Một số nghiên cứu tạo hệ thống dày chứa furosemid Bảng 1.8 Một số nghiên cứu hệ thống dày chứa furosemid Hệ thống Thành phần tạo gel Thành phần tạo khí Gel in situ iota-carrageenan, Na alginat NaHCO3 Viên nén HPMC K15M - Viên nén HPMC K4M carbomer 934 NaHCO3 Lớp 1: HPMC 4000 Viên polymer tạo khung NaHCO3, nén giữ bọt khí acid citric lớp Lớp 2: HPMC 100 kiểm sốt phóng thích 1.6 Đặc tính Thời gian Tài liệu kiểm sốt cơng bố Thời gian Giải phóng 94,9% Alhamdany A.T tiềm thời: cs (2014) 32 thuốc sau 35±0,02 s Thời gian Mơ hình động học Kavitha K tiềm thời: Higuchi (9 giờ): Nachiya J D.R (2019) 33 4,5 phút R =0,995 Thời gian Mơ hình động học Vishal G tiềm thời: bậc (12 giờ): Karkhile cs (2010) 34 163 s R = 0,9772 - 0,9911 Thời gian Mơ hình động học tiềm thời: giải phóng bậc 0: 15 phút số 6,21 mg/giờ Nurten Ozdemir cs (2000) 35 Polymer Việc lựa chọn polymer để điều chế hệ thống phân phối thuốc gel in situ cần xem xét yếu tố: tính tương thích sinh học, phân hủy sinh học, độ bền học đủ trì điều kiện bảo quản điều kiện sinh lý thời gian phù hợp 18 1.6.1 Polymer nhạy với pH Các polymer thiên nhiên nhạy pH sử dụng rộng rãi lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm số ngành cơng nghiệp khác Trong đó, bốn polymer thơng dụng phải kể đến là: Na alginat, acid hyaluronic, Hình 1.9 Trạng thái chuỗi polymer tùy thuộc vào mức độ ion hóa (A)-polyacid; (B)-polybase chitosan Alginat CMC sử carboxymethyl cellulose (CMC), dụng nghiên cứu - Alginat polysaccharid chiết xuất từ rong biển nâu, bao gồm đồng trùng hợp khối acid β-D-mannuronic (M) acid α-L-guluronic (G) theo cách xếp tỷ lệ khác thay đổi tùy thuộc vào nguồn alginat Tỷ lệ M/G định đến tính chất gel Sự nhạy cảm với pH alginat bắt nguồn từ nhóm -COOH (có khối M, G) Ở pH thấp, alginat co lại hình thành khối gel cứng Ngồi ra, hình thành gel alginat thúc đẩy liên kết ngang ion Ca2+ khối G alginat Gel hình thành khơng có đảo nghịch Bên cạnh tiếp xúc với nhiệt độ 70 oC làm giảm độ nhớt vĩnh viễn phần dd Na alginat 36 Vì vậy, trình điều chế alginat, cần lưu ý yếu tố nhạy cảm alginat độ pH, hàm lượng calci nhiệt độ - CMC dẫn xuất cellulose anion, nhóm -OH monomer glucopyranose tạo liên kết với nhóm -CH2COONa, biểu thị số (DS, số lượng nhóm -CH2COONa đơn vị monomer) Với DS khác nhau, đặc tính CMC có khác 37 Độ nhạy pH CMC nhóm -COOH, đặc biệt CMC có DS lớn Ở pH thấp (pH < 2), dd Na CMC có khả kết tủa; giảm độ nhớt pH > 10 36 Trong dd NaOH 0,5 M, khác biệt độ nhớt dd có DS khác nhau, q trình hịa tan cellulose khơng thay dd nước thúc đẩy 38 Na CMC phân tán hòa tan tốt 40-50 oC 19 Khi nhiệt độ > 50 oC, CMC có khả phân giải phần Một số nghiên cứu dựa kết hợp alginat CMC cho thấy hình thành hydrogel có độ bền học đạt yêu cầu 39, với kiểm soát phóng thích hoạt chất tốt 40 Bên cạnh polymer thiên nhiên nhạy pH, polymer tổng hợp sử dụng rộng rãi, có carbomer Carbomer acid polyacrylic liên kết ngang với allyl sucrose allyl pentaerythritol, chứa từ 56-68% nhóm COOH 41 – nguồn gốc trình chuyển đổi sol-gel Carbomer trương nở nước, khơng hịa tan Carbomer sử dụng công thức dược phẩm dạng lỏng bán rắn chất điều chỉnh lưu biến, kết dính sinh học; ổn định nhũ tương, điều chỉnh phóng thích hoạt chất 36 Một số nhóm polymer khác (khơng nhạy với pH) thường dùng - Hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) polymer bán tổng hợp, sử dụng rộng rãi dược phẩm HPMC đóng vai trị tá dược kiểm sốt giải phóng hoạt chất, chất hòa tan, ổn định, làm đặc tăng độ nhớt HPMC trương nở nước, không nhạy với pH, có biến đổi sol-gel theo nhiệt độ - Povidon (PVP): monomer 1-vinyl-2- pyrrolidinon trùng hợp tạo thành PVP tan nước, với nồng độ tối đa bị giới hạn độ nhớt dd PVP sử dụng làm tá dược dính cho thuốc viên, tính tan cho thuốc tiêm, sử dụng tác nhân tạo màng, tăng cường độ nhớt, bơi trơn dính 41 Hình 1.10 Cấu trúc số polymer 20 Bảng 1.9 Đặc tính số polymer 36 Polymer Loại polymer Na alginat ionic Na CMC ionic Carbomer 974P ionic - PVP K30 nonionic - HPMC K15M nonionic Độ nhớt pH 20-400 cP (1%) 5-2000 cP 7,2 (1%) 6-8 (1%) 2,5-3 (1%) 17700 cP (2%) 3-5 5-8 (2%) pH ổn định Tính tan 4-10 tan chậm nước 7-9 tan nước 6-11 - 3-11 trương nở nước tan acid, nước Ảnh hưởng nhiệt sol-gel bị phân giải pH, liên o > 70 C kết ion bị phân giải pH > 50 oC ổn định pH 104 oC - 50-90 oC: hóa tan nước gel, q trình lạnh, phần đảo ngược nước nóng làm lạnh nhiệt độ nhiệt độ 1.6.2 Hỗn hợp polymer Trong trình nghiên cứu dược phẩm, việc sử dụng phối hợp polymer thường mang lại nhiều kết tối ưu cho thành phẩm Các hỗn hợp polymer tương tác khơng tương tác vật lý hay hóa học, phân thành loại: polymer đồng thể polymer dị thể Trong đó, loại polymer dị thể thường chiếm nhiều khác biệt đặc tính loại polymer thành phần Đánh giá mức độ trộn hợp hỗn hợp polymer hay mức độ tương tác polymer, nhiều phương pháp sử dụng: giãn đồ pha, độ nhớt dd, phổ hồn ngoại, ảnh hiển vi điện tử quét (SEM), momen xoắn, tính chất học, 42 Trong điều kiện đơn giản, phương pháp Molar sử dụng cách trộn hợp polymer dung mơi hịa tan Quan sát có tách pha, polymer khơng có tương hợp; dd polymer vẩn đục, polymer tương hợp phần 1.7 Calci chất tạo phức Calci (Ca) yếu tố có vai trị định đến gel hóa alginat ngồi pH Sự gel hóa việc hình thành liên kết chéo tĩnh điện qua trung gian ion Ca2+ polymer acid polyuronic mạch thẳng, tiểu phân G phân tử alginat cho có lực lớn với ion Ca2+ Đối với dạng bào chế gel in situ, gel hóa có ý nghĩa nhiều diễn 21 mơi trường in vitro Kiểm sốt hình thành Ca alginat cần thiết Các tác nhân tạo phức chelat sử dụng với mục đích (Nguồn: Kimica) Hình 1.11 Sự hình thành liên kết ngang calci chuỗi polymer Chất tạo phức chelat (chelator) hợp chất hóa học phản ứng với ion kim loại để tạo thành phức chất bền Các chất tạo phức thường hợp chất hữu Một số chất tạo phức thường sử dụng: - Citrat: có sẵn dạng muối kali natri Citrat có ba nhóm -COOH cấu trúc, cho khả bắt giữ ion kim loại - EDTA – tạo phức kim loại thơng qua bốn nhóm acid hữu hai nhóm amin giàu điện tử (nitơ) cấu trúc EDTA dinatri sử dụng phổ biến công thức dược phẩm nhờ khả tạo phức mạnh mẽ, nhiên giới hạn nhỏ cho phép tính an tồn - Gluconat – nhóm acid hữu mang điện tích âm (-COOH) đóng vai trị thu giữ ion kim loại Nhiều nhóm OH phân tử gluconat tham gia Na gluconat bền khơng có vi sinh vật, bị phân hủy nhanh có vi sinh vật Khả phân hủy sinh học ưu lớn gluconat, so với EDTA không dễ phân hủy sinh học - Glucoheptonat (gluceptat): thành phần cấu trúc tương tự gluconat phân tử dài với gia tăng nhóm -CH2OH Việc lựa chọn chất tạo phức thường phụ thuộc vào khả tạo phức điều kiện khảo sát tính an tồn sử dụng Một số đặc tính ảnh hưởng đến hình thành phức bao gồm: số cân (logK) hình thành phức kim loại, trọng lượng phân tử, hệ số phân chia lipid/nước (Kpar), điện tích chất chelat - pKa phối tử độ pH 43 Ngoài ra, chất tạo phức thân thiện với môi trường ưu tiên sử dụng, citrat hay gluconat - với giá trị pH 22 phạm vi cao, khả tạo phức tương đương chí lớn chất tạo phức thường sử dụng EDTA.44 Bảng 1.10 Đặc tính số muối/phức calci Muối/phức pH/ pKa Calci EDTA Citrat Glucoheptonat 6,3 Lactat.5H2O pH = 6,0 - 8,5 (10%) Glycerophosphat Gluconat.H2O - M 490,4 308,4 210,1 448,4 LogK 26 Tính tan nước [ML]/[M][L] [MHL]/[M][H][L] tan 11,6 15,0 3,4 7,6 tan 1,25 tan tan tan 2,2 - Hình 1.12 Một số chất tạo phức thường dùng 23 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Hệ gel in situ furosemid 40 mg 2.2 Nguyên liệu thiết bị 2.2.1 Ngun liệu, hóa chất, dung mơi Hoạt chất: Furosemid – Đạt tiêu chuẩn dược điển hành Tá dược, hóa chất, dung mơi đạt tiêu chuẩn dược dụng, phân tích, nhà sản xuất Bảng Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất, dung mơi STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Nguyên liệu - Hóa chất – Dung mơi Furosemid Na alginat Natri carboxylmethyl cellulose Carbomer 974P Hroxypropyl methylcellulose Povidon K30 Ca lactat (pentahydrat) Ca gluconat (monohydrat) Ca glucoheptonat Ca glycerophosphat Na citrat (dihydrat) EDTA dinatri (dihydrat) Natri bicarbonat Methyl paraben Propyl paraben Propylenglycol Polyethylene glycol 400 Polysorbat 80 Acid hydrochloric Acetonitril HPLC grade Acid acetic băng HPLC grade Tiêu chuẩn USP EP TC NSX USP, EP USP USP TC NSX TC NSX EP USP TC NSX TC NSX TC NSX USP USP USP TC NSX EP TC NSX Xuất xứ Trung Quốc Nhật Thái Lan Pháp Mỹ Trung Quốc Trung Quốc Ấn Độ Pháp Pháp Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Mỹ Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Đức Hàn Quốc Bảng 2.1 Danh mục chất đối chiếu Tên chất đối chiếu Furosemid Methyl paraben Propyl paraben Nguồn gốc Viện KNT TP HCM Sigma Sigma Hàm lượng 99,7% 99,9% 100,0% Số lô QT129 060121 0000179833 0000205475 Hạn dùng 30/01/2024 06/2026 12/2025 24 2.2.2 Trang thiết bị Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu STT 10 11 12 2.3 Trang thiết bị Cân kỹ thuật Cân phân tích XB 220A Hệ thống HPLC Máy đo pH Máy ly tâm Máy khuấy đũa Máy khuấy từ gia nhiệt Máy quang phổ UV-1900i Máy siêu âm Máy thử độ hịa tan PTWS D620 Máy vortex Tủ vi khí hậu SGK 200L502 Hãng - Nơi sản xuất Sartorius - Đức Precisa – Thụy Sĩ Waters - Mỹ Mettler Toledo – Mỹ Eppendorf® MiniSpin® - Đức Stuart UC152 - Anh Shimadzu – Nhật Sonorex RK 510H – Đức Pharma Test – Đức 3412 EU – Đức Ấn Độ Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid 2.3.1.1 Thẩm định quy trình định lượng furosemid phương pháp quang phổ UV-Vis trình khảo sát thử độ hịa tan Quy trình định lượng furosemid phương pháp UV-Vis tham khảo theo chuyên luận viên nén dung dịch tiêm furosemid dược điển hành 19,20 Tuy nhiên, có khác biệt dạng bào chế thành phần tá dược, phương pháp xử lý mẫu có điều chỉnh cho phù hợp, cho độ hấp thu FUR bước sóng định lượng khơng bị ảnh hưởng, phổ có tính đặc hiệu Quy trình xây dựng thẩm định theo hướng dẫn ICH 45 Chuẩn bị mẫu - Chuẩn gốc: cân xác lượng FUR chuẩn tương đương với 40,0 mg FUR cho vào bình định mức 50 mL, thêm 20 mL NaOH 0,01 N, siêu âm 20 phút, bổ sung nước cất vừa đủ thể tích, lắc Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu - Mẫu chuẩn: Hút xác 1,0 mL dd chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, pha lỗng dd HCl 0,01 N đến vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dd thu có nồng độ đối chiếu 16 μg/mL 25 - Mẫu giả định: cân xác 40,0 mg FUR lượng tá dược tương ứng cho vào bình định mức 50 mL chứa 10 mL nước cất Thêm 20 mL NaOH 0,01 N, lắc đều, siêu âm 30 phút, bổ sung nước cất đến vừa đủ thể tích, lắc Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu Hút xác 1,0 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, pha lỗng dd HCl 0,01 N, đến vừa đủ thể tích, lắc Ly tâm phần dd tốc độ 3000 vịng/phút 10 phút cho phần phía qua lọc 0,45 μm Sử dụng dịch lọc làm mẫu giả định - Mẫu placebo: tiến hành pha mẫu giả định không chứa hoạt chất - Mẫu thử: hút xác lượng mẫu tương ứng với 40 mg FUR cho vào bình định mức 50 mL chứa sẵn 10 mL nước cất Thêm 20 mL NaOH 0,01 N, lắc đều, siêu âm 30 phút, bổ sung nước cất đến vừa đủ thể tích, lắc Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu Hút xác 1,0 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, pha loãng dd HCl 0,01 N đến vừa đủ thể tích, lắc Ly tâm phần dd tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút cho phần phía qua lọc 0,45 μm Sử dụng dịch lọc - Mẫu thử độ hòa tan: lọc 10 mL dịch hòa tan qua màng lọc 0,45 µm Pha lỗng dịch lọc lần mơi trường hịa tan - Mẫu trắng: dd HCl 0,01 N, mơi trường thử độ hịa tan Các mẫu pha điều kiện tránh ánh sáng Hàm lượng FUR mẫu tính theo cơng thức: %𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹 = Trong đó: 𝐴𝐴𝑡𝑡 𝑚𝑚𝑐𝑐 × 𝐶𝐶% 𝑛𝑛 × × × 100% 2500 𝐴𝐴𝐶𝐶 𝑚𝑚𝑡𝑡 At : độ hấp thu FUR mẫu thử Ac : độ hấp thu FUR mẫu chuẩn C% : hàm lượng FUR chuẩn (%) mt : lượng cân FUR thử (mg) mc : lượng cân FUR chuẩn (mg) n : độ pha loãng mẫu thử 26 Độ đặc hiệu Chuẩn bị dd: mẫu chuẩn, giả định placebo mục Chuẩn bị mẫu Tiến hành: - Quét phổ dd chuẩn, placebo, mẫu giả định vùng bước sóng 200 400 nm Ghi nhận phổ đồ, xác định bước sóng định lượng - Định lượng: đo độ hấp thu dd mẫu giả định dd placebo bước sóng định lượng Xác định độ sai lệch kết thu - Thử độ hòa tan: cân lượng tá dược tương ứng công thức (CT), cho vào cốc hịa tan chứa mơi trường, vận hành thiết bị thử độ hòa tan theo điều kiện xây dựng Sau giờ, rút 10 mL dịch Áp dụng quy trình phân tích Xác định độ sai lệch kết so với mẫu giả định Độ sai lệch tính theo CT: 𝐴𝐴𝑜𝑜 𝐴𝐴 × 100%, đó: + A: độ hấp thu mẫu giả định bước sóng định lượng + Ao: độ hấp thu mẫu placebo/dd độ hòa tan mẫu placebo bước sóng định lượng Yêu cầu: - Mẫu giả định mẫu chuẩn với nồng độ tương đương: cho kết phù hợp (cực đại hấp thu dd mẫu tự tạo tương đương với cực đại hấp thu dd chuẩn) - Độ hấp thu dd mẫu placebo (định lượng thử độ hòa tan) so với độ hấp thu dd mẫu giả định: Độ tuyến tính 𝐴𝐴𝑜𝑜 𝐴𝐴 × 100 ≤ 2% Chuẩn bị: - Dd chuẩn gốc: thực phần Chuẩn bị mẫu - Pha giai mẫu có nồng độ khoảng 4-32 μg/ml theo bảng Đo độ hấp thu A dd bước sóng định lượng Bảng 2.3 Giai mẫu khảo sát độ tuyến tính quy trình định lượng Bình Dd chuẩn gốc (mL) V (mL) Clt (µg/mL) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 16 20 24 vđ 100 12 27 Lập phương trình hồi quy 𝑦𝑦� = 𝑎𝑎𝑎𝑎 + 𝑏𝑏, thể mối tương quan nồng độ x độ hấp thu 𝑦𝑦� , biểu thị hệ số tương quan r, với r ≥ 0,998 Dùng trắc nghiệm F kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy dùng trắc nghiệm t kiểm tra ý nghĩa hệ số a b Sử dụng công cụ Data Analysis – Regression tích hợp phần mềm Microsoft Excel 2021 để đánh giá Xây dựng đồ thị khảo sát độ tuyến tính Độ Chuẩn bị - Mẫu placebo chuẩn bị mục a - Mẫu tự tạo: cân xác lượng FUR vào mẫu placebo Mỗi mẫu tự tạo tiến hành lần thử Mẫu tự tạo 1: Mẫu placebo + 25% FUR theo CT bào chế Mẫu tự tạo 2: Mẫu placebo + 100% FUR theo CT bào chế Mẫu tự tạo 3: Mẫu placebo + 150% FUR theo CT bào chế Tiến hành: áp dụng quy trình phân tích, thực ngày điều kiện Xác định độ hay tỷ lệ thu hồi (%) theo CT: 𝑇𝑇ỷ 𝑙𝑙ệ 𝑡𝑡ℎ𝑢𝑢 ℎồ𝑖𝑖 (%) = 𝐿𝐿ượ𝑛𝑛𝑛𝑛 𝑡𝑡ℎ𝑢𝑢 ℎồ𝑖𝑖 × 100% 𝐿𝐿ượ𝑛𝑛𝑛𝑛 𝑡𝑡ℎê𝑚𝑚 𝑣𝑣à𝑜𝑜 Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi (%): 97,0 - 103,0%; RSD ≤ % Khoảng xác định: xác định từ kết độ tuyến tính độ Độ xác Độ lặp lại: Chuẩn bị: mẫu thử mục Chuẩn bị mẫu Tiến hành: Áp dụng quy trình phân tích Các mẫu đo ngày điều kiện Yêu cầu: RSD ≤ 2% Độ xác trung gian Thực định lượng lần lô sản phẩm ngày khác Yêu cầu: Các kết thu phải khác khơng có ý nghĩa (test F) 28 2.3.1.2 Khảo sát tính chất chế phẩm tham khảo đối chiếu Khảo sát đặc tính tính chất cảm quan, thời gian tiềm thời, thời gian nổi, hình thành gel in situ chế phẩm Gaviscon® làm sở nghiên cứu Tiến hành: cho ½ đơn vị chế phẩm (~ mL) vào cốc chứa 50 mL HCl 0,1 N Ghi nhận đặc tính, đó: thời gian tiềm thời (thời gian tính từ cho chế phẩm vào đến gel bề mặt), thời gian (thời gian gel bắt đầu bề mặt đến gel chìm xuống biến mất) 2.3.1.3 Khảo sát phương pháp hòa tan furosemid FUR chất khó tan; khảo sát độ tan FUR số môi trường để xác định phương pháp hòa tan phù hợp Độ tan FUR xác định phương pháp UV-Vis xây dựng mục 2.3.1.1 Mỗi môi trường khảo sát lặp lại lần, giá trị thu giá trị trung bình a Phương pháp tạo muối/ điều chỉnh pH Khảo sát độ tan furosemid môi trường pH Môi trường: nước cất; HCl 0,1 N - pH 1,2; đệm citrat pH 2,0; 3,0; 4,5; dd đệm phosphat pH 6,8; pH 7,4; pH 8,0 pH 8,4 chuẩn bị theo USP 46 Tiến hành: cho lượng thừa FUR vào ống nghiệm chứa mơi trường hịa tan Lắc ngang 24 nhiệt độ phòng, tốc độ 100 nhịp/phút, kiểm tra pH (bổ sung FUR, điều chỉnh pH cần) Để ổn định 24 giờ, kiểm tra lại pH Lọc dịch qua màng lọc 0,45 µm Xác định độ tan FUR Sự ảnh hưởng pH đến tốc độ hòa tan furosemid đổi màu dd furosemid điều kiện nhiệt độ, ánh sáng Tiến hành: hòa tan 200 mg FUR 25 mL dd đệm pH 7,4; 7,8; 8,0 9,0 khuấy từ Quan sát tốc độ hịa tan FUR mơi trường Siêu âm mẫu để FUR tan hoàn tồn Lưu mẫu điều kiện nhiệt độ phịng 40 o C, tránh ánh sáng; tiếp xúc ánh sáng mặt trời Đánh giá cảm quan, pH mẫu thời điểm ban đầu sau tháng Xác định điều kiện pH phù hợp cho chế phẩm Khảo sát ion tạo muối furosemid Sau chọn khoảng pH phù hợp chế phẩm, nghiên cứu tiến hành khảo sát 29 ion tạo muối FUR bao gồm Na, K triethanolamin (TEA), điều kiện pH Dựa tính ổn định dd muối qua tiêu cảm quan, pH, hàm lượng FUR, lựa chọn ion tạo muối FUR Tiến hành: cân xác 200 mg FUR chất bảo quản cho vào bình định mức 25 mL Hịa tan dd kiềm NaOH/ KOH/ TEA 0,1 N, bổ sung nước cất vừa đủ Dd thu có nồng độ FUR 0,8% pH khoảng xác định Các mẫu lưu trữ điều kiện: nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng; 40 oC, tránh ánh sáng; nhiệt độ phòng, ánh sáng mặt trời Đánh giá: cảm quan, pH, hàm lượng FUR thời điểm ban đầu, tháng b Các phương pháp hòa tan khác Các muối FUR tan tốt nước có xu hướng kết tinh lại môi trường acid dày (HCl 0,1 N), tạo thành tiểu phân kích thước lớn, làm giảm khả hấp thu Một số phương pháp hòa tan khác lựa chọn sử dụng phối hợp nghiên cứu tính đơn giản đồng dung mơi, chất diện hoạt Khảo sát độ tan furosemid dung môi Tiến hành: - Cho 80 mg FUR vào ống nghiệm chứa 10 mL dung môi glycerol, ethanol, PEG 400, propylenglycol (PG) Các mẫu vortex 30 phút, siêu âm để ổn định 24 nhiệt độ phòng Đánh giá độ mẫu cảm quan, dung mơi hịa tan tốt FUR chọn - Tiếp tục pha hỗn hợp dung môi chọn nước theo tỉ lệ 1:9 Cho lượng thừa FUR vào ống nghiệm chứa hỗn hợp dung môi Lắc ngang 24 nhiệt độ phòng, tốc độ 100 vòng/phút Để ổn định 24 Lọc dịch qua màng lọc 0,45 µm Xác định độ tan FUR Khảo sát độ tan FUR kết hợp chất diện hoạt môi trường HCl 0,1 N Tween 80 chọn để tiến hành khảo sát khả hịa tan FUR cao so với chất diện hoạt khác Tween 20 Cremophor RH40 47 Nghiên cứu khảo sát độ tan FUR kết hợp với Tween 80 với tỉ lệ FUR : Tween 80 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 môi trường HCl 0,1 N 30 Tiến hành: cân 80 mg FUR lượng Tween 80 tương ứng theo tỉ lệ khảo sát, phân tán Cho hỗn hợp vào ống nghiệm chứa 10 mL dd HCl 0,1 N Lắc ngang 24 nhiệt độ phòng, tốc độ 100 vòng/phút Để ổn định 24 Lọc dịch qua màng lọc 0,45 µm Xác định độ tan FUR Trong trường hợp chế phẩm có dạng bào chế gel in situ, sử dụng lượng lớn dung mơi khác ngồi nước hay chất diện hoạt có khả gây ảnh hưởng cấu trúc gel hình thành Sự kết hợp cho phép sử dụng nồng độ thấp thành phần đơn lẻ Vì vậy, đánh giá độ tan FUR với phối hợp chất trợ tan để xác định tỷ lệ phối hợp tối ưu cho hệ gel in situ cần thiết Nghiên cứu tiến hành đánh giá độ tan FUR kết hợp với hỗn hợp Tween 80 đồng dung môi HCl 0,1 N với tỷ lệ 1:(0,25:0,25) với mong muốn đồng thởi cải thiện độ tan giảm thiểu ảnh hưởng lên hệ gel Quy trình thực tương tự 2.3.1.4 Khảo sát tạo phức calci Calci sử dụng với vai trò tăng cường đặc tính gel alginat Các muối calci hữu hòa tan sử dụng khả phân tán tốt chuỗi polymer so với muối calci không tan Các chất tạo phức Na citrat EDTA dinatri kết hợp để ngăn chặn tương tác calci alginat trình pha chế bảo quản, tránh gel hóa Trong Na citrat ưu tiên sử dụng tính an tồn Các chất khảo sát: - Muối calci: glucoheptonat, glycerophosphat, gluconat, lactat - Chất tạo phức (CTP): Na citrat Tiến hành: - Thêm lượng muối calci khảo sát Na citrat theo tỉ lệ mol 1:0,5, điều chỉnh pH mẫu khoảng 8,0 - 9,0 NaOH 0,1 N, lắc nhẹ, quan sát Các mẫu trong/trong mờ (so sánh với dd Na alginat 2%), khơng có kết tủa chọn để đánh giá khả tạo phức - Thêm dd Na alginat vào mẫu khảo sát, quan sát gel hóa qua tượng Tyndall 31 Trong trường hợp tạo phức với Na citrat chưa tối ưu, khảo sát tăng tỉ lệ Na alginat sử dụng kết hợp Na citrat với lượng nhỏ EDTA dinatri nằm giới hạn cho phép Tiến hành đánh trên, chọn lựa tỷ lệ tối ưu 2.3.1.5 Khảo sát số đặc tính gel Na alginat số polymer thứ cấp Các CT khảo sát xấy dựng theo bảng 2.5 nhằm khảo sát số đặc tính gel thời gian nổi, thời gian tiềm thời mức độ phân tán gel Trong đó, - Alginat polymer đóng vai trị tạo gel in situ - Các polymer thứ cấp dùng khảo sát gồm: PVP K30, HPMC K15, carbomer 974P, Na CMC sử dụng để tăng cường đặc tính gel hỗ trợ kiểm sốt phóng thích hoạt chất (được khảo sát phần sau) - Loại calci CTP với tỷ lệ khảo sát mục 2.3.1.4 - NaHCO3 chọn làm tác nhân tạo khí khả hịa tan phân tán gel dễ dàng so với thành phần không hòa tan CaCO3 Tuy nhiên, NaHCO3 ổn định mơi trường nhiệt độ cao mơi trường có xáo động lớn nên kiểm soát nhiệt độ tốc độ khuấy trình pha chế cần lưu ý Bảng 2.4 Một số công thức khảo sát đặc tính gel Thành phần Na alginat Polymer thứ cấp Calci Chất tạo phức NaHCO3 NaOH 0,1 N Nước cất Hàm lượng (% kl/ tt) 1; 2; 0; 0,5 0; 0,1; 0,2 vđ 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 vđ vđ 100 Chuẩn bị - Dd Na alginat: cân lượng Na alginat cần khảo sát, cho từ từ vào lọ chứa phần nước làm nóng đến 60 oC, khuấy với tốc độ 1000 vòng/phút, khuấy đến tan hoàn toàn, để nguội từ từ dd đến khoảng 40 oC - Polymer thứ cấp: cân lượng polymer theo bảng khảo sát, phân tán lượng polymer vừa cân lượng nước vừa đủ, khuấy từ 30-60 phút để đạt dd suốt, điều chỉnh pH khoảng > 4,0 (nếu cần) 32 - Dd Ca-CTP: hòa tan lượng muối calci CTP khảo sát nước cất - Cho dd polymer thứ cấp vào dd alginat, khuấy 800 vòng/phút 30 phút Thêm từ từ dd Ca-CTP Giảm tốc độ khuấy 500 vòng/phút, thêm NaHCO3, bổ sung nước vừa đủ, tiếp tục khuấy 15 phút Dịch thu để qua đêm nhiệt độ phòng, tủ lạnh đánh giá mặt cảm quan Tiến hành: hút mL mẫu thử cho vào lọ chứa khoảng 10 mL HCl 0,1 N, để yên vài phút, đảm bảo mẫu gel hóa hồn tồn, ghi nhận thời gian tiềm thời Khuấy từ với tốc độ 100 vòng/phút, ghi nhận thời gian nổi, mức độ phân tán gel Tiêu chuẩn: - Dịch đồng nhất, khơng có tiểu phân gel lợn cợn, không tách lớp - Gel hình thành có liên kết tạo mảng, bền, khơng phân tán thành mảnh nhỏ vòng - Thời gian tiềm thời (tính từ cho mẫu khảo sát vào môi trường thử nghiệm đến gel bắt đầu lên bề mặt): < phút - Thời gian tổng cộng (tính từ gel bắt đầu bề mặt môi trường thử nghiệm đến gel biến chìm hồn tồn): > 2.3.1.6 Xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid Xây dựng CT khảo sát phóng thích hoạt chất số đặc tính gel với hoạt chất tỉ lệ tá dược đánh giá phần trước với quy mô 50 mL Các công thức khảo sát thể bảng 2.6 Phương pháp chuẩn bị mẫu - Chuẩn bị dd polymer: + Chuẩn bị dd Na alginat: cân lượng Na alginat cần khảo sát, cho từ từ vào lọ chứa phần nước làm nóng đến 60 oC với tốc độ khuấy 1000 vịng/phút, tiếp tục khuấy đến tan hồn tồn, điều chỉnh tốc độ chậm dần để nguội từ từ dd đến khoảng 40 - 50 oC + Chuẩn bị polymer thứ cấp (Na CMC/ carbomer 974P): cân lượng polymer theo bảng khảo sát, phân tán lượng polymer vừa cân lượng nước vừa đủ, khuấy từ 10-15 phút đến thu dd suốt, điều chỉnh pH cần 33 + Dd Ca-CTP: cân lượng calci lượng CTP khảo sát, hòa tan nước cất Kiểm tra, điều chỉnh pH ≥ + Cho dd polymer thứ cấp vào dd alginat để nguội, tiếp tục khuấy 1000 vòng/phút để thu hỗn hợp polymer đồng Thêm dd Ca-CTP, khuấy + Điều chỉnh pH ≥ 8,0 Dịch thu để qua đêm - Chuẩn bị dd FUR: cân FUR, PG, Tween 80 theo bảng khảo sát, phân tán đều, cho vào dd nước hòa tan sẵn NaOH, khuấy Thêm hỗn hợp paraben (PARs), khuấy cho tan hoàn toàn, thu dd suốt - Cho dd FUR vào dd polymer chuẩn bị, khuấy 20 phút cho dd FUR phân tán với tốc độ 400 vòng/phút - Cho lượng NaHCO3 hòa tan với lượng nước vừa đủ vào dd Khuấy với tốc độ 400 vòng/phút, vòng 30 phút - Điều chỉnh thể tích Kiểm tra pH, điều chỉnh cần - Để yên mẫu ổn định qua đêm Đảo nhẹ trước tiến hành phân tích Bảng 2.5 Công thức khảo sát xây dựng công thức gel in situ Thành phần (% kl/tt) Furosemid Tween 80 PG NaOH Na alginat Na CMC Carbomer 974P Calci (glucoheptonat) Na citrat EDTA dinatri NaHCO3 Methylparaben Propyparaben NaOH N Nước cất F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 2 2 4 2 2 0,5 0,5 0,25 0,15 0,1 025 0,5 0,75 0,50 0,5 0,5 0,25 0,35 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,25 0,25 0,25 0,25 0,2 0,25 0,25 0,2 0,2 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,92 0,52 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,92 0,52 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,74 0,42 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,92 0,52 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,92 0,52 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,92 0,52 0,18 0,02 vđ vđ 100 0,92 0,52 0,18 0,02 vđ vđ 100 34 Các công thức đánh giá dựa tiêu chuẩn: - Cảm quan: dịch thu đồng nhất, khơng có tủa lắng, khơng có tách lớp - Khả rót/chảy: mẫu đổ, rót dễ dàng - Đánh giá khả (xác định thời gian tiềm thời thời gian nổi, đánh mục 2.3.1.5): cho mẫu vào cốc hòa tan chứa mơi trường hịa tan 37 ± 0,5 oC Ghi nhận thời gian - Đo pH: pH cho CT đo máy đo pH Các kết đọc ghi lại ba lần cho CT giá trị trung bình số đọc xem xét - Đánh giá in vitro trình GPHC theo thời gian: Các chế phẩm cho vào cốc hịa tan chứa mơi trường hịa tan (pH 1,2, nhiệt độ 37 ± 0,5 °C), tránh xáo trộn nhiều, với tốc độ quay 50 vòng/phút Phần dịch (5 mL) rút khoảng thời gian xác định (1, 2, 3, 4, giờ) thay thể tích tương đương mơi trường hịa tan Các mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm, thu dịch lọc Hàm lượng FUR dịch lọc xác định cách đo quang phổ UV-Vis Các thí nghiệm thực ba lần % FUR giải phóng mơi trường cho CT tính toán lập biểu đồ dựa thời gian để xác lập mơ hình động học phóng thích Dựa kết khảo sát, chọn lựa CT tiềm 2.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu 2.3.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng furosemid paraben chế phẩm Hiện chưa có chuyên luận định lượng FUR hệ gel in situ dược điển Việt Nam V, USP 44, BP 2020 Do đó, dựa vào chuyên luận dạng bào chế khác FUR 19,20,22 , xây dựng quy trình định lượng FUR phương pháp UV-Vis phương pháp HPLC theo yêu cầu qui trình phân tích Qui trình định lượng thẩm định tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác, khoảng xác định, khoảng tuyến tính… theo hướng dẫn ICH 35 a Phương pháp quang phố UV-Vis Chuẩn bị mẫu - Chuẩn gốc FUR: cân xác 40 mg FUR cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL NaOH 0,1 N, siêu âm 30 phút, bổ sung nước cất đến vạch, lắc kỹ Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu - Mẫu chuẩn FUR: hút xác 2,0 mL dịch lọc dd chuẩn gốc FUR cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng đến vạch dd HCl 0,01 N, lắc đều, lọc Dd thu có nồng độ đối chiếu μg/ml - Chuẩn gốc PARs: cân xác 10 mg PARs (MP : PP tỉ lệ 9:1) cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL NaOH 0,1 N, siêu âm 30 phút, bổ sung nước cất đến vạch, lắc kỹ Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu - Mẫu chuẩn PARs: hhút xác 2,0 mL dd chuẩn gốc PARs cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng dd HCl 0,01 N, lắc đều, lọc Dd thu có nồng độ đối chiếu μg/mL - Mẫu giả định: cân xác 40 mg FUR lượng tá dược tương ứng tỷ lệ CT cho vào bình định mức 100 mL chứa sẵn 10 mL nước cất, thêm 10 mL NaOH 0,1 N, siêu âm 30 phút, bổ sung nước cất đến vạch, lắc kỹ Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu Hút xác 2,0 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, pha lỗng đến vạch dd HCl 0,01 N, lắc Ly tâm phần dd tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút cho phần phía qua màng lọc 0,45 μm Sử dụng dd lọc làm mẫu đo - Mẫu placebo: pha mẫu giá định không chứa FUR PARs - Mẫu thử: hút xác 5,0 mL chế phẩm cho vào bình định mức 100 mL, thêm 20 mL NaOH 0,01 N, siêu âm 30 phút, thêm nước cất vừa đủ thể tích, lắc kỹ Lọc bỏ 10 mL dịch lọc đầu Hút xác 2,0 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, pha loãng dd HCl 0,01 N, lắc Ly tâm phần dd tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút cho phần phía qua màng lọc 0,45 μm Sử dụng dịch lọc làm mẫu đo - Mẫu trắng: dd HCl 0,01 N 36 Độ đặc hiệu Chuẩn bị mẫu: dd chuẩn FUR, dd chuẩn PARs, dd hỗn hợp, mẫu placebo, mẫu thử mục Chuẩn bị mẫu Tiến hành: quét phổ mẫu vùng bước sóng 200 - 400 nm Yêu cầu: - Xác định bước sóng cần cho định lượng: λmax FUR, λmax PARs, λ điểm đẳng quang - Mẫu placebo khơng có đỉnh hấp thu bước sóng định lượng Xác định độ sai lệch kết thu theo CT: 𝐴𝐴𝑜𝑜 𝐴𝐴 × 100 ≤ 2% Trong đó: A: độ hấp thu mẫu giả định bước sóng xác định Ao: độ hấp thu mẫu placebo bước sóng xác định Độ tuyến tính Chuẩn bị: Các dd chuẩn gốc: thực phần Chuẩn bị mẫu - Pha giai mẫu có nồng độ theo bảng 2.6 Độ hấp thu A dd đo bước sóng xác định Bảng 2.6 Giai mẫu khảo sát độ tuyến tính quy trình định lượng Q-value V dd chuẩn gốc (ml) FUR C (µg/mL) PARS C (µg/mL) V 1,0 4,0 1,0 1,5 6,0 1,5 2,0 8,0 2,0 2,5 3,0 10,0 12,0 2,5 3,0 vđ 100 mL 3,5 14,0 3,5 4,0 16,0 4,0 Lập phương trình hồi quy 𝑦𝑦� = 𝑎𝑎𝑎𝑎 + 𝑏𝑏, thể mối tương quan nồng độ x độ hấp thu 𝑦𝑦� , biểu thị hệ số tương quan r, với r ≥ 0,998 Dùng trắc nghiệm F kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy dùng trắc nghiệm t kiểm tra ý nghĩa hệ số a b Sử dụng công cụ Data Analysis – Regression tích hợp phần mềm Microsoft Excel 2021 để đánh giá Xây dựng đồ thị khảo sát độ tuyến tính Độ Chuẩn bị: - Mẫu placebo chuẩn bị mục Chuẩn bị mẫu - Mẫu tự tạo: cân xác lượng FUR + PARs vào mẫu placebo 37 Mẫu tự tạo 1: Mẫu placebo + 80% (FUR + PARs) theo CT bào chế Mẫu tự tạo 2: Mẫu placebo + 100% (FUR + PARs) theo CT bào chế Mẫu tự tạo 3: Mẫu placebo + 120% (FUR + PARs) theo CT bào chế Tiến hành: áp dụng quy trình phân tích, thực ngày điều kiện Mỗi mẫu tiến hành lần thử Xác định độ (tỷ lệ tìm lại) (%) theo CT: 𝑇𝑇ỷ 𝑙𝑙ệ 𝑡𝑡ℎ𝑢𝑢 ℎồ𝑖𝑖 (%) = 𝐿𝐿ượ𝑛𝑛𝑛𝑛 𝑡𝑡ℎ𝑢𝑢 ℎồ𝑖𝑖 × 100% 𝐿𝐿ượ𝑛𝑛𝑛𝑛 𝑡𝑡ℎê𝑚𝑚 𝑣𝑣à𝑜𝑜 Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi (%): 97,0 - 103,0%; RSD ≤ % Khoảng xác định: xác định từ kết độ tuyến tính độ Phương pháp tỷ lệ hấp thu-Q (Q-Absorption Ratio) Phương pháp tỷ lệ độ hấp thụ phương pháp định lượng đồng thời thành phần xậy dựng dựa Định luật Lambert-Beer Trong phép thử định lượng hai thành phần phương pháp tỷ lệ độ hấp thu, độ hấp thu đo hai bước sóng: λmax thành phần (λ2) bước sóng có tổng độ hấp thu hai thành phần khơng đổi có thay đổi hóa học hay vật lý mẫu (λ1) - điểm đẳng quang (isosbestic point) Đối với chất tuân theo định luật Lambert-Beer bước sóng, tỷ số độ hấp thu hai bước sóng số không phụ thuộc vào nồng độ độ dài đường truyền Tỷ số Q-value với Q = A1/A2 Hàm lượng FUR PARs mẫu tính theo CT lần lượt: Trong đó, 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 𝑄𝑄𝑚𝑚 − 𝑄𝑄𝑝𝑝 𝐴𝐴1 × ; 𝑄𝑄𝑓𝑓 − 𝑄𝑄𝑝𝑝 𝜀𝜀𝑓𝑓1 𝐶𝐶𝑝𝑝 = 𝑄𝑄𝑚𝑚 − 𝑄𝑄𝑓𝑓 𝐴𝐴1 × 𝑄𝑄𝑝𝑝 − 𝑄𝑄𝑓𝑓 𝜀𝜀𝑝𝑝1 Qm = A2/A1; Qf = 𝜀𝜀𝑓𝑓2 /𝜀𝜀𝑓𝑓1 ; Qp = 𝜀𝜀𝑝𝑝2 /𝜀𝜀𝑝𝑝1 Cf Cp nồng độ FUR PARs A2 A1 độ hấp thụ mẫu λ2 nm λ1 nm (điểm isosbestic) 𝜀𝜀𝑓𝑓2 𝜀𝜀𝑓𝑓1 hệ số tắt mol FUR λ2 nm λ1 nm (l.mol-1.cm-1) 𝜀𝜀𝑝𝑝2 𝜀𝜀𝑝𝑝1 hệ số tắt mol PARs e λ2 nm λ1 nm (l.mol-1.cm-1) Qf Qp giá trị Q FUR PARs tương ứng (Qn) 38 Độ xác Độ lặp lại Chuẩn bị: dd thử mục Chuẩn bị mẫu Tiến hành: Áp dụng quy trình phân tích Các mẫu đo ngày điều kiện Yêu cầu: RSD ≤ 2% Độ xác trung gian Thực định lượng lô sản phẩm ngày khác Yêu cầu: Các kết thu phải khác khơng có ý nghĩa (test F) Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Được xác định dựa CT LOD=3,3×σ/S LOQ=10×σ/S Trong σ độ lệch chuẩn hệ số tự (b) S, giá trị hệ số góc (a) đồ thị b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Độ đặc hiệu Chuẩn bị mẫu thường - Dung môi pha mẫu: acetonitril 40% bổ sung 2% acid acetic băng - Mẫu trắng: dung môi pha mẫu - Mẫu placebo: Hút xác 5,0 ml Mẫu placebo cho vào bình định mức 100 ml Thêm 35 ml dung môi pha mẫu, lắc đều, siêu âm 30 phút Thêm dung môi pha mẫu tới vạch, lắc - Mẫu thử: Hút xác ml mẫu thử cho vào bình định mức 100 ml Thêm 35 ml dung môi pha mẫu, lắc đều, siêu âm 30 phút Thêm dung môi pha mẫu tới vạch, lắc - Mẫu chuẩn: Dd FUR 0,40 mg/ml dung môi pha mẫu Dd MP 0,09 mg/ml dung môi pha mẫu Dd PP 0,01 mg/ml dung môi pha mẫu Hỗn hợp chuẩn FUR 0,40 mg/ml; MP 0,09 mg/ml; PP 0,01 mg/ml dung môi pha mẫu 39 Chuẩn bị mẫu phân hủy điều kiện khắc nghiệt - Mẫu phân hủy mơi trường acid: Hút xác mL mẫu thử cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml dd HCl 0,5 M Lắc để nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, thêm 10 ml dd NaOH 0,5 M trung hòa thêm dung môi pha mẫu tới vạch Lắc - Mẫu phân hủy mơi trường kiềm: Hút xác 5,0 mL Mẫu thử cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml dd NaOH 0,5 M Lắc để nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, thêm 10 ml dd HCl 0,5 M trung hòa thêm dung môi pha mẫu tới vạch Lắc Các mẫu thường mẫu phân hủy lọc qua màng lọc 0,45 μm trước tiêm vào hệ thống sắc ký Điều kiện sắc ký Dd acid acaetic 1,5%: 15 mL acid acetic băng vào 1000 mL nước cất Trộn - Pha động: dd acid acetic 1,5% - acetonitril theo tỉ lệ 65:35 - Cột phân tích: Xterra 4,6 × 250 mm, nhồi pha tĩnh C18 kích thước hạt μm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 ⁰C - Bước sóng phát hiện: FUR: 273 nm; PARs: 255 nm Tiến hành: Tiêm mẫu: trắng, chuẩn, thử, mẫu phân hủy điều kiện khắc nghiệt với điều kiện phân tích Ghi nhận sắc ký đồ từ mẫu Xác định thời gian lưu FUR, MP, PP cần phân tích; độ tinh khiết pic chất cần phân tích sắc ký đồ mẫu thử; phổ UV pic chất cần phân tích sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn Yêu cầu: - Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic chất chuẩn sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất thêm pic khác (pic tạp) pic hoạt chất cần phân tích, pic hoạt 40 chất cần phân tích phải tách hịan tồn khỏi pic tạp đáp ứng yêu cầu chung phương pháp sắc ký lỏng quy định dược điển - Pic chất cần phân tích sắc ký đồ mẫu thử phải tinh khiết (xấp xỉ 100%) Hệ số chồng phổ UV pic hoạt chất cần phân tích thu sắc ký đồ phổ UV pic tương ứng sắc ký đồ mẫu chuẩn xấp xỉ 1,0 Tính tương thích hệ thống Tiêm vào hệ thống lần mẫu hỗn hợp chuẩn (FUR 0,40 mg/mL; MP 0,09 mg/mL; PP 0,01 mg/mL) Ghi nhận thông số sắc ký pic hoạt chất (thời gian lưu, diện tích pic, hệ số kéo đi, số đĩa lý thuyết) Độ tuyến tính Chuẩn bị: Các dd chuẩn gốc: thực phần Chuẩn bị mẫu mục a - Pha giai mẫu có nồng độ theo bảng Đo độ hấp thu A dd bước sóng định lượng xác định Bảng 2.7 Giai mẫu khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng HPLC Dd chuẩn 60% 80% 100% 120% 140% Thể tích chuẩn gốc (mL) FUR MP PP 3 2 5 3 4 V* (mL) 50 25 50 25 25 Nồng độ chuẩn (mg/mL) FUR MP PP 0,24 0,054 0,006 0,32 0,072 0,008 0,40 0,090 0,010 0,48 0,108 0,012 0,56 0,126 0,014 (*) Pha dung môi pha mẫu (dd acetonitril bổ sung 2% acid acetic băng) Tiến hành: ghi nhận sắc ký đồ xác định đáp ứng pic mẫu Xác định phương trình hồi quy tuyến tính 𝑦𝑦� = 𝑎𝑎𝑎𝑎 + 𝑏𝑏, thể mối tương quan diện tích đỉnh x độ hấp thu 𝑦𝑦� , biểu thị hệ số tương quan r với r ≥ 0,999 Dùng trắc nghiệm F kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy dùng trắc nghiệm t kiểm tra ý nghĩa hệ số a b Sử dụng cơng cụ Data Analysis – Regression tích hợp phần mềm Microsoft Excel 2021 để đánh giá Xây dựng đồ thị khảo sát độ tuyến tính 41 Độ xác Độ lặp lại Chuẩn bị mẫu thử: Hút xác 5,0 mL mẫu thử cho vào bình định mức 100 ml Thêm 35 ml dung môi pha mẫu, lắc đều, siêu âm 30 phút Thêm dung môi pha mẫu tới vạch, lắc Xác định hàm lượng FUR, MP, PP mẫu RSD hàm lượng FUR, MP, PP mẫu không lớn 2,0% Độ xác trung gian Thực giống “Độ lặp lại” ngày khác Sử dụng phần mềm Excel so sánh phương sai kết hai ngày phép kiểm F so sánh hai kết trung bình hai ngày phép kiểm t Phương sai giá trị trung bình hai ngày phải khác khơng có ý nghĩa Độ Thêm chuẩn FUR, MP, PP vào mẫu placebo mức nồng độ tương ứng với 80%, 100% 120% lượng FUR, MP, PP mẫu thử Thực lặp lại lần - Chuẩn gốc FUR: cân xác 200 mg chuẩn FUR cho vào bình định mức 50 mL Thêm 35 mL dung môi pha mẫu, siêu âm 15 phút để hịa tan hồn tồn Thêm dung mơi tới vạch, lắc Dd chuẩn gốc FUR có nồng độ 4,0 mg/mL - Chuẩn gốc MP: cân xác 45 mg chuẩn MP cho vào bình định mức 50 mL Thêm 35 mL dung môi pha mẫu, lắc cho tan hồn tồn Thêm dung mơi pha mẫu tới vạch, lắc Dd chuẩn gốc MP có nồng độ 0,9 mg/mL - Chuẩn gốc PP: cân xác mg chuẩn PP cho vào bình định mức 50 mL Thêm 35 ml dung môi pha mẫu, lắc cho tan hồn tồn Thêm dung mơi pha mẫu tới vạch, lắc Dd chuẩn gốc PP có nồng độ 0,1 mg/mL Bảng 2.8 Thành phần mẫu khảo sát độ phương pháp định lượng HPLC V chuẩn gốc (mL) Nồng độ chuẩn (mg/mL) V placebo V* (mL) FUR MP PP FUR MP PP (mL) 80% 4 2,5 50 0,32 0,072 0,008 100% 5 2,5 50 0,40 0,090 0,010 120% 6 2,5 50 0,48 0,108 0,012 (*) Pha dung môi pha mẫu (dd acetonitril bổ sung 2% acid acetic băng) Dd chuẩn 42 Tiêm dd chuẩn vào hệ thống Độ mức nồng độ thể qua tỷ lệ thu hồi Yêu cầu: độ thu hồi 98 – 102% Khoảng xác định Phương pháp định lượng có khoảng xác định nồng độ FUR, MP, PP tương ứng với đường tuyến tính lập phần “Độ tuyến tính” 2.3.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình thử độ hòa tan hệ gel in situ Mục tiêu nghiên cứu tiến hành xây dựng dạng bào chế phóng thích hoạt chất mơi trường dày Vì vậy, đề tài tiến hành thử độ hịa tan môi trường pH 1,2 Xác định điều kiện sink theo CT Trong Sink = 𝑉𝑉 × 𝐶𝐶𝑠𝑠 𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀𝑀 Sink : hệ số điều kiện sink MDD : liều tối đa hịa tan V : thể tích mơi trường hịa tan Cs : nồng độ bão hịa hoạt chất mơi trường Xác định điều kiện thử nghiệm - Thiết bị: Máy thử độ hịa tan cánh khuấy PTWS D620 - Mơi trường: pH 1,2; 900 mL ± 1% (nếu cần bổ sung chất diện hoạt, khảo sát nồng độ để đạt điều kiện sink) - Số lượng mẫu thử: - Nhiệt độ: 37 ± 0,5 oC - Tốc độ quay: 50 vịng/phút - Thể tích lấy mẫu: mL; thay mơi trường thử trì 37 oC - Thời gian: giờ, giờ, giờ, - Số lượng mẫu: đơn vị - Dd thử: lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha lỗng cần - Phương pháp phân tích: quang phổ UV-Vis 43 Yêu cầu (dự kiến): Thời điểm Thời gian (giờ) Hàm lượng giải phóng (%) 35 - 55 55 - 75 > 75 Tiến hành: Cho đơn vị thành phẩm trực tiếp vào cốc hịa tan chứa mơi trường trì điều kiện khảo sát vận hành thiết bị với tốc độ 50 vòng/phút Tiến hành rút mL mẫu theo thời gian quy định, bổ sung đồng thể tích mơi trường thử Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm Xác định lượng FUR phóng thích từ hệ gel phương pháp đo quang phổ UV-Vis theo quy trình thẩm định Quá trình thực điều kiện tránh sáng để ngăn chặn phân hủy quang học FUR Phần trăm hoạt chất giải phóng đầu tính theo CT: %𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹 = 𝐴𝐴𝑡𝑡 𝑚𝑚𝑐𝑐 × 𝐶𝐶% 𝑉𝑉 × × × × 100% 2500 𝐴𝐴𝐶𝐶 𝑚𝑚𝑡𝑡 Phần trăm hoạt chất giải phóng thời điểm cịn lại tính theo CT: %𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹 = Trong đó: (𝐴𝐴𝑡𝑡 + +𝐴𝐴𝑛𝑛−1 ) × 𝑉𝑉𝑡𝑡 + 𝐴𝐴𝑡𝑡 × [𝑉𝑉 − (𝑛𝑛 − 1) × 𝑉𝑉𝑡𝑡 ] × × 𝐶𝐶𝑐𝑐 × 𝐶𝐶% × 100 𝐴𝐴𝐶𝐶 m𝑡𝑡 At/Ac : độ hấp thu FUR mẫu thử/ mẫu chuẩn C% : hàm lượng FUR chuẩn (%) mt/ mc : lượng FUR thử/ chuẩn (mg) Cc : nồng độ FUR mẫu chuẩn V : thể tích mơi trường thử Vt : thể tích lấy mẫu t : thời điểm lấy mẫu n : số thời điểm lấy mẫu Độ ổn định furosemid mơi trường hịa tan Độ ổn định FUR 10 µg/ml tiến hành khảo sát mơi trường hịa tan nhiệt độ phòng 12 giờ, tránh ánh sáng 44 Yêu cầu: nồng độ dd FUR sau không thay đổi 2% so với ban đầu Phần trăm tích lũy lượng FUR, giải phóng thời điểm định, tuân theo Acceptance Table Extended-Release Dosage Forms USP 44 2.3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở dự kiến cho sản phẩm nghiên cứu Tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu gồm tiêu: cảm quan, pH, thời gian tiềm thời nổi, thời gian nổi, định tính, định lượng, độ hịa tan 2.3.3 Xây dựng qui trình bào chế chế phẩm qui mô 500 mL - 2500 mL Đánh giá độ lặp lại CT quy trình với cỡ mẫu 500 mL 2500 mL Đánh giá tiêu chuẩn: cảm quan, pH, thời gian tiềm thời, thời gian nổi, độ hòa tan, hàm lượng 2.3.4 Đánh giá sơ độ ổn định Sản phẩm đóng bao bì: Chai thủy tinh hổ phách (loại III) 100 mL, nắp HDPE; cốc phân liều Khảo sát sơ độ ổn định sản phẩm điều kiện lão hóa cấp tốc (40 0C ± 75% RH ± 5%) dài hạn (30 0C ± 75% RH ± 5%) tháng Định kỳ lấy mẫu, đánh giá theo tiêu cảm quan, pH, thời gian tiềm thời, thời gian nổi, độ hòa tan, hàm lượng 45 Chương 3: KẾT QUẢ 3.1 Xây dựng cơng thức quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid 3.1.1 Thẩm định quy trình định lượng FUR phương pháp quang phổ UV-Vis q trình khảo sát thử độ hịa tan Độ đặc hiệu Kết quét phổ UV-Vis mẫu chuẩn, mẫu placebo-ĐL, mẫu giả định, mẫu placebo-ĐHT khoảng bước sóng 200-400 nm trình bày hình 3.1 Hình 3.1 Phổ UV (A) mẫu chuẩn, (B) mẫu placebo-ĐL, (C) mẫu giả định, (D) mẫu placebo-ĐHT Bước sóng định lượng xác định đỉnh hấp thu 343,0 ± nm với độ hấp thu mẫu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết thẩm định độ đặc hiệu phương pháp UV-Vis 343 nm Mẫu Mẫu giả định Placebo-ĐL Placebo-ĐHT Atb ± SD 0,1548 ± 0,0008 0,0026 ± 0,0001 0,0032 ± 0,0001 RSD (%) 0,5 1,9 1,8 Độ pha loãng 2500 2500 1800 Nhận xét: Quy trình định lượng FUR λ = 343 nm có tính đặc hiệu Độ tuyến tính Kết kháo sát độ tuyến tính quy trình trình bày bảng 3.2 Ao/A 1,7% 1,4% 46 Bảng 3.2 Kết độ tuyến tính quy trình định lượng (λmax = 343 nm) STT C (µg/mL) 4,01 8,02 12,03 16,04 20,05 24,06 28,07 ATB 0,0715 0,1436 0,2154 0,2843 0,3560 0,4271 0,4986 SD 0,0004 0,0005 0,0002 0,0004 0,0005 0,0006 0,0008 RSD% 0,53 0,32 0,10 0,12 0,13 0,14 0,16 Dữ liệu phân tích thống kê R2 Hệ số tự 0,0009 Giá trị t hệ số tự 1,55 Hệ số góc 0,0177 Giá trị t hệ số góc 621,11 F 385776 F0,05 6,61 t0,05 2,45 Phương trình hồi quy 𝑦𝑦� = 0,0181x Khoảng nồng độ khảo sát 4-28 µg/mL LOD 0,11 LOQ 0,32 Nhận xét: dựa vào số liệu thống kê phân tích, cho thấy quy trình đạt độ tuyến tính với phương trình tuyến tính là, R2 ≥ 0,995 Độ Kết độ phương pháp trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết độ quy trình định lượng (λmax = 343 nm) FUR Lượng thêm vào (mg) Lượng thu hồi (mg) Tỷ lệ phục hồi % TB 10 10,1 100,6 25% SD 0,1 0,2 0,8 RSD% 1,0 1,7 0,8 TB 40,0 40,4 101,0 100% SD 0,1 0,3 0,6 RSD% 0,3 0,9 0,6 TB 60,0 60,5 100,9 150% SD 0,1 0,4 0,5 RSD% 0,2 0,7 0,5 n=3 Nhận xét: tỉ lệ phục hồi thực nghiệm FUR ba mức nồng độ nằm khoảng 97-103% với RSD ≤ 2% Vậy quy trình đạt độ dúng Khoảng xác định Từ kết khảo sát độ tuyến tính độ đúng, xác định khoảng xác định quy trình định lượng FUR: 4-24 µg/mL 47 Độ xác Độ lặp lại Kết độ lặp lại quy trình trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết độ lặp lại quy trình định lượng (λmax = 343 nm) STT V mẫu (mL) Độ pha loãng 5,0 2500 5,0 2500 5,0 2500 5,0 2500 5,0 2500 5,0 2500 TB RSD (%) Atb Hàm lượng (%) 0,2909 101,5 0,2878 102,5 0,2903 101,9 0,2892 100,9 0,2897 101,7 0,2915 102,4 101,8 ± 0,6 0,6 Nhận xét: Kết cho thấy % hàm lượng trung bình độ lệch chuẩn tương đối mẫu 101,8 ± 0,6 với RSD ≤ 2% Quy trình đạt độ xác Độ xác trung gian Kết độ xác trung gian quy trình trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết độ xác trung gian quy trình định lượng (λmax = 343 nm) 5,0 Ngày Ngày A % Hàm lượng A % Hàm lượng 0,2844 99,9 0,2850 100,1 5,0 0,2868 5,0 5,0 5,0 5,0 0,2859 0,2842 0,2861 0,2837 STT V mẫu (mL) 100,7 0,2881 101,2 100,4 0,2863 100,5 99,8 0,2892 101,6 100,5 0,2857 100,3 99,6 0,2865 100,6 TB 100,1 ± 0,4 100,7 ± 0,5 %RSD 0,4 0,5 F = 3,92; Fcrit = 4,96 p > 0,05 => Quy trình đạt độ xác trung gian 3.1.2 Khảo sát tính chất chế phẩm tham khảo đối chiếu Chế phẩm gel in situ chứa FUR chưa có thị trường, nghiên cứu tiến hành đánh giá đặc tính chế phẩm Gaviscon làm sở tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cho chế phẩm nghiên cứu Kết khảo sát trình bày bảng 3.6 48 Bảng 3.6 Một số tính chất khảo sát chế phẩm tham khảo đối chiếu STT Tính chất Cảm quan Chất lỏng sánh, màu trắng đục Thời gian tiềm thời 120 ± 20 s Tổng thời gian > 12 Thời gian hình thành gel 1-2 s 3.1.3 Khảo sát phương pháp hòa tan furosemid Kết khảo sát độ tan FUR mơi trường trình bày bảng 3.7-3.8 hình 3.2 Hình 3.2 Khả hịa tan FUR (0,8%) mơi trường (A)-Từ trái qua, dung môi lần lượt: nước, glycerol, PEG 400, PG ethanol 96% (B)- Từ trái qua, dd đệm pH 7,0; pH 7,4; pH 8,0 pH 9,0 sau 30 phút Bảng 3.7 Độ tan furosemid môi trường đệm pH dung môi Môi trường HCl 0,1 N pH 2,0 pH 4,5 pH 5,4 pH 6,8 pH 7,0 pH 7,4 Độ tan (µg/mL) 27,5 42,4 583 880 5706 9207 13621 Môi trường pH 8,0 pH 8,4 H2O PEG : H2O (1:9) PG : H2O (1:9) Độ tan (µg/mL) 16814 17694 22,9 38,0 64,5 Ethanol 96% : H2O (1:9) 34,8 Bảng 3.8 Độ tan furosemid kết hợp số chất trợ tan môi trường HCl 0,1N Tỉ lệ FUR : chất khảo sát Độ tan (µg/mL) 1:1 37,6 Tween 80 1:2 1:3 60,1 95,8 1:4 127,7 PG : Tween 80 (1:1) : 0,5 56,9 ± 0,7 Nhận xét: Theo liệu hồ sơ độ tan FUR khảo sát thực nghiệm bảng 3.7, độ tan FUR tăng rõ rệt môi trường pH 6,8 trở lên Đồng thời khảo sát 49 q trình hịa tan 40 mg FUR cách khuấy từ 30 phút môi trường pH 7,0-7,4-8,0-9,0, cho kết hình 3.1-(B), Tốc độ hòa tan FUR tăng tăng pH mơi trường: pH ≥ 8,0, có hịa tan hồn tồn FUR diễn 30 phút Thêm vào đó, liệu ổn định từ tài liệu đề cập tổng quan cho thấy, ổn định chế phẩm dd FUR đạt điều kiện pH ≥ 8,0, Vì vậy, nghiên cứu tiến hành khảo sát xây dựng CT bào chế có pH 8,0-9,0, FUR (0,8%) hịa tan hồn tồn dung mơi PEG 400, PG, ethanol 96% (hình 3,1-A) Với tỉ lệ dung mơi đươc pha lỗng DM : H2O (1:9), độ tan cao với hỗn hợp dung môi PG nước (bảng 3.7) Sử dụng phối hợp PG : Tween (1:1) với FUR theo tỉ lệ 0,5:1 cải thiện độ tan FUR môi trường HCl 0,1 N với độ tan 56,9 µg/mL so với độ tan mơi trường HCl 0,1 N 27,5 µg/mL Bảng 3.9 Ảnh hưởng ion tạo muối đến biến đổi đặc tính dd furosemid điệu kiện nhiệt độ ánh sáng khác Thời điểm Ban đầu tháng, nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng tháng, 40 oC, tránh ánh sáng tháng, nhiệt độ phòng, ánh sáng Tiêu chuẩn DD muối Na DD muối K suốt 8,02 94,7% không màu suốt 8,06 95,4% vàng nhạt suốt DD muối TEA không màu đến vàng nhạt suốt 8,11 100,0% không màu/ vàng nhạt suốt 8,16 94,5% không màu đến vàng nhạt suốt 8,26 94,8% vàng cam đậm suốt 7,72 7,91 Màu sắc không màu không màu không màu không màu Độ pH Hàm lượng suốt 8,01 99,7% suốt suốt 8,93 7,40 x x Màu sắc không màu không màu không màu không màu Độ pH Hàm lượng suốt 7,98 96,8% suốt suốt 8,79 7,39 x x Màu sắc không màu Độ pH Hàm lượng Màu sắc Độ trong suốt 8,03 96,3% vàng nhạt suốt pH 7,64 (×): khơng đánh giá x x x x x x x x vàng nhạt vàng nhạt suốt suốt 8,56 7,12 suốt 8,04 99,4% 50 Hình 3.3 Dd muối furosemid TEA-K-Na/pH 8,0; Na/pH 9,0; Na/pH 7,4 sau tháng 40 oC điều kiện: (A)-ánh sáng ban ngày; (B)-tránh ánh sáng Nhận xét: Kết từ hình 3.3 bảng 3.9 cho thấy, dd muối điều kiện tránh sáng khơng có khác biệt đáng kể điều kiện nhiệt độ phòng 40 oC Hàm lượng FUR giảm muối, muối Na có suy giảm thấp Dưới điều kiện ánh sáng ban ngày, dd muối TEA có biến đổi màu rõ rệt; dd muối giảm pH Như vậy, muối Na có tính ổn định muối khảo sát, đồng thời phối hợp với PG Tween 80 làm tăng độ tan FUR môi trường HCl 0,1 N Nghiên cứu sử dụng phối hợp phương pháp tạo muối Na bổ sung PG, Tween 80 để hòa tan FUR CT khảo sát 3.1.4 Khảo sát tạo phức Ca Kết khảo sát tạo phức Ca citrat trình bày bảng 3.10-11 hình 3.4 Bảng 3.10 Sự biến đổi trạng thái dd muối calci Na citrat với tỉ lệ mol sau khoảng thời gian Dd muối (0,2% Ca) Tỉ lệ mol calci:citrat 10 phút Độ 12 Ca gluconat 1:0,5 đục mờ đục đục Ca lactat 1:0,5 mờ đục đục đục Ca glycerophosphat 1:0,5 trong tủa tủa Ca glucoheptonat 1:0,5 trong trong 1:0,75 trong đục đục 1:1 trong đục đục Bảng 3.11 Khả tạo phức calci Na citrat với tỉ lệ mol khác Dd muối (0,2% Ca) Ca gluconat Ca lactat Ca glycerophosphat Ca glucoheptonat Tỉ lệ mol Ca:citrat 1:0 1:0 1:0 1:0 1:0,5 1:0,75 1:1 Na alginat 2% Sự gel hóa +++ +++ ++ ++ + (-): khơng bị gel hóa; (+): gel hóa ít; (++): gel hóa phần; (+++): gel hóa hồn tồn 51 Hình 3.4 - Sự biến đổi trạng thái dd muối calci có mặt Na citrat A- Muối glucoheptonat-glycerophosphat-gluconat-lactat 10 phút B- Muối glucoheptonat-glycerophosphat-gluconat-lactat C- Muối glucoheptonat-gluconat-glycerophosphat 12 D- Muối glucoheptonat với tỉ lệ mol Na citrat 0,5-0,75-1 Hình 3.5 Sự gel hóa đánh giá qua tượng Tyndall A - alginat 2% ; B - alginat 2% + A (1:0,5:0,25) C - alginat 2% + A (1:0,5:0,15); D - alginat 2% + A (1:0,5:0,05) E - alginat 2% + A (1:0,5:0) ; F - alginat 2% + A (1:0:0) A: hỗn hợp (Ca glucoheptonat : Na citrat : EDTA dinatri) Nhận xét: Thời gian, mức độ hình thành tủa Ca citrat có biến đổi theo loại muối calci, lactat > gluconat > glycerophosphat > glucoheptonat (hình 3.3-A) Lượng citrat tăng lên, kết tủa Ca citrat tăng (hình 3.3-D) Sự kết hợp Ca glucoheptonat Na citrat với tỉ lệ mol 1:0,5 cho thấy ổn định dd, khơng có hình thành tủa Ca citrat sau 12 Khi tăng lượng Na citrat lên tỉ lệ 0,75 1, sau giờ, quan sát có kết tủa Ngược lại, gel hóa phần với tỉ lệ 1:0,5, dd trở nên nhớt hơn; đó, với tỉ lệ 1:0,75 1:1, khơng xảy gel hóa Để cải thiện vấn đề này, nghiên cứu tiến hành khảo sát với bổ sung lượng nhỏ EDTA dinatri Sự gel hóa đánh giá qua tượng Tyndall, phân tử polymer trạng thái sol có kích thước nhỏ, cho tia sáng qua; trạng thái gel hóa, polymer trương nở, giãn dài, cản trở truyền qua, làm phân tán tia sáng (hình 3.5) 52 Kết cho thấy tạo phức tối ưu với tỉ lệ mol Ca glucoheptonat : Na citrat : EDTA dinatri 1:0,5:0,25, không xảy gel hóa khơng có tủa hình thành sau 48 dd 3.1.5 Khảo sát số đặc tính gel Na alginat số polymer thứ cấp Kết khảo sát ảnh hưởng đặc tính gel alginat, bicarbonat calci trình bày bảng 3.12 hình 3.6-3.7 Bảng 3.12 Khảo sát đặc tính gel ảnh hưởng alginat, bicarbonat calci G Na alginat Calci Citrat : EDTA NaHCO3 NaOH 0,1 N 1 2 3 0,25 0,5 1,5 vđ 0,1 0,5 2 0,1 0,1 vđ 1,5 Đánh giá Tiềm thời 1,1 6,9 9,6 30p 8,47 12,23 4,27 4,05 Thời gian >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 10p + + x x + + x Mức độ 30p ++ ++ x x + ++ ++ ++ x phân tán +++ +++ +++ x x +++ +++ +++ x gel +++ +++ +++ x x +++ +++ +++ x (-): gel ổn định, bị phân tán; (+): gel phân tán ít; (++): gel phân tán nhiều; (+++): gel phân tán hồn tồn; (×): khơng đánh giá 10 0,2 7,02 >5 + + Hình 3.6 Khả gel đặc tính gel A - Gel alginat 2% với tỉ lệ NaHCO3 0,25-0,5-0,75-1 B - Gel alginat thời điểm ban đầu sau khoảng thời gian khuấy động 10 phút-30 phút-1 với hàm lượng 1%-2%-3% Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 53 Hình 3.7 Đặc tính hình dạng gel alginat 2% (1) - sau khoảng thời gian khuấy động 30 phút-1 giờ-2 với tỉ lệ calci : NaHCO3 (2) - tỉ lệ calci A- 0%; B-0,2% Nhận xét Thời gian tiềm thời: - Thời gian tiềm thời gel có thay đổi đáng kể tăng lượng NaHCO3 (G2, G4, G5, G6 – bảng 3.12, hình 3.6 (A)) - Nồng độ alginat tăng, thời gian tiềm thời tăng (G1, G2, G3 - bảng 3.12) - Với NaHCO3 0,5%, thêm calci 0,1%, thời gian tiềm thời tăng (G5, G7 bảng 3.12) Với NaHCO3 1%, 1,5%, lượng calci không làm biến đổi đáng kể thời gian tiềm thời (G2, G6, G9, G10 - bảng 3.12) Thời gian - Thời gian gel có thay đổi rõ rệt theo hàm lượng NaHCO3 Với NaHCO3 ≥ 0,5%, tổng thời gian đạt yêu cầu cho dạng bào chế Sau giờ, hàm lượng 0,75% 1% khơng có thay đổi đáng kể khả (hình 3.6-A) - Các yếu tố: hàm lượng alginat, calci thay đổi không làm thay đổi nhiều thời gian thời gian quan sát Tất CT khảo sát cho thời gian > (bảng 3.12) Mức độ phân tán gel - Đánh giá G9 G10 cho thấy, nồng độ calci tăng, gel bền, mức độ phân tán gel thấp (hình 3.7) - Hàm lượng NaHCO3 tăng dẫn đến phân tán gel xảy nhanh (hình 3.6) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 54 Gel với lượng NaHCO3 1,5% bị phân tán chưa khuấy động CT G70,5% có phân tán gel xảy chậm hơn, mức độ phân tán thời điểm 30 phút so với G9-1% G8-1,5% Các kết cho thấy, lượng NaHCO3 có ảnh hưởng chủ yếu đến khả dạng bào chế Lượng NaHCO3 từ 1% trở lên cho kết khả quan thời gian tiềm thời tổng thời gian NaHCO3 cao, gel dễ bị phân tán, đồng thời tăng khả tương tác với ion Ca2+, dẫn đến hình thành tủa Trong đó, aginat calci ảnh hưởng chủ yếu đến độ bền gel Mức độ phân tán gel không đáng kể sau với hàm lượng aginat ≥ 2% calci ≥ 0,2% Vì công thức gel in situ xây dựng với hàm lượng tối thiểu alginat 2%, calci 0,2% NaHCO3 1% Kết khảo sát ảnh hưởng đặc tính gel polymer thứ cấp trình bày bảng 3.13 hình 3.8 Bảng 3.13 Khảo sát đặc tính gel ảnh hưởng polymer thứ cấp G Na alginat Calci (dạng muối) Citrat:EDTA NaHCO3 Na CMC Carbomer 974P PVP K30 HPMC K15M NaOH 0,1 N 11 0,2 12 0,2 13 0,2 14 0,2 0,5 - 0,5 vđ 0,5 - 0,5 - vđ Đánh giá Thời gian >5 >5 >5 >5 Tiềm thời 8,94 18,66 6,78 4,41 10p ++ + Gel phân 30p + ++ + tán mảnh + +++ ++ nhỏ + + +++ ++ Tách 24 to thường lớp tủ lạnh O 40 C (-): gel ổn định, bị phân tán; (+): gel phân tán ít; Hình 3.8 Đặc tính gel alginat 2% với tỷ lệ calci: NaHCO3 (0,2:1) polymer (0,5%) sau thời gian khuấy động 10 phút; 30 phút; giờ; (++): gel phân tán nhiều; (+++): gel phân tán hoàn toàn; Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 Nhận xét: - Các polymer thứ cấp sử dụng có hỗn hịa tốt với Na alginat, khơng có tách lớp điều kiện môi trường bảo quản sau 24 - Thời gian tiềm thời có khác biệt polymer, theo thứ tự tăng dần PVP K30 > HPMC K15M tương đương khơng có polymer thứ cấp > CMC >> Carbomer 974P Thời gian CT đạt (G10->G14-bảng 3.12-13) - Với HPMC K15M PVP K30 gel hóa tạo mảnh gel rời rạc so với Carbomer 974P CMC hàm lượng Sự phân tán theo thời gian quan sát diễn nhanh theo thứ tự PVP K30 > HPMC K15M tương đương khơng có polymer thứ cấp > carbomer 974P tương đương CMC (hình 3.7-8) Như vậy, gel có phối hợp polymer thứ cấp carbomer 974P Na CMC cho đặc tính gel tốt, chọn để xây dựng hệ gel in situ 3.1.6 Xây dựng công thức quy trình bào chế gel in situ furosemid Kết khảo sát CT gel in situ cảm quan, tiềm thời nổi, khả rót, hoạt chất phóng thích trình bày bảng 3.14, hình 3.9-10 Bảng 3.14 Kết khảo sát công thức gel in situ (n = 3) CT F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 Cảm quan * Đ Đ Đ Đ Đ Đ Đ Đ Đ Đ Thời gian tiềm thời (s) Thời gian (h) 10,9 17,4 24,2 21 23,1 22,2 23,9 18,7 15,5 16,3 14,6 21,1 22,8 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 >5 Khả rót +++ +++ ++ + ++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ ++ Hàm lượng FUR phóng thích (%) giờ giờ 69,8 60,2 46,4 74,7 42,4 53,1 49,2 59,7 64,2 69,9 56,9 49,4 48,4 72,6 69,1 54,6 78,7 51,2 60,0 57,4 69,0 76,2 78,4 67,1 58,6 57,6 77,7 72,2 60,6 80,2 52,7 63,9 63,0 76,3 84,1 85,1 72,1 69,6 64,6 79,3 77,4 63,9 83,5 55,9 66,0 66,1 77,4 87,0 88,2 75,4 74,9 71,9 83,0 80,0 68,7 83,7 56,0 68,1 68,1 79,7 90,2 89,5 77,2 81,0 75,7 (*) dịch nhớt, mờ, khơng có tiểu phân lắng đáy, màu trắng đến trắng ngà (+++): dịch lỏng, dễ rót; (++): dịch nhớt, rót, (+): dịch nhớt, khó rót Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 56 Nhận xét: - Cảm quan: Các chế phẩm có màu trắng đến trắng ngà, độ đục phụ thuộc vào thành phần nồng độ polymer Các CT chứa đơn thành phần CMC mức nồng độ có xuất lớp tủa lắng đáy sau vài ngày (F9-F11), tái phân tán có đồng nhất, trì > phút - Thời gian nổi: CT trì độ thời gian > - Thời gian tiềm thời: CT chứa CMC có thời gian tiềm thời ngắn so với 974P Thời gian tiềm thời đạt yêu cầu với tất CT Hình 3.9 Sự phóng thích hoạt chất theo nồng độ polymer (A) - carbomer; (B) – alginat; (C) – CMC Nhận xét: kết từ hình 3.9 cho thấy - Khi tăng lượng carbomer 974P từ 0,25% lên 0,5%, gel giảm phóng thích hoạt chất (PTHC) Khi tăng lên 0,75%, PTHC tăng lên, giải phóng 74,7% đầu Với nồng độ 0,5%, CT chứa carbomer có độ GPHC thấp - Với nồng độ carbomer (0,5%) calci (0,25%), tăng nồng độ alginat, PTHC tăng, có biến đổi rõ rệt nồng độ 2% (F5) so với 3% (F6) 4% (F7) Khơng có khác biệt nhiều nồng độ 3% 4% - Khi nồng độ CMC tăng từ 0,25% lên 0,5%, mức độ PTHC tăng đáng kể Với nồng độ CMC 0,25 (F11), đầu hoạt chất phóng thích 56,9% đạt 77,2% Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 57 sau giờ; đó, với nồng độ 0,5% (F10), hoạt chất phóng thích 69,9% đầu đạt 89,5% sau Hình 3.10 Sự phóng thích hoạt chất (A)-theo loại polymer thứ cấp; (B)-theo loại polymer thứ cấp với tỉ lệ phối hợp Nhận xét: kết từ hình 3.10 cho thấy - Sự PTHC tăng lượng calci 0,2% lên 0,25%, với nồng độ CMC (F9 F10), cao giai đoạn đầu; thời điểm khơng có khác biệt Ngược lại, với nồng độ carbomer 974P, lượng hoạt chất giải phóng giảm dần (F3 F5) (hình 3.10-A) - Lượng hoạt chất giải phóng CT với CMC (F9) cao so với carbomer 974P (F3), kể tăng hàm lượng calci (F10 F5) (hình 3.10-A) - Sự kết hợp loại polymer (F12-F13) cho thấy có kiểm sốt tốt giai đoạn đầu, khả GPHC cải thiện giai đoạn sau so với sử dụng riêng lẻ CMC (F9) carbomer 974P (F3) (hình 3.10-B) Kết đánh giá mơ hình động học phóng thích trình bày bảng 3.15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 58 Bảng 3.15 R2 mơ hình động học Mơ hình động học F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 Bậc 0,5769 0,6516 0,7254 Bậc 0,742 0,8222 0,8512 Higuchi 0,835 0,8908 0,9358 Hixson 0,6802 0,7632 0,8098 Kor's peppas 0,4629 0,5483 0,626 0,5262 0,6601 0,7975 0,6075 0,4176 0,6312 0,6226 0,6789 0,6482 0,6833 0,6282 0,6592 0,7961 0,7701 0,7041 0,7325 0,7989 0,8064 0,9143 0,8579 0,811 0,9495 0,9159 0,8794 0,8722 0,9099 0,8906 0,913 0,8765 0,8979 0,9699 0,9583 0,7041 0,6936 0,7581 0,7522 0,8411 0,7788 0,7589 0,9069 0,8716 0,5415 0,5215 0,5835 0,5550 0,5916 0,529 0,5657 0,7011 0,6719 Nhận xét: CT F12 có GPHC tối ưu CT khảo sát Sự GPHC đạt > 75% sau Khả trì thời gian tiềm thời đạt yêu cầu thử nghiệm Quan sát thực nghiệm trình thử độ hịa tan, gel trì sau giờ, có phân tán mơi trường in vitro không ảnh hưởng đáng kể Sự GPHC F12 phù hợp với mơ hình động học Higuchi, R2 = 0,9699 Bảng 3.16 Độ hòa tan F12 số viên nén thị trường F12 Viên nén (1) Viên nén (2) 49,4 63,1 75,4 Độ hòa tan (n=3) giờ 58,6 69,6 74,9 73,6 81,5 84,6 83,2 86,5 88,9 81,0 87,8 91,1 Nhận xét: chưa có dạng bào chế gel in situ chứa FUR thị trường, dạng bào chế phóng thích hoạt chất kéo dài Vì nghiên cứu sử dụng viên nén thương mại để đánh giá so sánh Trong môi trường thử nghiệm độ hịa tan, F12 có khả kiểm soát PTHC so với viên nén thương mại, đạt mục tiêu nghiên cứu dạng bào chế có khả GPHC kéo dài Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 59 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu 3.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng furosemid hỗn hợp paraben chế phẩm phương pháp quang phố UV-Vis Xác định đỉnh hấp thu FUR PARs bước sóng phép đo Các phổ FUR, PARs, phổ chồng FUR-PARs trình bày hình 3.11 Hình 3.11 Phổ hấp thu UV (A)-PARs, (B)-FUR, (C)-phổ chồng PARs-FUR Nhận xét: Từ phổ UV ghi nhận được, xác định λmax FUR λmax PARS 275 nm 255 nm; điểm đẳng quang (isosbestic point) FUR PARs bước sóng 258 nm Phương pháp Q –Value Q –Value FUR PARs tính tốn cách lấy tỷ số giá trị độ hấp thụ 275 nm (λmax FUR) 258 nm (điểm đẳng quang) Với: Cf Cp nồng độ FUR PARs A2 A1 độ hấp thụ mẫu 275 nm 258 nm (điểm isosbestic) 𝜀𝜀𝑓𝑓2 𝜀𝜀𝑓𝑓1 hệ số tắt mol FUR 275 nm 258 nm (l.mol-1.cm-1) 𝜀𝜀𝑝𝑝2 𝜀𝜀𝑝𝑝1 hệ số tắt mol PARs e 275 nm 258 nm (l.mol-1.cm-1) Qf Qp giá trị Q FUR PARs tương ứng (Qn) Giá trị thơng số thu trình bày bảng 3.17 Bảng 3.17 Giá trị thông số phương pháp định lượng Q-value λ = 258 nm λ = 275 nm 𝜺𝜺�𝟏𝟏 𝜺𝜺�𝟐𝟐 Qn FUR 8,62 ± 0,16 ×103 21,18 ± 0,16 ×103 2,4564 PARs 16,56 ± 0,28 ×103 7,15 ± 0,25 ×103 0,4317 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 60 CT tính nồng độ FUR PARs là: 𝐶𝐶𝑓𝑓 = 𝐴𝐴1 𝑄𝑄𝑚𝑚 − 2,4564 𝐴𝐴1 𝑄𝑄𝑚𝑚 − 0,4317 × ; 𝐶𝐶𝑝𝑝 = × −2,0247 2,0247 8,62 × 10 16,56 × 103 Bảng 3.18 Kết độ tuyến tính phương pháp định lượng Q-value FUR PARs 275 nm 258 nm 275 nm 258 nm R2 0,9998 0,9999 0,9989 0,9999 Hệ số tự b 0,0028 0,0052 0,0015 0,0013 Giá trị t hệ số tự 0,7186 3,694599 0,8543 0,5734 Hệ số góc a 0,0625 0,0249 0,0444 0,1042 Giá trị t hệ số góc 170,95 191,29 66,26 121,95 F 29225 36592 4390 36592 F0,05 6,61 6,61 6,61 6,61 t0,05 2,57 2,57 2,57 2,57 Phương trình hồi quy 𝑦𝑦� = 0,0625x 𝑦𝑦� = 0,0249x + 0,0052 𝑦𝑦� = 0,0444x 𝑦𝑦� = 0,1042x Khoảng nồng độ khảo sát 4-16 µg/mL 1-4 µg/mL 4-16 µg/mL 1-4 µg/mL LOD 0,2084 0,1863 0,1341 0,0729 LOQ 0,6316 0,5644 0,4064 0,2208 Nhận xét: Theo kết thống kê trình bày bảng 3.18, cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ độ hấp thu FUR PARs bước sóng khảo sát với hệ số tương quan R2 > 0,995 Độ Kết độ phương pháp trình bày bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết độ phương pháp định lượng Q-value n=3 TB RSD% TB 100% RSD% TB 120% RSD% 80% mcân (mg) 32,0 ± 0,2 0,5 40,0 ± 0,1 0,3 48,1 ± 0,1 0,1 FUR mthu (mg) 32,3 ± 0,3 40,2 ± 0,2 0,5 48,1 ± 0,1 0,2 Tỷ lệ phục hồi (%) 100,7 ± 0,6 0,6 100,5 ± 0,2 0,2 100,1 ± 0,1 0,1 mcân (mg) 8,0 ± 0,1 0,7 10,1 ± 0,1 0,3 12,0 ± 0,1 0,5 PARs mthu (mg) 8,1 ± 0,1 0,6 10,1 ± 0,1 12,0 ± 0,1 0,5 Tỷ lệ phục hồi (%) 100,6 ± 0,3 0,3 100,7 ± 0,6 0,6 99,7 ± 0,2 0,2 Nhận xét: tỷ lệ phục hồi FUR PARs ba mức nồng độ nằm khoảng 97-103% với RSD ≤ 2% Vậy quy trình đạt độ dúng Khoảng xác định: FUR 6,4-9,6 µg/mL PARs 1,6-2,4 µg/mL Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 61 Độ xác Độ lặp lại Kết độ lặp lại phương pháp trình bày bảng 3.20 Bảng 3.20 Kết độ lặp lại phương pháp định lượng Q-value STT V mẫu (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Độ hấp thu A1 0,4301 0,4236 0,4273 0,4315 0,4302 0,4239 A2 0,6089 0,6066 0,6084 0,6103 0,6051 0,6098 TB RSD (%) Hàm lượng (%) FUR PARs 100,7 100,4 100,7 100,9 100,0 101,0 100,6 ± 0,4 0,4 100,3 99,7 99,9 100,5 100,4 100,2 100,2 ± 0,3 0,3 Kết luận: Quy trình đạt độ xác với RSD ≤ 2% Độ xác trung gian Kết độ xác trung gian phương pháp trình bày bảng 3.21 Bảng 3.21 Kết độ xác trung gian phương pháp định lượng Q-value STT V mẫu (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Ngày Độ hấp thu A1 0,4251 0,4232 0,4243 0,4261 0,4236 0,4253 A2 0,6089 0,6066 0,6084 0,6103 0,6051 0,6098 TB1 % RSD Ngày Hàm lượng (%) FUR 100,7 100,4 100,7 100,9 100,0 101,0 PARs 100,3 99,7 99,9 100,5 100,4 100,2 100,6±0,4 101,0±0,6 0,4 0,6 Độ hấp thu A1 0,4235 0,4187 0,4219 0,4198 0,4206 0,4249 A2 0,6071 0,5999 0,6044 0,6021 0,6026 0,6097 TB2 % RSD Hàm lượng (%) FUR 100,5 99,5 100,0 99,7 99,7 101,0 PARs 99,8 99,1 99,5 98,8 99,2 100,0 100,0± 0,6 99,4±0,4 0,6 0,4 F = 4,29 ; Fcrit = 4,96 F < Fcrit => Quy trình đạt độ xác trung gian Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 62 3.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng furosemid chế phẩm phương pháp HPLC Độ đặc hiệu Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu phân tích Nhận xét: sắc ký đồ thu nhận đạt yêu cầu đề Quy trình phân tích có tính đặc hiệu Độ tuyến tính Hình 3.13 Đồ thị hồi quy tuyến tích chất phân tích Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 Bảng 3.22 Kết độ tuyến tính phương pháp định lượng HPLC FUR 0,9991 1450689 6,21 32258408 57,5 3300 6,61 2,45 𝑦𝑦� = 32258408x + 1450689 0,24-0,56 mg/mL R Hệ số tự Giá trị t hệ số tự Hệ số góc Giá trị t hệ số góc F F0,05 t0,05 Phương trình hồi quy Khoảng nồng độ khảo sát MP 0,9995 561626 9,42 50986994 80,0 6393 6,61 2,45 𝑦𝑦� = 50986994x + 1450689 0,054-0,126 mg/mL PP 0,9997 44905 8,81 49895150 101,8 10353 6,61 2,45 𝑦𝑦� = 49895150x + 44905 0,006-0,014 mg/mL Nhận xét: Kết trình bày thể mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ chất phân tích với r > 0,9998 Tương thích hệ thống Bảng 3.23 Kết tính tương thích hệ thống phương pháp định lượng HPLC STT Trung bình SD RSD (%) FUR Thời gian Diện tích pic lưu (phút) (mV*s) 11,186 14550077 11,172 14710221 11,176 14267790 11,169 14567829 11,185 14512255 11,180 14055909 11,178 14444014 0,06 1,51 Đỉnh Độ phân giải MP - MP Thời gian Diện tích pic lưu (phút) (mV*s) 7,433 5246330 7,423 5297505 7,430 5151988 7,419 5251908 7,433 5234121 7,430 5065327 7,428 5207863 0,07 1,48 FUR 8,45 Thời gian lưu (phút) 17,517 17,501 17,505 17,497 17,524 17,530 17,512 0,07 PP Diện tích pic (mV*s) 558741 563247 551353 558927 563298 535031 555100 1,77 PP 9,67 Nhận xét: - RSD < 2% - Độ phân giải pic chuẩn FUR PP so với MP > 1,5 Các pic tách hồn tồn Quy trình định lượng có tính tương thích hệ thống Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 64 Độ Bảng 3.24 Kết độ phương pháp định lượng HPLC FUR n=3 80% 100% 120% mthêm (mg) TB 15,892 RSD% - TB 19,865 RSD% - TB 23,838 RSD% - mthu (mg) MP Tỷ lệ phục hồi (%) mthêm (mg) mthu (mg) 16,071 101,1 ± 3,606 3,577 ± 0,007 0,0 ± 0,035 0,0 0,0 1,0 20,021 100,8 ± 4,494 4,471 ± 0,164 0,8 ± 0,057 0,8 0,7 1,0 23,770 5,344 ± 99,7 ± 1,5 5,365 ± 0,350 0,014 1,5 1,2 0,3 PP Tỷ lệ phục hồi (%) 100,8 ± 1,0 0,8 100,5 ± 1,3 1,0 99,6 ± 0,3 0,2 mthêm (mg) mthu (mg) 0,403 ± 0,004 0,9 0,496 ± 0,500 0,004 0,9 0,593 0,599 0,006 1,0 0,400 Tỷ lệ phục hồi (%) 100,8 ± 0,9 0,7 99,39 ± 0,9 0,7 99,01 ± 1,0 0,8 Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi chất phân tích nằm khoảng 98-102 %, với RSD ≤ 2% mức nồng độ Quy trình đạt độ Độ xác Kết độ lặp lại độ xác trung gian quy trình định lượng trình bày bảng 3.25 Bảng 3.25 Kết độ xác phương pháp định lượng HPLC FUR STT TB %RSD Ngày Nồng độ (mg/mL) 0,404 0,408 0,404 0,404 0,404 0,403 0,405 0,040 Diện tích pic 14654532 14800055 14662017 14666688 14655539 14625945 14677463 0,384 Ngày Hàm lượng (%) 101,0 102,0 101,0 101,1 101,0 100,8 101,1±0,4 0,4 F = 3,61 ; Fcrit = 5,05 => var1 ≈ var2 Nồng độ (mg/mL) 0,407 0,401 0,410 0,402 0,405 0,402 0,404 0,729 Diện tích pic 14854186 14656625 14964966 14693529 14782284 14693915 14774251 0,729 Hàm lượng (%) 101,6 100,3 102,4 100,5 101,2 100,5 101,1 ± 0,8 0,8 p > 0,05 => Quy trình đạt độ xác trung gian Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 MP Ngày STT Ngày Nồng độ Nồng độ Diện tích pic Hàm lượng (%) Diện tích pic Hàm lượng (%) (mg/mL) (mg/mL) 0,090 5310869 100,2 0,090 5304482 100,3 0,091 5346860 100,9 0,091 5332581 100,8 0,090 5308530 100,2 0,091 5342860 101,0 0,091 5363273 101,2 0,091 5320445 100,6 0,091 5343445 100,8 0,091 5374921 101,6 0,091 5383760 101,6 0,091 5343414 101,0 TB 0,091 5342790 100,8±0,6 0,091 5336451 100,9 ± 0,5 %RSD 0,5 0,5 0,5 0,4 0,4 0,4 F = 1,49 < Fcrit = 5,05 => var1 ≈ var2 p > 0,05 => Quy trình đạt độ xác trung gian, PP Ngày Ngày Nồng độ Hàm lượng Nồng độ Hàm lượng Diện tích pic Diện tích pic (mg/mL) (%) (mg/mL) (%) 0,0100 478529 100,2 0,0102 519175 100,3 0,0100 478111 100,1 0,0100 511712 100,8 0,0101 481249 100,8 0,0100 511996 101,0 0,0102 485799 101,7 0,0101 516717 100,6 0,0102 486874 101,9 0,0102 521387 101,6 0,0102 486583 101,9 0,0101 518653 101,0 TB 0,010 482858 101,1±0,9 0,010 516607 101,1 ± 0,8 %RSD 0,8 0,8 0,8 0,7 0,7 0,8 F = 1,19 < Fcrit = 5,05 => var1 ≈ var2 p > 0,05 => Quy trình đạt độ xác trung gian STT 3.2.3 Xây dựng quy trình thử độ hòa tan furosemid hệ gel in situ Theo liệu mục 3.1.2, FUR khó tan mơi trường thử độ hịa tan pH 1,2, khơng đạt điều kiện sink Vì vậy, đề xuất thêm chất diện hoạt vào môi trường thử nghiệm để tạo điều kiện sink cho FUR Bảng 3.26 Độ tan điều kiện sink furosemid với nồng độ chất diện hoạt mơi trường HCl 0,1 N n=3 Atb Độ pha lỗng Cbh ( µg/mL) Hệ số Sink 0,0975 27,6 0,62 0,25 0,3351 94,7 2,13 Natri lauryl sulfat (%) 0,5 0,75 0,2030 0,2447 0,2832 10 10 10 114,7 138,2 160 2,58 3,11 3,60 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 Nhận xét: Từ kết độ tan hoạt chất điều kiện trên, dd HCl 0,1 N + 0,75% SLS chọn môi trường thử độ hòa tan cho sản phẩm Đánh giá ổn định FUR mơi trường thử độ hịa tan Bảng 3.27 Kết độ ổn định furosemid môi trường thử độ hòa tan � 𝟏𝟏 � 𝟐𝟐 � 𝟑𝟑 Thời gian (giờ) 𝑨𝑨 𝑨𝑨 𝑨𝑨 0,2315 0,2288 0,2326 0,2309 0,2292 0,2332 0,2285 0,2254 0,2307 � tb 𝑨𝑨 SD RSD (%) �n SDn %RSDn 𝑨𝑨 0,2310 0,0020 0,85 0,2311 0,0020 0,87 0,2295 0,0022 0,94 0,2305 0,0009 0,38 Nhận xét: độ hấp thu FUR môi trường HCl 0,1 N + 0,75% SLS sau khoảng thời gian khơng có biến đổi đáng kể, với RSD < % Dd ổn định khoảng thời gian khảo sát, phù hợp với điều kiện thử độ hòa tan 3.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở dự kiến cho sản phẩm nghiên cứu Tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu gồm tiêu: cảm quan, thời gian tiềm thời nổi, thời gian nổi, định tính, định lượng, độ hịa tan Bảng 3.28 Tiêu chuẩn thành phẩm (DỰ KIẾN) STT Tiêu chuẩn Cảm quan Giới hạn thể tích pH Giới hạn nhiễm khuẩn Thời gian tiềm thời Thời gian Định tính Độ hòa tan Định lượng Dịch nhớt, đục mờ; màu trắng đến vàng nhạt Khơng thể tích ghi nhãn 8,0-9,0 PL13.6-DĐVN V < 10 phút > A: Quang phổ UV-Vis: Độ hấp thụ dung dịch thử dung dịch chuẩn không khác đáng kể B: Thời gian lưu đỉnh sắc ký đồ mẫu định lượng tương ứng với sắc đồ mẫu chuẩn thu định lượng giờ: 35-55 % giờ: 55-75 % giờ: >75% Hàm lượng FUR nằm khoảng 90,0 % đến 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 67 3.4 Xây dựng quy trình bào chế chế phẩm qui mô 500 mL - 2500 mL Trong điều kiện cho phép, nghiên cứu tiến hành thực nâng cỡ mẫu lên 500 mL 2500 mL để đánh giá khả lặp lại CT pha chế quy trình bào chế quy mơ tính tốn trình bày bảng 3.29 hình 3.14 Bảng 3.30 ghi nhận số thơng số cần kiểm sốt q trình bào chế Bảng 3.29 Cơng thức pha chế quy mô 500 mL 2500 mL STT Tên nguyên liệu Khối lượng (g)/500 mL Khối lượng (g)/2500 mL Hàm lượng (%) Furosemid 4,0 20 (+5%) 0,8 Tween 80 10 0,2 Propylenglycol 10 0,2 NaOH 0,7 3,5 0,14 Na alginat 20 100 Na CMC 0,1 Carbomer 974P 20 0,4 Ca glucoheptonat 24,5 122,5 2,45 Na citrat (2H2O) 7,4 37 0,74 10 EDTA.2Na (2H2O) 4,2 21 0,42 11 NaHCO3 10 50 12 Methyl paraben 1,8 0,18 13 Propyl paraben 0,2 0,02 14 NaOH 0,1 N vđ vđ vđ 15 Nước cất vđ 500 mL vđ 2500 mL vđ 100 Bảng 3.30 Các thơng số kiểm sốt quy trình bào chế Giai đoạn Hòa tan alginat Hòa tan polymer thứ cấp Dd Ca-CTP Trộn dd gel in situ Trộn hoàn tất Thông số Nhiệt độ Thời gian khuấy Tốc độ khuấy Nhiệt độ Tốc độ khuấy Thời gian khuấy pH Nhiệt độ Nhiệt độ Tốc độ khuấy Thời gian khuấy Giới hạn 50 oC 45 phút 1000 vòng/phút 40 oC 1000 vòng/phút 75 phút 7,0 40 oC 500 40 phút Giới hạn 60 oC 1500 vòng/phút 45 oC 1500 vòng/phút 8,0 45 oC nhiệt độ phòng 600 - Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 Cốc pha chế Cốc pha chế Cốc pha chế Cốc pha chế Thêm nước Thêm nước Thêm nước Thêm FUR, PG, Tween 80 Thêm canxi glucoheptonat, natri citrat EDTA di natri Hòa tan Nhiệt độ 50-60 oC Phân tán Thêm Natri alginat Nhiệt độ ~40 o C Điều chỉnh pH >7 Hòa tan Thêm hỗn hợp Na CMC Carbopol Thêm nước NaOH Hòa tan Trộn Lọc Nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH ≥ 8,0 Để ổn định qua đêm Hòa tan Thêm PAR Thêm dung dịch Natri bicarbonat Kiểm sốt tốc độ trộn Trộn Hịa tan Lọc Kiểm sốt tốc độ trộn Điều chỉnh thể tích Phân liều vào chai Đậy nắp, Dán nhãn Hình 3.14 Quy trình bào chế gel in situ furosemid Đánh giá thành phẩm bào chế với quy mô 500 mL 2500 mL Kết đánh giá thành phẩm quy mô theo số tiêu chuẩn dự kiến: cảm quan, pH, thời gian tiềm thời, tổng thời gian nổi, độ hòa tan, định lượng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 Bảng 3.31 Kết đánh giá thành phẩm qui mô 500 mL 2500 mL Quy mô ANOVA pvalue 2500 mL ANOVA pvalue 500 mL pH Thời gian tiềm thời Thời gian (*) 8,0-9,0 < 10 phút > Đạt Đạt Đạt 8,55±0,01 8,63±0,06 8,62±0,03 24,4±1,1 22,5±0,8 24,3±0,9 Đạt Đạt Đạt - 0,11 0,07 - Đạt Đạt Đạt 8,43±0,07 8,57±0,05 8,46±0,06 27,3±1,0 26,3±0,6 27,7±0,5 Đạt Đạt Đạt - 0,06 0,10 - Cảm quan Độ hòa tan (n = 6) giờ 35-55 % 65-75 % 48,4±1,0 68,4±1,8 49,3±1,1 67,1±1,0 49,1±1,2 69,3±1,3 0,37 0,06 49,2±1,0 68,1±1,3 48,6±0,9 69,3±1,0 48,4±1,3 69,1±1,2 0,90 0,20 Định lượng 90,0 - 110,0 % ≥ 75% 81,5±1,0 101,1±0,5 81,5±1,2 100,6±0,6 82,1±0,9 100,2±0,3 0,54 0,17 82,5±0,9 81,6±1,0 82,1±1,0 104,2±0,9 105,0±0,5 103,5±0,7 0,24 0,13 (*) dịch nhớt, mờ, khơng có tiểu phân lắng đáy, màu trắng đến trắng ngà Nhận xét: Các tiêu kiểm định thực lô quy mô 500 mL 2500 mL đạt tiêu chuẩn xây dựng với độ lặp lại Phân tích ANOVA yếu tố cho thấy lặp lại có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 3.5 Độ ổn định sơ chế phẩm Kết đánh giá độ ổn định điều kiện dài hạn độ ổn định sản phẩm điều kiện lão hóa cấp tốc (40 oC ± 75% RH ± 5%) dài hạn (30 oC ± 75% RH ± 5%) tháng trình bày bảng 3.31 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 70 Bảng 3.32 Kết đánh giá độ ổn định sơ chế phẩm (n=3) Điều kiện bảo quản Điều kiện Thời gian (tháng) (*) UV-Vis 8,0-9,0 Định lượng 30 °C ± °C/ 75% ± 5% 40 °C ± 2°C/ 75% ± 5% 3 Đạt Đúng 8,41±0,05 Đạt Đúng 8,42±0,07 Đạt Đúng 8,40±0,06 Đạt Đúng 8,39±0,04 Đạt Đúng 8,37±0,06 26,4±0,5 s 26,8±1,3 s 27,6±0,9 s 26,8±1,0 s 99,5±1,8 s Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt 48,4±1,2 48,1±0,7 49,4±1,3 49,9±0,9 52,5±1,0 55-75 % 68,2±1,0 67,3±0,7 68,8±0,9 69,1±1,2 72,1±0,7 ≥ 75% 90,0-110,0 % 80,8±0,8 101,0±0,4 80,2±0,8 101,3±0,3 81,1±1,1 100,8±0,5 83,0±1,0 101,0±0,4 87,2±0,9 100,1±0,7 Cảm quan Định tính pH Thời gian Giới hạn thể QĐ DĐVN V tích 35-55 % Độ hòa tan (n=6) Ban đầu (*) dịch nhớt, mờ, khơng có tiểu phân lắng đáy, màu trắng đến trắng ngà Nhận xét: Tính chất cảm quan các mẫu lưu trữ cho thấy khơng có khác biệt Giá trị pH trung bình nằm khoảng 8,0-9,0 Thời gian tiềm thời CT < 10 phút, tổng thời gian > Độ hịa tan với giải phóng hoạt chất thời điểm nằm khoảng giới hạn quy định Hàm lượng hoạt chất mẫu khơng có biến đổi đáng kể sau tháng điều kiện bảo quản Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 Về xây dựng công thức bào chế Hệ thống gel in situ hình thành chuyển hóa q trình sol-gel alginat mơi trường acid với cấu trúc nhóm -COOH nhạy pH với tương tác ion Ca2+ tiểu phân G Sự đạt nhờ CO2 sinh bị bắt giữ hệ thống gel nhờ mạng lưới polymer Các mạng lưới polymer góp phần kiểm sốt GPHC Dựa đặc điểm đó, nghiên cứu thực trình khảo sát yếu tố liên quan, bao gồm: loại calci phức kiểm soát; nồng độ phối hợp loại polymer; tác nhân sinh khí – NaHCO3 để đạt đặc tính tối ưu hệ thống bao gồm: khả nổi, độ bền gel kiểm sốt GPHC mơi trường acid dày Bên cạnh đó, hoạt chất FUR có tính thấm độ tan kém, hấp thu tốt dày phần ruột non Vì vậy, nghiên cứu thực khảo sát, đánh giá, nhằm chọn lựa phương pháp/ mơi trường hịa tan phù hợp, cải thiện độ tan FUR môi trường acid 4.1.1 Chọn lựa phương pháp hòa tan furosemid Phương pháp tạo muối hay điều chỉnh pH phương pháp đơn giản, thường xem xét biện pháp cải thiện độ tan hoạt chất, ứng dụng rộng rãi hoạt chất có tính acid yếu base yếu hòa tan Cụ thể, độ tan diclofenac dạng muối Na/ K tăng > 400 lần so với dạng khơng ion hóa; tương tự, độ tan enalapril maleat đạt 25 mg/mL so với dạng base đạt khoảng 0,21 mg/mL.48 Phương pháp tạo muối cho hòa tan tốt FUR trình pha chế Tuy nhiên, thử nghiệm khảo sát pha loãng (1:10) dd muối FUR có pH 8,0-9,0 mơi trường HCl 0,1 N (pH 1,2) cho thấy tái kết tinh tiểu phân FUR Sự kết tinh có nguy hình thành dạng tinh thể, với lượng mạng phân tử lớn, dẫn đến độ hòa tan FUR có khả bị biến đổi Trong trường hợp này, dung lượng hệ đệm phải xem xét Tuy nhiên, dạng bào chế có kết hợp thành phần polymer nhiều ion khác Ca2+, việc sử dụng hệ đệm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 72 có khả làm bất ổn định CT Vì vậy, phương án khác đề ra: sử dụng đồng dung môi bổ sung chất diện hoạt, với mong muốn giảm thiểu tái kết tinh FUR môi trường HCl 0,1 N Các phương pháp đồng dung môi, sử dụng chất diện hoạt thường phối hợp trường hợp phương pháp tạo muối không đạt hiệu quả, sử dụng nhiều nghiên cứu cải thiện độ tan Thực nghiệm cho thấy, độ tan FUR có tăng lên đáng kể dung môi PEG 400, ethanol, PG Tuy nhiên việc sử dụng lượng lớn thành phần dung mơi hay chất diện hoạt dẫn đến phá vỡ đặc tính cấu trúc hệ gel in situ Nguyên nhân cấu trúc cồng kềnh nhóm dung mơi/chất diện hoạt làm cản trở tương tác phân tử, đồng thời cản trở ion Ca2+ hình thành liên kết ngang mạng cấu trúc polymer, dẫn đến gel hình thành có độ bền Thực tế, sản phẩm alginat ester hóa PG lưu hành thị trường có khả tạo gel Các CT gel với hàm lượng chất diện hoạt Tween 80, PG ≥ 1% cho thấy phân tán nhanh chóng q trình thực nghiệm Vì vậy, nghiên cứu tiến hành đánh giá độ tan FUR với lượng PG thấp kết hợp với chất hoạt động bề mặt khác Phối hợp PG Tween 80 với tỉ lệ 1:1 cho kết khả quan so với sử dụng đơn thành phần hàm lượng lớn Độ tan FUR (1:0,25:0,25) môi trường HCl 0,1 N đạt 56,9 µg/ mL Tuy vậy, chưa đạt đủ điều kiện sink mơi trường hịa tan 4.1.2 Lựa chọn loại calci tác nhân tạo phức Có nhiều nguồn cung cấp calci dạng loại muối vô hữu Các muối vô tan thường có khả phân ly lớn, dẫn đến linh động ion Ca2+ tăng cao, dễ tương tác với polymer nhạy cảm thành phần CT Các muối vơ khơng tan khó phân tán đồng polymer Lựa chọn muối calci hữu tan tốt khả phân ly giảm thiểu nguy Các muối calci với số phân ly khác đánh giá với lượng Na citrat Kết cho thấy, Ca glucoheptonat trì dạng phức, tương Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 73 tác phần nhỏ citrat, mức nồng độ có khả hòa tan so với muối khác Tuy nhiên, calci cho thấy lực với alginat cao so với glucoheptonat, dẫn đến có hình thành gel phần tiếp xúc với dd alginat Tăng lượng citrat làm tăng nguy kết tủa, lượng citrat > 0,5 cho thấy có tủa Ca citrat Bổ sung EDTA xem xét Kết khảo sát cho thấy tỉ lệ mol calci:citrat:EDTA 1:0,5:0,25 cho hiệu tối ưu Sử dụng kết hợp chất tạo phức nhẳm giảm thiểu nồng độ sử dụng, giảm nguy có độc tính, đặc biệt với EDTA 4.1.3 Lựa chọn tác nhân tạo gel Dạng bào chế gel in situ diễn trình sol – gel dày, tác nhân tạo gel có độ nhạy với biến đổi pH ưu tiên sử dụng Na alginat polymer tự nhiên, có khả phân hủy sinh học, có độ an toàn cao, sử dụng rộng rãi nhiều ngành cơng nghiệp Q trình gel hóa alginat xảy ion hóa nhóm -COOH hình thành liên kết ngang với ion Ca2+, hình thành khối gel có bền nhiệt cao Trong đó, chế tạo liên kết ngang đóng vai trị chủ yếu tăng độ bền vững khối gel, tăng nồng độ alginat đơn không đạt độ bền vững mong muốn (đã chứng minh thực nghiệm) Cơ chế phụ thuộc vào lượng ion calci loại alginat - Loại alginat: Nghiên cứu lựa chọn nguồn alginat có tỉ lệ G cao nhằm tăng khả tạo liên kết ngang với Ca2+ - Lượng ion calci: nồng độ 0,1%, gel hình thành chưa có kiên kết rõ rệt, mức độ gel phân tán cao sau 30 phút, phân tán hoàn toàn sau Ở nồng độ 0,2%, độ bền gel cải thiện, phân tán xảy vịng đầu quan sát, cho thấy khả trì khối gel điều kiện sinh lý Có thể thấy, lượng Ca2+ đủ để hình thành liên kết ngang, tạo khối gel 0,2% Ngồi ra, sử dụng polymer thứ cấp nhằm cải thiện số đặc tính cho hệ gel, đặc biệt khả kiểm sốt giải phóng hoạt chất Trong phần lớn nghiên hệ gel in situ xây dựng trước đây, việc dụng phối hợp polymer cho công thức tối ưu Trong số polymer khảo sát, với tỉ lệ, Na CMC carbomer 974P cho thấy gel hình thành hỗn hợp polymer bền vững Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 điều kiện thử nghiệm, đạt tiêu chí độ Vì vậy, nghiên cứu lựa chọn Na CMC, carbomer 974P để khảo sát 4.1.4 Sự kiểm soát giải phóng hoạt chất polymer Na alginat calci tỉ lệ 2:0,2 không kết hợp polymer thứ cấp cho thấy khả kiểm soát hoạt chất khoảng thời gian cần thiết (F1) Carbomer 974P kiểm soát hoạt chất tốt khối gel, phóng thích hoạt chất Sự phóng thích hoạt chất giảm dần nồng độ tăng từ 0,25% đến 0,5% Khi nồng độ carbomer tăng đến 0,75%, phóng thích hoạt chất tăng lên, nguyên nhân giảm liên kết phân tử alginat cản trở lượng lớn carbomer Tuy nhiên, ko đạt điều kiện phóng thích Với nồng độ > 0,75%, khả rót giảm, dịch trở nên nhớt Thực nghiệm tiến hành tăng nồng độ alginat lên 3% - 4% (F6-8) giải phóng hoạt chất có cải thiện khơng đạt hiệu Các CT chứa CMC cho thấy khả giải phóng hoạt chất cao so với CT chứa carbomer 974P Điều có khả đặc tính hút nước trương nở tốt Na CMC Khi tăng nồng độ Na CMC từ 0,25 đến 0,5%, lượng hoạt chất giải phóng tăng theo Với nồng độ 0,75%, giải phóng hoạt chất chậm dần chưa đạt hiệu Việc tăng nồng độ lên 1% dẫn đến độ nhớt dịch tăng lên, tương tự carbomer 974P, làm giảm khả rót dạng bào chế, khơng tối ưu Lượng calci có ảnh hưởng đến giải phóng hoạt chất Đối với CT chứa carbomer, nồng độ calci tăng, giải phóng hoạt chất giảm Trong đó, với CT chứa Na CMC 0,5%, lượng calci tăng cao, q trình giải phóng tăng nhanh Điều có khả tương tác calci CMC tăng mạnh nồng độ cao, dẫn đến hình thành tủa (Ca CMC), làm phá vỡ liên kết khối gel CT xây dựng với phối hợp carbomer CMC, kiểm soát với tổng mức nồng độ polymer thứ cấp ≤ 0,5% nhằm đảm bảo khả rót Sự phối hợp với mong muốn kết hợp đặc tính loại polymer, cho CT giải phóng tối ưu Với CT F12, giải phóng hoạt chất phù hợp với mơ hình động học Higuchi với số R2 = 0,9699 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 75 4.2 Về quy trình định lượng đồng thời q-VALUE Các chế phẩm dùng đường uống dạng đa liều thường bổ sung lượng chất bảo quản nhằm trì đặc tính lý hóa sản phẩm hoạt chất Việc định lượng chất bảo quản cần thiết, nhằm đảm bảo chất bảo quản khơng bị thất q trình sản xuất, đóng gói, lưu hành dạng thuốc, trì chất lượng sản phẩm Phương pháp định lượng UV-Vis phương pháp đơn giản, tốn kém, cho kết nhanh chóng Vì vậy, nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời FUR hỗn hợp chất bảo quản UV-Vis với phương pháp Qvalue Quy trình xây dựng thẩm định theo tiêu chuẩn ICH 4.3 Xây dựng quy trình bào chế Quy trình bào chế xây dựng dựa CT tối ưu lựa chon Trong trình bào chế, cần kiểm sốt thơng số: - pH: pH đóng vai trị q trình gel hóa hịa tan hoạt chất Trong quy trình, trước trộn dd Ca-CTP, cần điều chỉnh pH > 7,0, nhằm giảm thiểu gel hóa tiếp xúc với alginat Trong thực nghiệm nghiên cứu, gel hóa xảy khơng có điều chỉnh pH giai đoạn này, Sau tạo hoàn chỉnh dd polymer, pH cần kiểm soát khoảng 8,0-9,0, nhằm đảm bảo trình phối hợp dd hoạt chất khơng xảy tủa hoạt chất, hịa tan FUR bị ảnh hưởng nhiều pH - Nhiệt độ: theo tài liệu tổng hợp, alginat bị phân hủy phần giảm độ nhớt tiếp xúc với nhiệt độ 60 oC; tương tự Na CMC với nhiệt độ 50 oC thời gian tiếp xúc 20 phút Vì vậy, giai đoạn phân tán, hịa tan alginat kiểm sốt giới hạn nhiệt độ 50-60 oC Khi tiến hành trộn với hỗn hợp polymer thứ cấp, nhiệt độ dd hạ xuống 40-45 oC Sự giảm nhiệt độ đồng thời dẫn đến độ nhớt dd polymer tăng, ion calci tự (nếu có) linh động hơn, giảm thiểu khả tương tác tạo gel Các thành phần khác khuấy trộn nhiệt độ phịng, đó, NaHCO3 báo cáo bền dd với nhiệt độ cao - Thời gian khuấy tốc độ khuấy: yếu tố ảnh hưởng đến đồng chế phẩm Trong trình khuấy trộn tạo gel in situ, thời gian khuấy tốc Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 76 độ khuấy xác định cảm quan: dd có đồng nhất, khơng có khối gel vón Khi khuấy trộn dd hoạt chất polymer, tốc độ khuấy nhanh làm xuất bọt (do có diện Tween 80 tính nhũ hóa polymer), ảnh hưởng đến cấu trúc gel Ngoài ra, khuấy trộn mạnh làm NaHCO3 bền Với giai đoạn trộn hoàn tất, thông số xác định cách đánh giá độ đồng hàm lượng FUR với mẫu khảo sát lấy từ vị trị khác cốc, đạt đồng sau 40 phút với RSD ≤ 2% Nghiên cứu tiến hành nâng quy mô 2500 mL nhằm đánh giá tính lặp lại quy trình bào chế điều kiện sở cho phép Kết đánh giá thành phẩm với tiêu chuẩn xây dựng đạt giới hạn quy định, với độ lặp lại có ý nghĩa Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 KẾT LUẬN VẦ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng dạng bào chế cải tiến FUR đường uống, giúp cải thiện đặc tính sinh khả dụng, đồng thời trì tác dụng lợi tiểu lâu dài ổn định, đề xuất việc giảm số lần dùng thuốc cho bệnh nhân, có triển vọng ứng dụng vào thực tiễn Cụ thể: - Xây dựng công thức (CT) quy trình bào chế gel in situ chứa furosemid quy mô 50 mL + Cải thiện độ tan FUR môi trường acid cách kết hợp Tween 80 : PG (1:1) tỉ lệ sử dụng 0,5:1 so với FUR, đạt 56,9 µg/mL + So sánh, đánh giá khả tạo phức số muối calci, citrat Phối hợp sử dụng citrat EDTA giới hạn an toàn cho kết tối ưu + CT tiềm với phối hợp tá dược tạo gel bao gồm: Na alginat 2%, carbomer 974P 0,35%, natri CMC 0,15% tá dược tạo khí NaHCO3 1% + Đề số thơng số kiểm sốt quy trình - Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm nghiên cứu + Xây dựng tiêu chuẩn cần thiết để đánh giá sản phẩm nghiên cứu + Xây dựng thẩm định quy trình định lượng hoạt chất chất bảo quản phương pháp UV-Vis, HPLC - Nâng cỡ lô qui mô 2500 mL cho kết lặp lại - Đánh giá sơ độ ổn định sản phẩm thời gian tháng điều kiện dài hạn cấp tốc, sản phẩm ổn định khoảng thời gian khảo sát Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 78 KIẾN NGHỊ Trong thời gian điều kiện giới hạn thực nghiên cứu, tồn số vấn đề chưa giải Đề tài có kiến nghị sau: - Nâng quy mơ cỡ lô lớn - Tiếp tục theo dõi độ ổn định, xác định hạn sử dụng điều kiện bảo quản phù hợp cho sản phẩm - Đánh giá in vivo nhằm theo dõi khả lưu trữ dạng thuốc điều kiện sinh lý So sánh SKD so với dạng bào chế có sẵn thị trường - Đánh giá khả phân liều bao bì - Xác định hiệu lực chất bảo quản thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Ambrosy AP, Fonarow GC, Butler J, et al The global health and economic burden of hospitalizations for heart failure: lessons learned from hospitalized heart failure registries Journal of the American College of Cardiology 2014;63(12):1123-1133 Atherton JJ, Bauersachs J, Carerj S, et al ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure Eur J Heart Fail 2016;18:891-975 Dokainish H, Teo K, Zhu J, et al Heart failure in Africa, Asia, the Middle East and South America: the INTER-CHF study International Journal of Cardiology 2016;204:133-141 Friedman EA, Peter K Diuretics and Heart Failure https://emedicine.medscape.com/article/2145340-overview Khan T, Patel R, Siddiqui A Furosemide StatPearls [Internet] Treasure Island(FL):StatPearls Publishing https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK499921 National Center for Biotechnology Information PubChem Database https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Furosemide Granero G, Longhi M, Mora M, et al Biowaiver monographs for immediate release solid oral dosage forms: Furosemide Journal of pharmaceutical sciences 2009;99(6):2544-2556 Florey K Analytical Profiles of Drug Substances Elsevier; 1989:156- 193:chap Furosemide Matsuda Y, Tatsumi E Physicochemical characterization of furosemide modifications International journal of pharmaceutics 1990;60(1):11-26 10 Garnero C, Chattah AK, Longhi M Stability of furosemide polymorphs and the effects of complex formation with β-cyclodextrin and maltodextrin Carbohydrate polymers Nov 2016;.152:598-604 doi:10.1016/j.carbpol.2016.07.006 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 11 M JRA, A B, S CB, M CGÁC Analytical Techniques for Furosemid Determination Separation & Purification Reviews 2006;35(2):39-58 12 Bundgaard H, Nørgaard T, Nielsen NM Photodegradation and hydrolysis of furosemide and furosemide esters in aqueous solutions International journal of pharmaceutics 1988;42(1-3):217-224 13 Neil J, Fell A, Smith G Evaluation of the stability of frusemide in intravenous infusions by reversed-phase high-performance liquid chromatography International journal of pharmaceutics 1984;22(1):105-126 14 Yahya A, McElnay J, D'Arcy P Photodegradation of frusemide during storage in burette administration sets International journal of pharmaceutics 1986;31(1-2):65-68 15 Cruz JE, Maness DD, Yakatan GJ Kinetics and mechanism of hydrolysis of furosemide International Journal of Pharmaceutics 1979;2(5-6):275-281 16 Andreasen F, Botker H, Lorentzen K In vitro studies on the hydrolysis of frusemide in gastrointestinal juices British journal of clinical pharmacology 1982;14(2):306-309 17 Katsura S, Yamada N, Nakashima A, et al Investigation of Discoloration of Furosemide Tablets in a Light-Shielded Environment Chemical Pharmaceutical Bulletin 2017;65(4):373-380 18 Melane BB Thermal and photostability studies of furosemide and its cyclodextrin mixtures Rhodes University; 2002 http://hdl.handle.net/10962/d1007625 19 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam V NXB Y học Hà Nội; 2017:425-428 20 Commission BP British Pharmacopoeia 2020 Edition London; 2019 21 Szasz G, Budvari-Barany Z Pharmaceutical Chemistry of Antihypertensive Agents vol CRC Press; 1991 22 United States Pharmacopeia USP Monographs, Furosemide: USP-NF Rockville, MD: United States Pharmacopeia; 2021 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 23 Bộ Y tế Dược thư quốc gia Việt Nam Hà Nội: NXB Y học; 2012 p 1545– 1551 24 Cơ quan Quản lý Dược Cơ sở liệu dược Quốc gia Drug Bank https://drugbank.vn/tim-kiem?search=furosemid&entity=hoatChat 25 Williams HD, Trevaskis NL, Charman SA, et al Strategies to Address Low Drug Solubility in Discovery and Development Pharmacological Reviews 2013;65(1):315-499 doi:10.1124/pr.112.005660 26 Rosen Y, Gurman P, Elman N Drug Delivery: An Integrated Clinical and Engineering Approach CRC Press; 2019 27 Schneider F, Koziolek M, Weitschies W In vitro and in vivo test methods for the evaluation of gastroretentive dosage forms Pharmaceutics 2019;11(8):416 28 Trung tâm phát triển chương trình tư vấn nhân lực y tế Sinh lý https://yhoctructuyen.com/sinhly/lesson/11_Tieuhoa/07_11_Tieuhoa.html 29 Homayun B, Lin X, Choi H-J Challenges and recent progress in oral drug delivery systems for biopharmaceuticals Pharmaceutics 2019;11(3):129 30 Waterman KC A critical review of gastric retentive controlled drug delivery Pharmaceutical development technology 2007;12(1):1-10 31 Bashir R, Majeed A, Ali T, Farooq S, Khan NA Floating oral in-situ gel: a review Journal of Drug Delivery and Therapeutics 2019;9(2):442-448 32 Alhamdany A, Maraie NK, Msheimsh B Development and in vitro/in vivo evaluation of floating in situ gelling oral liquid extended release formulation of furosemide UK J Pharm Biosci 2014;2:1-11 33 Kavitha K, Nachiya JDR Formulation and Evaluation of Furosemide Tablets as Gastroretentive Dosage Forms Using Various Polymers International Journal of Science and Research 2019;8(4)doi:10.21275/ART20196616 34 Karkhile VG, Karmarkar R, Sontakke MA, Badgujar SD, Nemade LS Formulation and evaluation of floating tablets of furosemide International Journal of Pharma Research and Development 2009;1(12):1-9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 Ozdemir N, Ordu S, Ozkan Y Studies of floating dosage forms of furosemide: in vitro and in vivo evaluations of bilayer tablet formulations Drug Dev Ind Pharm Aug 2000;26(8):857-66 doi:10.1081/ddc-100101309 36 Sheskey PJ, Cook WG, Cable CG Handbook of pharmaceutical excipients Pharmaceutical Press; 2017 37 Casaburi A, Rojo ÚM, Cerrutti P, Vázquez A, Foresti ML Carboxymethyl cellulose with tailored degree of substitution obtained from bacterial cellulose Food Hydrocolloids 2018;75:147-156 38 Lopez CG, Colby RH, Cabral JoT Electrostatic and hydrophobic interactions in NaCMC aqueous solutions: Effect of degree of substitution Macromolecules 2018;51(8):3165-3175 39 Trevisol T, Fritz A, de Souza S, Bierhalz A, Valle J Alginate and carboxymethyl cellulose in monolayer and bilayer films as wound dressings: Effect of the polymer ratio Journal of Applied Polymer Science 2019;136(3):46941 doi:10.1002/app.46941 40 Hu Y, Hu S, Zhang S, et al A double-layer hydrogel based on alginate- carboxymethyl cellulose and synthetic polymer as sustained drug delivery system Scientific reports 2021;11(1):1-14 doi:10.1038/s41598-021-88503-1 41 Brady J, Dürig T, Lee P, Li J-X Polymer properties and characterization Developing solid oral dosage forms Elsevier; 2017:181-223 42 Thái H Vật liệu Polyme blend Khoa học Tự nhiên Công nghệ; 2011:245 43 Kontoghiorghes GJ Advances on Chelation and Chelator Metal Complexes in Medicine Int J Mol Sci Apr 2020;21(7)doi:10.3390/ijms21072499 44 Zeiler N, Silva LMd, Romain E, Schäfer D Effective chelation with citrates and gluconates HPC Today 2020; 45 Q2B I Validation of Analytical Procedures: Methodology, adopted in 1996, Geneva Q2B, incorporated in Q2 (R1) 2005; 46 United States Pharmacopeia Reagents, Buffer Solutions: USP-NF Rockville, MD: United States Pharmacopeia; 2022 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 47 Sugiyanto S, Yuswanto Y, Martein R Uji kelarutan untuk seleksi fase minyak, surfaktan dan kosurfaktan dalam preparasi self-nano emulsifying drug delivery system (snedds) furosemid Jurnal Ilmu Farmasi dan Farmasi Klinik 2017:99-104 doi:10.31942/jiffk.v0i0.1351 48 Williams HD, Trevaskis NL, Charman SA, et al Strategies to address low drug solubility in discovery and development Pharmacological reviews 2013;65(1):315-499 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC Phụ lục - COA nguyên liệu furosemid Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục – COA nguyên liệu Na alginat Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục - COA chuẩn furosemid Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục – COA chuẩn methyl paraben Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục – COA chuẩn propyl paraben Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn