(Luận văn) nghiên cứu sản xuất interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào escherichia coli trong điều kiện gmp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - Nguyễn Thị Minh Thu lu an n va NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP gh tn to DẠNG CẢI BIẾN TRÊN DÒNG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI p ie TRONG ĐIỀU KIỆN GMP d oa nl w Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm nf va an lu Mã số: 60420114 lm ul LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC z at nh oi z NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC @ m co l gm GS TS Trƣơng Nam Hải an Lu Hà Nội, 2015 n va ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn kết khóa luận tơi trực tiếp thực Các số liệu kết đƣợc cơng bố khóa luận hồn tồn trung thực, xác chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên cao học lu an n va p ie gh tn to Nguyễn Thị Minh Thu d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th i Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới GS TS Trƣơng Nam Hải TS Phùng Thu Nguyệt, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn dìu dắt tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu Tiếp đến xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô trƣờng Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái Tài Nguyên sinh vật, thầy, cô Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giảng dạy cho tơi suốt thời gian tham gia lu khóa học an Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể cán nghiên cứu, nhân viên va n phịng Kỹ thuật di truyền - Viện Cơng nghệ sinh học Công ty TNHH Vắc xin tn to Sinh phẩm số 1(VABIOTECH) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam tận tình bảo ie gh động viên cho lời khuyên quý giá công việc nhƣ sống p Và sau cùng, tình cảm chân thành xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia nl w đình bạn bè, ngƣời hết lịng ủng hộ động viên tơi suốt thời d oa gian học tập công tác lu nf va an Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên cao học z at nh oi lm ul z m co l gm @ Nguyễn Thị Minh Thu an Lu n va ac th ii Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ung thƣ Việt Nam giới lu 1.2 Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ an 1.3 Tổng quan Interleukin-2 va n 1.3.1 Cấu trúc Interleukin-2 tn to 1.3.2 Cơ chế hoạt động chức sinh học Interleukin-2 ie gh 1.3.3 Vai trò Interleukin-2 điều trị ung thư .9 p 1.4 Hệ biểu E coli 12 w 1.4.1 Hệ biểu E coli BL21 .13 oa nl 1.4.2 Vector biểu pET22b(+) 14 d 1.4 Lên men sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống lên men Bioreactor .16 lu nf va an 1.4 Tinh protein hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao .17 1.5 Xác định hoạt tính sinh học IL-2 dòng tế bào CTLL2 19 lm ul 1.6 Phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP 20 z at nh oi CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Chủng giống plasmid 22 z 2.1.2 Hóa chất 22 @ gm 2.1.3 Máy móc thiết bị 22 co l 2.1.4 Các môi trường dung dịch 24 m 2.1.4.1 Môi trường sử dụng biểu protein .24 an Lu 2.1.4.2 Dung dịch sử dụng tiền tinh chế protein Interleukin-2 24 2.1.4.3 Dung dịch sử dụng chạy hệ thống sắc ký HPLC 24 n va ac th iii Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si 2.1.4.4 Dung dịch sử dụng điện di SDS - PAGE 24 2.1.4.5 Dung dịch sử dụng để kết điện di SDS – PAGE 25 2.1.4.6 Dung dịch sử dụng phản ứng Western blot 26 2.1.4.7 Dung dịch sử dụng phương pháp ELISA 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Biểu protein Interleukin-2 tái tổ hợp tế bào E coli hệ thống lên men 10 lít .27 2.2.2 Phá tế bào E coli xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế) 27 2.2.3 Tinh chế IL-2 sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 28 2.2.4 Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 dòng tế bào CTLL2 29 lu an 2.2.5 Kiểm tra tính đặc hiệu protein phương pháp Western blot 32 n va 2.2.6 Kiểm tra độ phần mềm Quantity One 33 tn to 2.2.7 Kiểm tra nội độc tố LAL kit 33 gh 2.2.8 Xác định hàm lượng protein mẫu tinh chế phương pháp ELISA 34 p ie 2.2.9 Điện di SDS-PAGE 35 w CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 oa nl 3.1 Tối ƣu lên men chủng E coli BL21 IL-2 quy mơ nồi lên men 10 lít 38 d 3.1.1 Lên men chủng E coli BL21-IL2 hệ thống lên men lít .38 an lu 3.1.2 Khảo sát thành phần dinh dưỡng nồng độ chất cảm ứng 39 nf va 3.1.3 Lên men chủng E coli BL21-IL2 quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt .42 lm ul 3.1.4 Lên men chủng E coli BL21-IL2 hệ thống lên men 10 lít đợt 46 3.2 Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men .49 z at nh oi 3.3 Tinh chế IL-2 sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .50 3.4 Xác định hoạt tính sinh học IL-2 dịng tế bào CTLL2 53 z 3.5 Xác định độ tinh protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằngphần mềm @ gm Quantity One .55 l 3.6 Xác định hàm lƣợng nội độc tố sản phẩm IL-2 sau tinh chế 57 m co KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 an Lu TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN .65 n va ac th iv Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si PHỤ LỤC 66 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Ampicillin Ammoniumpersulfate AU Absorbance unit BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanhbò) CSE Control standard endotoxin (Nội độc tốchuẩn) CTL Cytoxic T lymphocyte (Tế bào gây độc) dH2O Distilled water (nƣớc khử trùng) DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleicacid dOT Dissolved oxygene tension E coli Escherichia coli ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (Kĩ thuật chất hấp phụ ie miễn dịch gắnenzym) Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) HIV Human Immunodeficiency Virus gh tn to Amp APS FBS p w Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside oa nl IPTG IL-2R Interleukin-2 Receptor (Thụ thể củaIL-2) d KiloDalton an lu kDa Limulus AmebocyteLysate MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium PBS PVDF Phosphate Bromide bufferedsaline PolyvinylidineDifloride PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2 (IL-2 ngƣời tái tổhợp) SDS Sodium dodecylsulfate SDS –PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gelelectrophoresis TBS Tris buffersaline TEMED N, N, N’, N’ – TetramethylEthylenediamin TFA Trifluoroacetic acid TMB Tetramethylbenzidine nf va LAL z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th v Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si TTBS VABIOTECH TweenTris buffer saline Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin Sinh phẩm số DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ Hình 2: Cấu trúc không gian Interleukin-2 Hình 3: Sự kích thích tăng sinh biệt hóa Interleukin-2 lên tế bào T [38] Hình 4: Cơ chế hoạt động Interleukin-2 .9 Hình 5: Sự phát triển tế bào ung thƣ biểu mơ thận 10 Hình 6: Ung thƣ hắc tố ác tính 11 Hình 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ 15 lu an Hình 8: Cơ chế kiểm soát biểu gene nhờ chất cảm ứng IPTG 16 n va Hình 9: Lên men hệ thống Bioreactor phòng đạt tiêu chuẩn GMP 17 tn to Hình 10: Hệ thống tinh protein HPLC 18 Hình 1: Sự biểu protein IL-2 tái tổ hợp hệ thống lên men lít .38 gh p ie Hình 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dƣỡng nồng độ IPTG trình lên men 42 nl w Hình 3: Đƣờng cong sinh trƣởng chủng tái tổ hợp E coli BL21-IL2 đợt .43 d oa Hình 4: Điện di Protein tổng số biểu chủng E coli BL21-IL2 hệ an lu thống lên men 10 lít đợt 45 nf va Hình 5: Đƣờng cong sinh trƣởng chủng tái tổ hợp E coli BL21-IL2 đợt .47 Hình 6: Điện di Protein tổng số biểu chủng E coli BL21-IL2 hệ lm ul thống lên men 10 lít đợt 48 z at nh oi Hình 7: Kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế đợt lên men hệ thống 10 lít 49 Hình 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 hệ thống HPLC .51 z Hình 9: Kết kiểm tra protein IL-2 sau tinh hệ thống HPLC 52 gm @ Hình 10: Biểu đồ thể kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 mẫu IL-2 l tái tổ hợp 53 co Hình 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng mẫu IL-2 55 m Hình 12: Kiểm tra độ tinh protein IL-2 Quantity One .56 an Lu Hình 13: Kết độ tinh IL-2 xác định phần mềm Quantity One 56 n va ac th vi Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si Hình 14: Hình ảnh kết sau dừng phản ứng đông gel 57 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Giá trị OD mẫu thu đƣợc sau trình lên men 40 Bảng 2: Giá trị EC50 hoạt tính riêng mẫu IL-2 .54 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th vii Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si MỞ ĐẦU Sức khỏe cộng đồng ung thƣ vấn đề ngày đƣợc quan tâmở hầu hết quốc gia giới Trong đó, ung thƣ nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho ngƣời bệnh có xu hƣớng ngày gia tăng Theo ghi nhận tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc phát 8,2 triệu ngƣời chết ung thƣ Ƣớc tính tới năm 2030, năm có thêm 25 triệu ca mắc bệnh Tại Việt Nam, theo thống kê Bộ Y tế, năm 2010 số ca mắc ung thƣ tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ 190.000 ca Nguyên nhân gây ung thƣ mơi trƣờng lu bên ngồi với chế độ sinh hoạt ngày chiếm tới 90% an Hiện phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn va n phƣơng pháp phổ biến điều trị ung thƣ giới Tuy nhiên, chúng tn to số nhƣợc điểm nhƣ gây tổn thƣơng cho tế bào lành, ảnh ie gh hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh Ngoài phƣơng pháp điều trị p liệu pháp miễn dịch phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu cao Liệu w pháp tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả phát triển nhanh chóng oa nl khối u không làm tổn thƣơng tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả d miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ nâng cao chất lƣợng sống Do đó,liệu lu nf va an pháp miễn dịch đƣợc coi liệu pháp xanh có hiệu điều trị rõ rệt, khơng có tác dụng phụ, an toàn dung nạp tốt, mở hình thức điều trị hồn tồn lm ul cho bệnh nhân ung thƣ z at nh oi Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm nhận biết tiêu diệt tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) cytokineđƣợc tiết tế bào lympho T đóng vai trị quan trọng đáp ứng miễn z dịch thể Cytokine tham gia vào q trình kích thích hệ thống miễn dịch @ gm sản sinh dòng tế bào T, đồng thời kích thích tăng sinh biệt hóa dịng co l tế bào NK đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả miễn dịch thể IL- m đƣợc sử dụng điều trị hiệu hai loại ung thƣ biểu mơ thận ung thƣ da an Lu Ngồi ra, IL-2 đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ n va ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… có khả kích hoạt hệ thống miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp điều trị ung thƣ Hiện nay, chế phẩm IL-2 với tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đƣợc sản xuất hãng Chiron thƣơng mại hóa tồn giới, nhiên giá thành Proleukin® cịn cao (khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg) Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng sản phẩm protein tái tổ hợp điều trị nói chung cịn bị bỏ ngỏ chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn tồn từ q trình nghiên cứu đến q trình sản xuất Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp lu an nƣớc giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị n va bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất IL-2 tái gh tn to tổ hợp chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm cần thiết Trong trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid p ie IL-2 đƣợc cải biến nhằm tạo đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự w giống với sản phẩm Proleukin đƣợc FDA công nhận Ngồi ra, việc cải biến trình oa nl tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính tăng tính an tồn cho sản phẩm Sản phẩm d Proleukin cịn có tên hóa học desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng an lu ứng đột biến alanine vị trí amino acid số 1, thay cysteine vị trí 125 nf va serine Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mơ phịng thí lm ul nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, tiến hành tối ƣu biểu protein IL-2 hệ thống lên men 10 lít Viện Công nghệ sinh học z at nh oi cơng ty VABIOTECH Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý tinh chế phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh z chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học kiểm tra số tiêu độ @ gm độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu sản phẩm tái tổ hợp sử dụng điều l trị ngƣời với giá thành thấp thƣơng phẩm Proleukin m co Trên sở chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất an Lu Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến dòng tế bào Escherichia coli điều kiện GMP” Đề tài đƣợc thực Công ty Vacxin Sinh phẩm số n va ac th Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si tạo mẫu IL-2 chuẩn (Roche) có khả hoạt hóa trì sống cho tế bào CTLL2 Giá trị R2 mẫu đạt từ 0,95 đến 0,99, chứng tỏ thí nghiệm xác định hoạt tính có độ chuẩn xác cao Mẫu thí nghiệm S1 (phân đoạn 32) S2 (phân đoạn 33) có số EC50 gần tƣơng đƣơng nhau, lần lƣợt đạt 0,4987 0,4367.Trong đó, mẫu IL-2 chuẩn hãng Roche có EC50 cao hai mẫu thí nghiệm đạt 0,6352 Nhƣ vậy, hai mẫu IL2 tái tổ hợpcó hoạt tính sinh học cao mẫu IL-2 chuẩn Roche(do EC50 thấp hoạt tính sinh học cao) Sau quy đổi đơn vị hoạt tính sinh họcriêng theo chuẩn quốc tế (cơng thức quy đổi đƣợc trình bày phần phƣơng pháp), kết quy đổi đƣợc thống kê Bảng 3.2 Các mẫu IL-2 tái tổ hợp Việt Nam tạo có hoạt tính sinh học riêng lu an tƣơng đối tốt S1 (13,19 x 106 IU/mg) S2 (14,19 x 106 IU/mg) Mẫu IL-2 n va Roche có hoạt tính riêng thấp đạt 10,36 x 106 IU/mg tn to Bảng 2: Giá trị EC50 hoạt tính riêng mẫu IL-2 Tên mẫu Hoạt tính riêng Hoạt tính riêng Giá trị (U/mg) (IU/mg) R2 0.4987 2.00 x 106 13.19 x 106 0.95 0.4637 2.15 x 106 14.19 x 106 0.99 nf va ie gh Giá trị 1.57 x 106 10.36 x 106 0.99 1,3 x 105 8,90 x 105 - 16.36 x 106 - p EC50 nl w (ng/mL) d oa rhIL2-desAlaS1 IL-2 chuẩn (Roche) hãng công bố) 7.4 - z at nh oi Proleukin (hoạt tính 0.6352 lm ul rhIL2 an lu rhIL2-desAlaS2 - z @ gm Sản phẩm protein IL-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến(ký hiệu rhIL2-desAla) l có trình tự axit amin hồn tồn giống với sản phẩm Proleukin Hoa Kỳ Khi so m co sánh với sản phẩm IL-2 pha nghiên cứu trƣớc thuộc đề tài nghiên cứu cấp nhà nƣớc an Lu KC.04.21/06-10 (ký hiệu rhIL2), trình tự axit amin sản phẩm khác (ít hơn) axit amin Alanine đầu N phân tử, nhiên hoạt tính sản n va ac th 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si phẩm (14,19 x 106) cao gấp khoảng 14 lần so với sản phẩm đề tài KC.04.21/06-10 (0,89 x 106) (Hình 3.11) Bên cạnh đó, so sánh với IL-2 chuẩn hãng Roche sản phẩm thƣơng mại Proleukin, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Việt Nam có hoạt tính sinh học riêng tƣơng đƣơng với IL-2 chuẩn hãng Roche gần sản phẩm thƣơng mại Proleukin (16,36 x 106 IU/mg)[12][51], tất đƣợc thể Hình3.11 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu Hình 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng mẫu IL-2 lm ul 3.5 Xác định độ tinh sạchcủa protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế phần z at nh oi mềm Quantity One Phần mềm Quantity One BioRad phần mềm thông dụng đƣợc sử z dụng nhiều giới để xác định độ đậm nhạt băng protein điện di @ gm đồ Để xác định đƣợc xác độ tinh khiết protein IL-2, sử dụng l ảnh điện di gel polyacrylamide kỹ thuật SDS – PAGE nhuộm Coomassie m co xử lý phần mềm chuyên dụng Quantity One Cách thao tác phần mềm 3.12 an Lu nhƣ trình bày phần phƣơng pháp Kết thu đƣợc thể Hình n va ac th 55 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si lu an va n Hình 12:Kiểm tra độ tinh protein IL-2 QuantityOne tn to Hình3.12cho thấy xuất đỉnh hấp phụ tƣơng ứng với vị trí ie gh băng protein gel điện di Mẫu IL-2 sau tinh chế quét phát p băng ứng với băng protein IL-2 chứng tỏ mẫu có độ cao d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z gm @ co l Hình 13: Kết độ tinh sạchcủa IL-2 xác định phần mềm Quantity One m Từ kết phần mềm đƣa cho thấy, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp có độ an Lu 99,3% Nhƣ IL-2 sau tinh chế đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết cho sản phẩmdạng n va ac th 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si thuốc tiêm truyền tĩnh mạch theo quan quản lý Dƣợc phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) 3.6 Xác định hàm lƣợng nội độc tố sản phẩm IL-2 sau tinh chế Để kiểm tra tính an tồn sản phẩm IL-2 tiến hành xác định hàm lƣợng nội độc tố mẫu protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế LAL kit Để tăng độ tin cậy cho phép thử tiến hành lặp lại lần kết thu đƣợc thể Hình 3.14 lu an n va p ie gh tn to w oa nl Hình 14: Hình ảnh kết sau dừng phản ứng đơng gel d Độ nhạy dung dịch LAL đƣợc cung cấp 0,25 EU/ml, có nghĩa với lu nf va an mẫu có nồng độ nội độc tố lớn 0,25 EU/ml cho kết dƣơng tính (tạo gel) Ở mẫu đối chứng dƣơng (nội độc tố chuẩn CSE + LAL), sau ủ lm ul 37ºC cho kết dƣơng tính, dịch ống eppendorf chuyển sang z at nh oi trạng thái gel dốc ngƣợc 180º đọng lại đáy ống thể rõ ràng Hình 3.14 Ở mẫu đối chứng âm (dH20 công ty VABIOTECH + LAL) mẫu cần kiểm tra nội độc tố (sản phẩm IL-2 sau tinh chế + LAL) cho kết âm z @ tính, saukhi dừng phản ứng toàn dịch trạng thái lỏng dốc ngƣợc l gm 180º chảy hồn toàn xuống miệng ống, chứng tỏ dịch IL-2 sau tinh chế có nồng độ nội độc tố nhỏ 0,25 EU/ml Cả lần thí nghiệm cho kết nhƣ co m cho thấy tính ổn định nhƣ đảm bảo xác mẫu protein thu đƣợc đáp ứng an Lu tiêu chuẩn sản phẩm tiêm nồng độ nội độc tố không 0,5 EU/ml n va ac th 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau trình thực đề tài, chúng tơi hồn thiện đƣợc quy trình sản xuất protein IL-2, đáp ứng đƣợc yêu cầu chất lƣợng điều kiện phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP Công ty VABIOTECH.Một số kết cụ thể nhƣ sau: Đ ã biểu thành công protein IL-2 tái tổ hợp dạng cải biếntrong hệ thống lên men 10 lít,với điều kiện nhiệt độ 47°C, bổ sung hai lần dinh dƣỡng (glucose 1% cao nấm men 0,5%), cảm ứng IPTG 0,1 mM thu mẫu sau cảm lu an ứng Hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau trình lên men đạt 0,86 mg/ml n va Đ ký HPLC với hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau trình tinh chế đạt 0,667 mg/ml p ie gh tn to ã tinh chế thành công sản phẩm IL-2 cột bán điều chế hệ thống sắc w Đ oa nl ã xác định đƣợc hoạt tính sinh học sản phẩm IL-2 đạt 14,19 x 106 IU/mg d Đ an lu ã xác định đƣợc độ sản phẩm IL-2 99,3% đánh giá đƣợc hàm nf va lƣợng nội độc tố IL-2 nhỏ 0,25 EU/ml, đáp ứng tiêu chuẩn độ z at nh oi lm ul độ an toàn sản phẩm tiêm sử dụng điều trị ung thƣ Kiến nghị Từ kết đạt đƣợc xin đƣa số kiến nghị sau: z X @ gm ây dựng công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 dạng thƣơng phẩm l K an Lu chuột thỏ m co iểm tra tiêu chí an toàn sản phẩm IL-2 tế bào động vật nhƣ n va ac th 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Anh LTL, Anh LPH, Khoa ĐT, Hong LTT, Nguyet PT, Thuy ĐT, Chien LA, & Hai TN (2013) "Nghiên cứu tối ƣu biểu gen mã hóa Interleukin-2 Escherichia coli.", pp.19–23 Đặng Trần Hoàng, Đức, V M., Phùng Thu Nguyệt, & Trƣơng Nam Hải (2005) "Biểu gen Interleukin-2 ngƣời bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc cystein 125 Escherichia coli", 3(2), pp.149–154 lu Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, & Trƣơng Nam an va Hải (2007) "Xác định hoạt tính sinh học interleukin-2 tái tổ hợp phép thử n sinh học tế bào CTLL2", 5(2), pp.157–161 tn to Tiếng Anh gh p ie Asgarpanah J (2010) "Bioassay Methods useful to select the natural product cancer nl w 71 chemopreventive agents" Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 0(0), pp.71– d oa Bhagwat A S., Sohail A., & Roberts R J (1986) "Cloning and characterization of nf va 755 an lu the dcm locus of Escherichia coli K-12." Journal of Bacteriology, 166(3), pp.751– Boyman O., & Sprent J (2012) "The role of interleukin-2 during homeostasis and lm ul activation of the immune system" Nature Reviews Immunology, 12(3), pp.180– z at nh oi 190 Caligiuri M A., Murray C., Robertson M J., Wang E., Cochran K., Cameron C., Schow P., Ross M E., Klumpp T R., & Soiffer R J (1993) "Selective modulation z gm @ of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant interleukin 2" The Journal of Clinical Investigation, 91(1), pp.123– co l 132 m Chu M B., Fesler M J., Armbrecht E S., Fosko S W., Hsueh E., Richart J M., an Lu Chu M B., Fesler M J., Armbrecht E S., Fosko S W., Hsueh E., & Richart J M ac th 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn n va (2013) "High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for si Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases, High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases" Chemotherapy Research and Practice, Chemotherapy Research and Practice, 2013, 2013, pp.e726925 Cockshott A R., & Bogle I D L (1999) "Modelling the effects of glucose feeding on a recombinant E coli fermentation" Bioprocess Engineering, 20(1), pp.83–90 10 Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J., Remaut E., & Fiers W (1983) "Molecular cloning of human interleukin cDNA and its expression in E coli" Nucleic Acids Research, 11(13), pp.4307–4323 11 Eckenberg, R., Moreau, J.L., Melnyk, O., & Thèze, J (2000) "IL-2R beta agonist lu an P1-30 acts in synergy with IL-2, IL-4, IL-9, and IL-15: biological and molecular va effects.", 1950(165), pp.4312–4318 n tn to 12 Eton O., Rosenblum M G., Legha S S., Zhang W., Jo East M., Bedikian A., gh Papadopoulos N., Buzaid A., & Benjamin R S (2002) "Phase I trial of p ie subcutaneous recombinant human interleukin-2 in patients with metastatic w melanoma" Cancer, 95(1), pp.127–134 oa nl 13 Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D d M., Forman D., & Bray F (2013) "Cancer incidence and mortality worldwide: lu an Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012: Globocan 2012" nf va International Journal of Cancer, 136(5), pp.E359–E386 lm ul 14 Ferlay, J., Shin, H.-R., Bray F, Forman, D., Mathers, C., & Parkin, D.M (2010) "Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008", 127, z at nh oi pp.2893–2917 15 Francis D M., & Page R (2010) "Strategies to optimize protein expression in E z coli" Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E Coligan [et gm @ Al.], Chapter 5, pp.Unit 5.24.1–29 and clinical applications" Cytokine, 28(3), pp.109–123 m co l 16 Gaffen S L., & Liu K D (2004) "Overview of interleukin-2 function, production an Lu n va ac th 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si 17 Grodberg J., & Dunn J J (1988) "ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification" Journal of Bacteriology, 170(3), pp.1245–1253 18 Haacke A., Fendrich G., Ramage P., & Geiser M (2009) "Chaperone overexpression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates" Protein Expression and Purification, 64(2), pp.185–193 19 Hammerling U., Henningsson A C., & Sjödin L (1992) "Development and validation of a bioassay for interleukin-2" Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 10(8), pp.547–553 lu an 20 Janice P Dutcher (2002, November 1) "Current Status of Interleukin-2 Therapy va for Metastatic Renal Cell Carcinoma and Metastatic Melanoma: Page of | n tn to Cancer Network" gh 21 Ju G., Collins L., Kaffka K L., Tsien W H., Chizzonite R., Crowl R., Bhatt R., & p ie Kilian P L (1987) "Structure-function analysis of human interleukin-2 w Identification of amino acid residues required for biological activity" The Journal oa nl of Biological Chemistry, 262(12), pp.5723–5731 d 22 Keilholz U., Conradt C., Legha S S., Khayat D., Scheibenbogen C., Thatcher N., lu an Goey S H., Gore M., Dorval T., Hancock B., Punt C J., Dummer R., Avril M F., nf va Bröcker E B., Benhammouda A., Eggermont A M., & Pritsch M (1998) "Results lm ul of interleukin-2-based treatment in advanced melanoma: a case record-based analysis of 631 patients" Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the z at nh oi American Society of Clinical Oncology, 16(9), pp.2921–2929 23 Kush Sachdeva, Brendan Curti, & Bagi RP Jana (2015) "Renal Cell Carcinoma: z Practice Essentials, Background, Pathophysiology" @ gm 24 Liang S M., Thatcher D R., Liang C M., & Allet B (1986) "Studies of structure- m co 261(1), pp.334–337 l activity relationships of human interleukin-2" The Journal of Biological Chemistry, an Lu n va ac th 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si 25 Losen M., Frölich B., Pohl M., & Büchs J (2004) "Effect of oxygen limitation and medium composition on Escherichia coli fermentation in shake-flask cultures" Biotechnology Progress, 20(4), pp.1062–1068 26 MacWilliams M P., & Bickle T A (1996) "Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene." The EMBO Journal, 15(17), pp.4775–4783 27 Moffatt BA, Dunn JJ, & Studier FW (1984) "Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase", 173(2), pp.265–269 28 Monod J (1949) "The Growth of Bacterial Cultures" Annual Review of Microbiology, 3(1), pp.371–394 lu an 29 Morgan D A., Ruscetti F W., & Gallo R (1976) "Selective in vitro growth of T va lymphocytes from normal human bone marrows" Science (New York, N.Y.), n tn to 193(4257), pp.1007–1008 gh 30 Oona Mcpolin (2009) "Preview - An Introduction to HPLC for Pharmaceutical p ie Analysis - Preview_book_introduction_HPLC.pdf" w 31 Peter Boyle B L (2008) World Cancer Report oa nl 32 R J Robb R M K (1984) "Amino acid sequence and post-translational d modification of human interleukin 2" Proceedings of the National Academy of lu an Sciences of the United States of America, 81(20), pp.6486–90 nf va 33 Roche S (2010, December) Interleukin-2, human (hIL-2) recombinant (E coli) lm ul 34 Rosenberg S A., Yang J C., Topalian S L., Schwartzentruber D J., Weber J S., Parkinson D R., Seipp C A., Einhorn J H., & White D E (1994) "Treatment of z at nh oi 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using highdose bolus interleukin 2" JAMA, 271(12), pp.907–913 z 35 Safar M., & Junghans R P (2000) "Interleukin maintains biologic stability and @ gm sterility over prolonged time" Immunopharmacology, 49(3), pp.419–423 l 36 Schnaitman C A., & Austin E A (1990) "Efficient incorporation of galactose an Lu mutations." Journal of Bacteriology, 172(9), pp.5511–5513 m co into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE n va ac th 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si 37 Sim M., Seok H.-S., & Kim J (2013) "A Next-generation Sequence Clustering Method for E Coli through Proteomics-genomics Data Mapping" Procedia Computer Science, 23, pp.96–101 38 Swinehart D F (1962) "The Beer-Lambert Law" Journal of Chemical Education, 39(7), pp.333 39 Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., & Hamuro J (1992) "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 1983" Biotechnology (Reading, Mass.), 24, pp.304–309 40 Tincati C., d’Arminio Monforte A., & Marchetti G (2009) "Immunological mechanisms of interleukin-2 (IL-2) treatment in HIV/AIDS disease" Current lu an Molecular Pharmacology, 2(1), pp.40–45 va 41 Titov K S., Kiselevskii M V., Demidov L V., Mikhailova I N., Shubina I Z., n tn to Rodionova L M., Sinel’nikov I E., Topol’ K Y., & Gritsai A N (2009) "Use of gh recombinant interleukin-2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy" p ie Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 148(5), pp.794–796 proleukin" oa nl w 42 Ulrik Mouritzen, Christiance Voit (2012) "Neoadjuvant treatment of cancer with d 43 WHO (2004, May 28) 1st Standard for INTERLEUKIN (Human, Jurkat lu an derived) NIBSC code: 86/504 Cell interactions in nf va 44 William Bowers (2001) "CELL-MEDIATED IMMUNITY: lm ul specific immune responses" 45 Yin J., Li G., Ren X., & Herrler G (2007) "Select what you need: a comparative z at nh oi evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes" Journal of Biotechnology, 127(3), pp.335–347 z 46 DrugBank (Ed.) (2013) "Aldesleukin" In DrugBank @ gm 47 "Renal Cell Cancer Treatment" (2015) National Cancer Institute l 48 "Melanoma Treatment" (2015) National Cancer Institute an Lu 50 "Melanoma - Cancer Council Australia" (2015) m co 49 "World Health Organization, World Cancer Report 2014" (2014) SEARO 51 DrugBank (Ed.) (2015, November 28) "Aldesleukin" In DrugBank n va ac th 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si Internet 52 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ 53 http://www.cancer.gov/about-cancer/what-is-cancer 54 http://www.cancerresearch.org/cancer-immunotherapy/ 55 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Canh-giac-voi-benh-ung-thu-than/40127601/248/ 56 http://www.newhealthadvisor.com/Renal-Cell-Carcinoma-Staging.html 57 http://www.melanomacenter.org/basics/statistics.html 58 http://www.atcc.org/products/all/TIB-214.aspx 59 http://www.ispe.org/gmp-resources/what-is-gmp 60 http://www.isovietnam.com.vn/tu-van-quan-ly-doanh-nghiep/dao-tao-tu-van-gdp- lu an gpp/95-tieu-chuan-gmp-glp-gsp-gdp-gpp.html n va 61 http://vesinhantoanthucpham.com.vn/lich-su-hinh-thanh-san-xuat-tot-gmp http://www.vinmec.com/tin-tuc-hoat-dong/so-luoc-tong-quan-tinh-hinh-ung-thu- tn to 62 gh tai-viet-nam-a404.html p ie 63.http://www.nihbt.org.vn/tin-trong-nuoc/sung-sot-vi-benh-nhan-ung-thu-tang- w nhanh/p124i6718.html 1702.html d oa nl 64.http://www.nhandan.com.vn/mobile/_mobile_suckhoe/_mobile_tintucsk/item/2820 an lu 65.http://info.ebioscience.com/bid/78957/What-does-ED50-Mean nf va 66 http://www.cancer.gov/types/skin/hp/skin-genetics-pdq z at nh oi lm ul 67 http://sbc-vietnam.com/Tin-tuc/YEAST-EXTRACT-MUA-O-%C4%90AU.aspx z m co l gm @ an Lu n va ac th 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌCLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Le Phuong Hoang Anh, Dao Trong Khoa, Nguyen Thi Minh Thu, Phung Thu Nguyet, Phan Thi Thanh Huyen, Truong Nam Hai (2015) Purification of recombinant human interleukin-2 National Conference Vietnam Association of Biochemistry 74 Lê Phƣơng Hoàng Anh, Nguyễn Thị Minh Thu, Đào Trọng Khoa, Phùng Thu Nguyệt, Trần Ngọc Tân, Lƣu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Trƣơng Nam Hải lu an (2015) Tinh chế xác định hoạt tính sinh học interleukin-2 ngƣời tái tổ n va hợp dạng cải biến Hội nghị khoa học kỷ niệm 40 năm (1975-2015) thành lập gh tn to Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam 13 ie Nguyễn Thị Minh Thu, Lê Phƣơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Trần Ngọc p Tân, Nguyễn Minh Nga, Lƣu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Phùng Thu Nguyệt, nl w Trƣơng Nam Hải (2015) Nghiên cứu tổng hợp interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp d oa hệ thống lên men 10 (lít) theo tiêu chuẩn GMP Tạp chí Cơng nghệ Sinh nf va an lu học 13(3): 1-10 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si PHỤ LỤC P hụ lục I.Trình tự vector pET22b(+) mang gen il-2 cải biến loại alanine đầu N (ký hiệu pET22_IL-2_desAla) lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si P hụ lục II.Hƣớng dẫn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn si