Bg thuc tap hoa sinh 2 351

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN KHOA DƯỢC  BÀI GIẢNG MƠN HỌC THỰC TẬP HĨA SINH Đơn vị biên soạn: KHOA DƯỢC XÁC NHẬN CỦA BCN KHOA DƯỢC Hậu Giang – Năm 2015 BÀI 1: NHỮNG ĐIỀU CẦN BIẾT KHI LÀM XÉT NGHIỆM HĨA SINH 1.VAI TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM HĨA SINH: Xét nghiệm đóng vai trị quan trọng Y học nghiên cứu thay đổi sinh lý, bệnh lý số hóa sinh thể người, đặc biệt đóng góp vào việc dự phịng, chẩn đốn theo dõi điều trị Ngày phát triển khoa học kỹ thuật áp dụng khoa học xét nghiệm, chẩn đoán giúp cho việc đánh giá kết nhanh, nhạy, xác định lượng nhiều chất có nồng độ thấp (mg, ng) Kết xét nghiệm hóa sinh yếu tố khách quan phản ánh diễn biến bên thể Tuy nhiên kết xét nghiệm hóa sinh cịn ảnh hưởng nhiều yếu tố mơi trường tác động, tình trạng thể biến thiên sinh học (tuổi, giới tính, hoạt động dinh dưỡng,…), diễn biến bệnh lý, tác động phương pháp điều trị (dùng thuốc, truyền dịch ), cách lấy mẫu, bảo quản mẫu, phương pháp xác định, tính kết Do vậy, đánh giá kết xét nghiệm hóa sinh cần phải phân tích, tổng hợp, suy luận sở sinh lý, bệnh lý trình điều trị NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM HĨA SINH: Kết xét nghiệm hóa sinh bị ảnh hưởng yếu tố sau: Di truyền, giống, chủng tộc Tuổi, trọng lượng thể, thói quen, tập tục đời sống, tình trạng xã hội, khí hậu, ví trí địa lý, phụ nữ có thai - Dinh dưỡng, hoạt động thể, nhịp sinh học, yếu tố tâm thần , stress, bệnh tật, thuốc, điều trị - Cách lấy mẫu: Tư thể, vị trí lấy mẫu, thời gian lấy mẫu, mẫu bị tan máu - Kỹ thuật định tính, định lượng CÁCH LẤY MẪU MÁU, NƯỚC TIỂU: Mẫu máu: Tùy theo tính chất sinh học cần xác định mà lấy mẫu huyết thanh, huyết tương hay máu toàn phần: - Huyết thanh: Sau lấy máu cho ống nghiệm khơ nút kín để vào tủ ấm 37 oC để nhiệt độ phịng, ống nghiệm khơng có chất chống đơng Khi máu đông, dùng que thủy tinh nhỏ đầu trịn tách nhẹ phần cục máu đơng khỏi thành ống để huyết chóng tách sau ly tâm gạn hút lấy hết huyết Huyết định lượng cần tránh vỡ hồng cầu - Máu toàn phần huyết tương: Cũng theo cách lấy mẫu máu ống nghiệm cần phải cho chất chống đông Natri citrate, heparin, natrioxalat Liều lượng chất chống đông tùy thuộc vào số ml máu cần lấy Nếu cần lấy huyết tương, cần ly tâm ngay, phần lắng cặn huyết cầu, tách lấy phần huyết tương - Thời gian cho phép bảo quản máu huyết tương, huyết tùy thuộc vào chất định xét nghiệm Ngoài tùy theo chất sinh học cần định tính, định lượng, phải cho thêm chất bảo quản như: Định lượng Glucose máu, phải cho thêm Natri Fluorur để tránh thủy phân glucose 3.2 Nước tiểu: Nước tiểu lấy lần phải xét nghiệm ngay, để thời gian lâu xét nghiệm cần phải bảo quản tủ lạnh (-20oC) chất bảo quản tùy theo yêu cầu kỹ thuật Khi lấy nước tiểu yêu cầu bệnh nhân bỏ nước tiểu đầu - Lấy nước tiểu 24 để xét nghiệm: - Nhiều chất xét nghiệm cần phải lấy nước tiểu 24 glucose, urê, protein Yêu cầu bình đựng nước tiểu phải khô, vô trùng bảo quản -20oC dùng chất bảo quản như: acid HCl, toluene, dung dịch thymol/alcol ethylic 1% … - Cách lấy nước tiểu 24 giờ: vào qui định, ví dụ: sáng, bệnh nhân thật hết, bỏ phần nước tiểu Sau lấy nước tiểu liên tục cho đế sáng hôm sau Tất nước tiểu lần tiểu tiểu lấy đựng vào bình có chất bảo quản theo yêu cầu kỹ thuật Mẫu gửi kèm theo phiếu ghi chi tiết cần thiết: Thể tích nước tiểu 24 giờ, tuổi, cân nặng, nam – nữ, chế độ ăn uống, thuốc điều trị, chẩn đoán HỆ THỐNG ĐƠN VỊ QUỐC TẾ SI: Hiện nay, phịng thí nghiệm sinh hóa sử dụng đơn vị quốc tế thay cho đơn vị cũ Do đó, yêu cầu người làm xét nghiệm phải biết đổi đơn vị * Nguyên tắc: - Đối với chất hòa tan lấy đơn vị mol/l ước số mol Mol chất tính qua tỷ số khối lượng tính gam với trọng lượng phân tử - Đối với dung dịch sinh học huyết thanh, huyết tương, dịch não tủy dùng nồng độ tính mol/lit - Đối với chất mà khối lượng phân tử chưa biết rõ chưa thực đơn vị mol dùng đơn vị khối lượng Nồng độ khối lượng biểu thị số gam mg lít dung dịch - Đối với hoạt tính enzyme tính đơn vị quốc tế Hoặc tính xúc tác enzyme biểu thị mol/giây (mol/s) tức số mol chất biến đổi thời gian giây lượng enzyme có lít dung dịch sinh vật Đơn vị gọi katal ( kí hiệu kat), ước số kat nkat,… Một đơn vị quốc tế enzyme ký hiệu: UI = mol/min = 16,67 nmol/s = 16,67 nkat - Với nước tiểu chất tiết khác tính mol/lit hay mol/ 24 BẢNG CHUYỂN ĐỔI ĐƠN VỊ STT Chất thử Đơn vị cũ Hệ số Hệ số chuyển cũ chuyển sang sang cũ 144.9 0.0069 1 17.1 0.059 0.5 1 0.026 38.7 0.026 38.7 Albumin Bicarbonat Bilirubin Calcium Chlor Cholesterol- TP Cholesterol- HDL g/100ml mEq/l mg/100ml mEq/l mEq/l mg/100ml mg/100ml Cholesterol- LDL mg /100ml 0.026 38.7 mmol/ l 10 11 12 13 Creatinin Glucose Magnesium Phosphat Phosphatase kiềm mg/100ml g/100ml mg/100ml mg/100ml mM 88.4 0.055 0.41 0,323 16.67 0.0113 18 2.43 3.1 mol/ l mmol/ l mmol/ l mmol/l U/ l 14 15 16 17 18 19 20 21 Potassium Protein TP SGOT (ASAT) SGPT (ALAT) Sodium Triglycerid Urê Uric mEq/l g/dl mol/ml/h mol/ml/h mEq/l g/l g/l mg/l 10 16.67 16.67 1.129 16.65 5.95 0.1 mmol/ l g/ l U/ l U/ l mmol/ l mmol/ l mmol/ l mol/ l 0.875 0.06 0.168 Đơn vị mol/ l mmol/ l mol/ l mmol/ l mmol/ l mmol/ l mmol/ l AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM: Hóa chất dùng PTN độc bỏng da, dễ cháy nổ Những mối nguy hiểm luôn chờ chực bên ta Do đó, cần phải có biện pháp an toàn, phải khéo léo biết cách xử lý có cố xảy Có thể nói an tồn PTN liên quan đến nguồn: - Nguy hiểm hóa chất - Sự lây nhiễm sinh vật phẩm 5.1 An toàn cháy nổ: An toàn cháy nổ quan trọng hàng đầu PTN, cần có sẵn dụng cụ phịng chữa cháy như: Bình chữa lửa, vịi xịt nước 5.2 Các qui định phịng thí nghiệm: - Nếu hóa chất bị rơi vào mắt, da phải rửa thật nhiều nước Với mắt phải rửa 15 phút, tiến trình làm phải tùy thuộc vào loại hóa chất - Khơng hút thuốc, ăn uống, trang điểm - Tóc dài, áo quần lụng thụng cần phải bó gọn - Phải rửa tay sau tiếp xúc với hóa chất trước rời PTN để ăn uống - Loại bỏ dụng cụ thủy tinh nứt, mẻ - Các đồ dùng thủy tinh đựng chất độc hay ăn mòn cần phải ngâm với nước hay alcol trước đặt chung với đồ thủy tinh bẩn khác - Hóa chất PTN khơng dùng làm thuốc 5.3 Thao tác với hóa chất: Khi sử dụng hóa chất đòi hỏi phải thật cẩn thận - Tất hóa chất dễ cháy độc hại phải thao tác vùng thơng gió, tốt tủ hút Dung dịch ăn da axit, kiềm, muối thủy ngân phải thao tác tủ hút Dùng dụng cụ bảo hộ cá nhân có hiệu Khi pha axit đậm đặc phải pha vào nước Sau làm xong phải lau chùi chỗ làm việc cẩn thận Với tác nhân hóa học nguy hiểm phải dùng găng tay, mặc áo choàng Khi có nguy cho mắt, mũi, miệng phải dùng kính an toàn, mask Mọi dụng cụ bảo vệ phải cởi rời khỏi phòng làm việc BÀI 1: HÓA HỌC LIPID, GLUCID, PROTID A HÓA HỌC LIPID: KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA TRIGLYCERID: - Nguyên tắc: Triglycerid không tan nước, tan dung môi hữu Mức độ hòa tan phụ thuộc vào độ phân cực dung môi theo tỉ lệ nghịch - Tiến hành: Cho vào ống nghiệm ống vài giọt dầu ăn, thêm: + Ống 1: ml nước cất + Ống 2: ml ethanol + Ống 3: ml aceton Lắc đều, quan sát khả hòa tan dung mơi khác giải thích KHẢO SÁT CHOLESTEROL: Phản ứng Liebermann - Nguyên tắc: Cholesterol tác dụng với acid sulfuric đậm đặc, với có mặt Anhydride acetic tạo phức hợp màu xanh lục đặc trưng - Tiến hành: Cho 0,5 ml cholesterol chloroform vào ống nghiệm khô, thêm 10 giọt Anhydrid acetic giọt acid sulfuric đậm đặc, lắc đều, để tối 10 phút, quan sát màu tạo thành B HÓA HỌC GLUCID: KHẢO SÁT MONOSACARID VÀ DISACARID: 1.1 Phản ứng khử: 1.1.1 Nguyên tắc: Ở nhiệt độ nóng mơi trường kiềm, tất chất đường có nhóm chức aldehyd có tính khử, khử muối vài kim loại nặng như: Cu 2+ ,Pb 2+ ,Ag + 3+ BI , Fe 3+ Những nhị đường có có chứa nhóm –OH bán acetal tự cho phản ứng to R-COOH + Cu2O + 2H2O R-CHO + 2Cu(OH)2 → 1.1.2 Tiến hành: ( Phản ứng Fehling) Lấy ống nghiệm cho vào ống: 0,5 ml Fehling A (dung dịch CuSO4 ) 0,5 ml Fehling B ( NaOH Na, K tartrat) Trộn đều, đun cách thủy sôi phút, quan sát màu thêm: Ống 1: 0,5 ml sacrose 5‰ Ống 2: 0,5 ml glucose 5‰ Ống 3: 0,5 ml Fructose 5‰ Ống 4: 0,5 ml Lactose 5‰ Ống 5: 0,5 ml Formol 1% Trộn đều, đun sơi cách thủy phút Quan sát giải thích 1.2 Phản ứng tạo Furfural: 1.2.1 Nguyên tắc: Những nhóm -OH rượu bậc phân tử đường bị khử nước acid mạnh HCl, H2SO4 đậm đặc tạo nối đôi Những chất thu dẫn xuất furfural, với có mặt polyphenol tạo thành phức hợp có màu đặc trưng cho loại đường 1.2.2 Tiến hành: ( Phản ứng Molish) Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch glucose 5‰ ( hay dung dịch đường khác), thêm giọt thuốc thử Molish (  Naphtol Etanol) Sau nghiêng ống nghiệm, cho từ từ dọc theo thành ống nghiệm khoảng 1ml H2SO4 đậm dặc Phản ứng dương tính xuất vịng vàng tím bề mặt phân cách lớp chất lỏng Đây phản ứng cho loại đường KHẢO SÁT POLYSACARID: Khảo sát tinh bột + Nguyên tắc: Tinh bột không tan nước lạnh, nước nóng tạo thành dung dịch keo gọi dung dịch hồ tinh bột Hồ tinh bột cho phản ứng Molish, không cho phản ứng khử, với Iod tạo dung dịch màu xanh tím + Tiến hành: a) Làm phản ứng Fehling (Tương tự phần khảo sát monosacarid disaccarid) b) Làm phản ứng Molish (Tương tự phần khảo sát monosacarid disacarid ) c) Tinh bột với Iod: Cho vào ống nghiệm 1ml hồ tinh bột, thêm vài giọt Iod , màu xanh xuất hiện, đun sôi vài phút đèn cồn màu xanh, làm lạnh vòi nước, màu xanh lại xuất Giải thích C HĨA HỌC PROTID: PHẢN ỨNG CỦA ACID AMIN:  Tác dụng với Ninhydrin: + Nguyên tắc: Do tác dụng đồng thời nhóm -COOH -NH2, acid amin tác dung với ninhydrin cho phức chất màu xanh tím Phản ứng dùng để phát acid amin, ứng dụng quan trọng phương pháp sắc ký với acid amin Riêng prolin hydroxyprolin cho với ninhydrin phức chất màu vàng + Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 0,5 ml glycin, 0,5 ml dung dịch ninhydrin Lắc đều, đun cách thủy sơi phút Phản ứng có màu xanh tím PHẢN ỨNG CỦA PROTEIN:  Phản ứng Biurê: + Nguyên tắc: Các peptid protein tác dụng với Cu ++ mơi trường kiềm tạo phức chất màu tím hồng, tương tự phản ứng phân tử Biurê Cu++ môi trường kiềm nên gọi phản ứng Biurê + Tiến hành: Lấy ống nghiệm Ống Ống Ống CuSO4 (giọt) 3 NaOH (N) 2 Lòng trắng trứng (ml) 0.5 1.5 Nước cất (ml) 2.5 1.5 Lắc đều, quan sát thay đổi màu ống  Trầm protein acid: + Nguyên tắc: Các protein bị biến tính khơng thuận nghịch trầm acid acid sulfosalicylic, acid trichloracetic, acid nitric + Tiến hành: Trong ống nghiệm, cho vào 2ml dung dịch lòng trắng trứng, thêm vào 0,5 ml (10 giọt) dung dịch acid trichloracetic 20% Quan sát nhận xét kết BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE, AMYLASE TRONG HUYẾT THANH VÀ TRONG NƯỚC TIỂU 1.PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG : Trong xét nghiệm hóa sinh, phương pháp phân tích định lượng dựa vào phương pháp đo quang kỹ thuật quang phổ sử dụng phổ biến Các kỹ thuật bao gồm: Phương pháp đo màu quang kế quang phổ kế, quang phổ hấp thụ nguyên tử, phương pháp dùng quang kế lửa, quang phổ huỳnh quang bao gồm hóa phát quang phân cực huỳnh quang, phương pháp đo độ đục độ huyền phù, phương pháp khúc xạ Tùy theo đối tượng phân tích, yêu cầu độ nhạy, trang bị điều kiện kinh tế, người ta chọn kỹ thuật Đối với phịng thí nghiệm xét nghiệm thơng thường, kỹ thuật đo quang dùng máy quang kế quang phổ kế, áp dụng phổ biến Đây phương pháp hóa lý có nhiều ưu điểm: Nhanh chóng, tiện lợi làm hàng loạt khơng cần phải tách riêng chất cần phân tích, mẫu nồng độ chất phân tích nhỏ Nhiều phương pháp khác áp dụng phương pháp nói phát thành phần chất phân tích như: Phưng pháp điện di, phương pháp sắc ký 1.1 Sự hấp thụ ánh sáng: Khi chiếu chùm tia sáng có cường độ Io vào cuvete có chiều dài 1, đựng dung dịch chất hịa tan phần chùm tia sáng bị dung dịch hấp thụ, phần bị phản xạ khuếch tán, phần cịn lại có cường độ It khỏi cuvete Theo định luật Lambert - Beer : ta có: E = lC, Độ hấp thụ E tỷ lệ thuận với nồng độ C It = Io10- lC (1) Đặt : T: Độ truyền qua, ta có: T = It /Io = 10- lC (2) Thường tỉ số biểu diễn dạng %T: %T = I /Iox 100 (%) Khi nồng độ hợp chất dung dịch tăng, ánh sáng bị dung dịch hấp thụ nhiều ánh sáng truyền qua giảm %T tỉ lệ nghịch với log nồng độ C Để tiện người ta đặt : E = - lg It /Io = - lg T = - lg 10- lC (3) E = - lg It /Io = lg 100/%T = lg100 - lg %T E = - lg %T (4) E: đại lượng tính tốn thông qua phần trăm độ truyền qua, đại lượng biến thiên từ đến 1.2 Cấu tạo loại máy: Có hai loại máy thường dùng để đo độ hấp thụ màu: - Máy quang kế dùng kính lọc: Trong nguồn sáng đơn sắc chọn lọc nhờ kính lọc màu - Máy quang phổ kế: tia đơn sắc tạo nhờ lăng kính hay cách tử Nguồn sáng Khe chắn Bộ đơn sắc Hệ thống Q/học Curet Bộ ghi Bộ đọc 1.3 Bảng màu bổ sung: Để chọn kính lọc màu hay tia đơn sắc phương pháp đo quang ta cần biết phổ hấp thụ dung dịch phân tích Sau bảng màu bổ sung giúp ta chọn lựa: Màu dung dịch phân tích Tím Chàm Chàm ánh lục Lục ánh chàm Lục Lục ánh vàng Vàng Da cam Đỏ Vùng bước sóng gần (nm) 400 - 450 450 - 480 480 - 490 490 - 500 500 - 560 560 - 575 575 - 590 590 - 625 625 - 750 Màu kính lọc thích hợp Vùng bước sóng gần kính lọc (nm) Lục ánh vàng Vàng Da cam Đỏ Tía Tím Chàm Chàm ánh lục Lục ánh chàm 560 - 575 575 -590 590 - 625 625 - 750 400 - 450 450 - 480 480 - 490 490 - 500 ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG ENZYM ( Glucose oxydase) 2.1 Nguyên tắc: Glucose oxydase (GOD) oxy hóa glucose thành acid gluconic peroxyd hydrogen.(H2O2) Peroxyd hydrogen tạo thành bị enzym peroxydase (POD) phân hủy giải phóng oxy Oxy giải phóng oxy hóa 4-aminophenazon phenol tạo phức chất quinonimin có màu đỏ hồng Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng glucose Glucose + O2 + H2O GOD Acid gluconic + H2O2 2H2O2 +4-aminophenazon + phenol POD Quinonimin + H2O 2.2 Chuẩn bị: - Thuốc thử: Kit hóa chất chuẩn bị sẵn để dùng - Đệm phosphat : 150 mmol/L - Phenol : 10 mmol/L - Amino - antipyrin : 0.4 mmol/L - Peroxydase :  300 UI/L - Glucose oxydase : 15.000 UI/L - Glucose chuẩn 5,5 mmol/l + Lưu ý: : - Mẫu thử huyết huyết tương cần bỏ thêm chất chống tiêu đường Natri Fluor - Nước tiểu dịch sinh vật khác định lượng glucose phương pháp 2.3 Cách tiến hành: Ống trắng H2O cất Glucose chuẩn 5,5 mmol/l Ống chuẩn l 5l Huyết tương nước tiểu Thuốc thử Ống thử 5l 500l 500l 500l Trộn đều, ủ 37oC phút Đọc máy đo quang bước sóng 500 nm đối chiếu với ống trắng  Ý nghĩa ống trắng: Giúp loại trừ mật độ quang thuốc thử trước phản ứng 2.4 Tính kết quả: Tính theo cơng thức: Glucoze (mM/l) = E thử X C (chuẩn) E chuẩn 2.5 Nhận định:  Đối với glucose /huyết thanh: - Người bình thường: 0,75 - 1,15 g/ l 4,2 - 6,4 mmol/ l - Thay đổi: Trong trường hợp sau * Sinh lý: + Tăng sau ăn, xúc động mạnh + Giảm nhịn đói lâu ngày * Bệnh lý: + Tăng bệnh đái tháo đường, cường giáp trạng, u thần kinh, thiểu gan + Giảm thiểu tuyến yên, tuyến thượng thận, dùng nhiều insulin  Đối với glucose/ nước tiểu: * Bình thường: - Khơng có glucose nước tiểu - Có thể có glucose nước tiểu dạng vết mang thai * Bệnh lý: glucose niệu xuất bị bệnh đái đường, cường tuyến yên, tuyến giáp, tuyến vỏ thượng thận, bệnh đái đường ngưỡng tái hấp thu glucose thận thấp ĐỊNH LƯỢNG AMYLASE DÙNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU CƠ CHẤT VÀ TINH BỘT: 3.1 Nguyên tắc: - Xác định hoạt độ enzym phương pháp so màu dựa vào phản ứng màu xảy iod tinh bột thừa chưa bị thủy phân môi trường phản ứng 3.2.Chuẩn bị dụng cụ: - Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch - Máy ly tâm - Nồi chưng 37oC - Máy đo quang - Các dụng cụ thông thường PTN 3.3 Tiến hành: Trong ống nghiệm cho vào: Thử (ml) Chứng (ml) Dung dịch HTB 1% 0,5 0,5 Chưng cách thủy 37oC/3phút Huyết 0,1 Lắc đều, chưng tiếp 30 phút HCl N 0,2 Lắc đều, thêm huyết Nước cất, lắc 0,2 0,1 1,2 10 1,2 + Phương pháp đo: động học enzym + Bước sóng: 405 nm + Cuvete loại 1cm + Ống trắng: nước cất 4.3.2 Tiến hành đo chuẩn thử: Trong ống nghiệm, cho vào: Trắng Chuẩn Thử Thuốc thử định lượng - amylase 300 300 300 Nước cất Mẫu chuẩn Mẫu thử 10 TTràõn Thuốc thử, mẫu đo (l) 10 10 Trộn đều, đọc mật độ quang sau 1, 2, phút Tính độ biến thiên MĐQ trung bình phút - Chú ý: Nếu hoạt độ q cao ( OD  0,300) phải hịa lỗng mẫu 1/5 với nước muối sinh lý 4.4 Tính kết quả: - Tính theo mẫu chuẩn: áp dụng cơng thức: CT = (Et /Ec )x CC - Tính theo hệ số: CT = CC x hệ số 4.5.Nhận định kết quả: Người bình thường: - - Amylase huyết huyết tương:  81 U/l - - Amylase nước tiểu:  340 U/24h Thay đổi trường hợp bệnh lý (Xem phần trên) 12 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN, URE, CREATININE, ACID URIC ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HUYẾT THANH (Phương pháp Biuret) 1.1 Nguyên tắc: Protein tác dụng với CuSO4 môi trường kiềm cho phức chất màu tím hồng, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein huyết KI: 15 mmol/l Kali Natri tartrate: 100 mmol/l NaOH: 100 mmol/l CuSO4: mmol/l Standard: 60 g/l 1.2 Tiến hành: Thuốc thử Nước cất Dung dịch chuẩn 60g/l Huyết Ống trắng Ống chuẩn Ống thử 500l 5l 500l 500l 5l 5l Trộn đọc mật độ quang học, bước sóng 546 nm sau 10 phút ủ 1.3 Tính kết quả: Nồng độ chất thử = E thử / E chuẩn x nồng độ chuẩn (60 g/l) 1.4 Nhận định kết quả: - Nồng độ protein huyết bình thường từ 62 - 80g/l - Tăng u tủy, nước, nôn nhiều, tiêu chảy, thiểu vỏ thượng thận - Giảm hội chứng thận hư nhiễm mỡ, suy dinh dưỡng, xơ gan, đái tháo đường ĐỊNH LƯỢNG URÊ (Phương pháp Ure UV): Nguyên tắc: Định lượng ure phương pháp enzym theo phương trình phản ứng sau: Ure + H2O Urease 2NH3 + CO2 NH3+ 2Ketoglutarate + NADHH+ GDH 2L-Glutamate +2NAD+ + 2H2O GDH : Glutamat dehydrogenase - Sự giảm độ hấp thụ ánh sáng NADHH+ tỷ lệ với nồng độ urê phẩm vật - Mẫu thử: huyết thanh, nước tiểu pha loãng 1/100 2.2 Thuốc thử: Theo kit hóa chất Đệm TRIS pH 8,1 (20oC): 50 mmol/l  Cetoglutarat: 15 mmol/l Urease  1000 U/l Glutamat dehydrogenase  5,4 KU/l NADH 0,18 mmol/l Standard 8,32 mmol/l 13 n 2.3 Tiến hành: Ống trắng Ống chuẩn 500l 5l 500l Thuốc thử Nước cất Dung dịch chuẩn 50mg/dl (8,32 mmol/l) Mẫu thử Ống thử 500l 5l 5l Trộn đọc biến thiên mật độ quang (∆G) 30 giây 90 giây Bước sóng 340 nm 2.4 Tính kết quả: CT = (∆Ex/∆Ec) x nồng độ chuẩn (50 mg/dl 8,32 mmol/l) Ec: Biến thiên mật độ quang ống chuẩn ET: Biến thiên mật độ quang ống thử 2.5 Nhận định kết quả: Bình thường: - Ure huyết thanh: 15 - 40mg/dl từ 2,50 - 7,49 mmol/l - Ure nước tiểu: 20 - 35g/24 333 - 583 mmol/24 2.6 Biện luận: - Ure máu tăng sinh lý chế độ ăn thịt, giảm chế độ ăn rau - Tăng bệnh lý trường hợp: sỏi thận, viêm thận cấp, suy thận - Giảm trường hợp xơ gan giai đoạn cuối ĐỊNH LƯỢNG CREATININ (phương pháp Jaffe, động học) 3.1 Nguyên tắc: Creatinin phản ứng với acid picric môi trường kiềm tạo thành picrat creatinin có màu vàng cam Cường độ màu tỷ lệ thuận với creatinin 3.2 Thuốc thử: Theo kit hóa chất - NaOH: 187,8 mmol/l - Phosphat: 7,5 mmol/l - Picric acid: 8,73 mmol/l - Standard: 176,8 mol/l (2mg/dl) 3.3 Tiến hành: Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Thuốc thử 500l 500l 500l Nước cất 50l Dung dịch chuẩn 50l (2mg/dl hoặc176,8 mol/l) Mẫu thử 50l Trộn đọc biến thiên mật độ quang (∆G) 10 giây 120 giây Bước sóng 492 nm 3.4 Tính kết quả: CT = (∆Ex/∆Ec) x nồng độ chuẩn( 2mg/dl 176,8 mmol/l) Ec: Biến thiên mật độ quang ống chuẩn ET: Biến thiên mật độ quang ống thử 14 Nhận định kết quả: 3.5.1 Giá trị bình thường: - Creatinin huyết thanh: + Nữ giới: 0,5- 1mg/dl (44- 88 mol/l) + Nam giới: 0,6- 1,3 mg/dl (53- 115 mol/l) + Trẻ em: 0,4- 1mg/dl (35- 88 mol/l) - Creatinin nước tiểu: 0,8 -1,8 g 24 ( 7,02-15,9 mmol/24 giờ) 5.2 Thay đổi bệnh lý: Creatinin tăng suy thận , viêm thận cấp, mãn, sỏi thận ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC: 4.1 Phương pháp Phosphotungstic acid 4.1.1 Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, acid uric khử acid phosphotungstic thành màu xanh tungsten, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ acid uric huyết nước tiểu 4.1.2 Tiến hành: Thuốc thử Ống trắng (ml) Nước tiểu pha loãng 1/2 Acid uric máu 0,025g/dl (1,48 mmol/l) Na2CO3 17% Nước cất Thuốc thử phosphotungstic Ống chuẩn (ml) Ống thử (ml) 1 3,8 0,2 1 2,8 0,2 2,8 0,2 Lắc đọc quang phổ kế  = 546 nm 4.1.3 Tính kết quả: CT = (ET /Ec) x CC x độ pha loãng CT = (ET / Ec)x 0.025 x (g/dl) 1,48 x (mmol/l) Lưu ý: Muốn tính nồng độ acid uric nước tiểu, lấy CT nhân với lượng nước tiểu bệnh nhân 24 15 BÀI : ĐỊNH LƯỢNG LIPID, BICARBONAT VÀ CÁC CHẤT ĐIỆN GIẢI TRONG HUYẾT THANH ĐỊNH LƯỢNG LIPID TRONG HUYẾT THANH : 1.1 Định lượng cholesterol toàn phần huyết thanh: Phương pháp so màu dùng enzyme CHOD-PAP( Cholesterol Oxidase Phenazon AminoPeroxidase)  Nguyên tắc: Cholesterol Esterase Cholesterol este + H2O Cholesterol + O2 Cholesterol Esterase Cholesterol oxidase H2O2 + Phenol + Aminoantipyrine Cholesterol + acid béo 4-Cholesten-trione + H2O2 Peroxidase Đỏ phenol + H2O Cường độ màu tỉ lệ nồng độ cholesterol huyết 1.1.1 Thuốc thử: - Đệm pH 6,9: 50 mmol/l - Phenol: 24 mmol/l - Sodium chlorate: 0,5 mmol/l - Cholesterol esterase  200 mol/l - Cholesterol oxidase  250 mol/l - Peroxidase  1000 mol/l - Aminoantipyrine 0,5 mmol/l - Chuẩn Cholesterol: 5,17 mmol/l (200 mg/dl) 1.1.2 Tiến hành: Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Thuốc thử 500 l 500 l 500 l Nước cất l Cholesterol chuẩn l (5,17mmol/l) Huyết l Trộn đọc mật độ quang (E) sau ủ phút, bước sóng 500 nm màu ổn định vịng 1.1.3 Tính kết quả: Nồng độ Cholesterol tồn phần = (E thử / E chuẩn) x nồng độ Cholesterol chuẩn Nồng độ Cholesterol toàn phần = (E thử / E chuẩn) x 5.17 mmol/l + Độ tuyến tính: Cholesterol 12,9 mmol/l 1.1.4 Nhận định kết quả: - Bình thường: Cholesterol tồn phần thay đổi theo lứa tuổi, cholesterol toàn phần (người trưởng thành): 50-260 mg/dl(4 - 6,7 mmol/l) - Bệnh lý: + Cholesterol tăng: xơ vữa động mạch, cao huyết áp, xơ gan, vàng da tắt mật, đái đường, thận nhiễm mỡ, viêm thận mãn tính + Cholesterol giảm: lao tiến triển, nhiễm khuẩn nặng kéo dài, thiểu thượng thận, viêm gan nặng, cường giáp, tan máu 16 1.2 Định lượng HDL-Cholesterol: Phương pháp so màu dùng enzym CHOD-PAP sau tạo tủa với acid phosphotungstic 1.2.1 Nguyên tắc: - Phosphotungstic acid 14 mmol/l - Magnesium chloride 1mol/l - Dung dịch chuẩn : 1,3 mmol/l 1.2.3 Tiến hành: * Chuẩn bị dung dịch tạo tủa: hịa thể tích thuốc thử với thể tích thuốc thử 2, ổn định tuần 20-25oC * Taọ tủa huyết thanh: + Huyết thanh, huyết tương :100 l + Dung dịch tạo tủa :200 l + Trộn đợi 10 phút, li tâm 5000 vòng/phút 15 phút, bỏ tủa, lấy dịch HDL-Cholesterol đo chung với dung dịch định lượng Cholesterol toàn phần Các bước tiến hành xét nghiệm HDL- cholesterol Dung dịch lên màu Nước cất Dung dịch HDL-C chuẩn (1,3 mmol/l) Ống trắng Ống chuẩn ống thử 500 l 25l 500 l 500 l 25l Dịch (sau li tâm) 25l Trộn đọc mật độ quang sau ủ phút, bước sóng 500 nm màu ổn định vòng 1.2.4 Tính kết quả: Nồng độ HDL - Cholesterol = E thử/ E chuẩn x nồng độ chuẩn x Nồng độ HDL - Cholesterol = E thử/ E chuẩn x 1.30 x (mmol/l) 1.2.5 Nhận định kết quả: - Bình thường: Cholesterol HDL tăng biểu tốt cho bệnh tim mạch + Ở nam: Cholesterol HDL > 0,9 mmol/l ( 35 mg/dl) + Ở nữ: Cholesterol HDL > 1, mmol/l ( 45 mg/dl) - Bệnh lý: Cholesterol HDL giảm bệnh xơ vữa động mạch, nhồi máu tim, tai biến mạch máu não, tiểu đường, hội chứng thận hư 1.3 Định lượng LDL-Cholesterol - LDL – C = CT – (HDL – C + TG/ 2.2) (mmol/l) - LDL – C = CT – (HDL – C + TG/5) (mg/dl) LDL-C tính theo cơng thức Friedewald, với điều kiện: Triglycerid < 4,5 mmol/l (390 mg/dl) *Nhận định kết quả:: Cholesterol tăng biểu xấu cho bệnh tim mạch - Bình thường: Cholesterol LDL < 3,9 mmol/l ( < 150 mg/dl) - Bệnh lý: Tăng bệnh xơ vữa động mạch, nhồi máu tim, tai biến mạch máu não, đái đường, hội chứng thận hư 1.4 Tryglycerid: Phương pháp so màu dùng enzyme GOP – GAP (Glycerolphosphat Oxidase Phenazon amino Peroxidase) 17 1.4.1 Nguyên tắc: Thuỷ phân Triglycerid enzym, xác định glycerol giải phóng phương pháp so màu Triglycerid + H2O Triglycerid Lipase Glycerol + R-COOH Glycerol + ATP Glycerol kinase Glycerol phosphate + O2 Glycerol phosphate + ADP Glycerol P oxidase peroxidase Dihydroxyaceton P + H2O2 H2O2 + Amino antipyrine Đỏ quinone + H2O Cường độ màu đỏ tỷ lệ thuận với nồng độ triglycerid huyết 1.4.2 Thuốc thử: - Thuốc thử 1: + Dung dịch đệm pH 7,5 500 mmol/l + ADPS mmol/l + Muối Magnesium 15 mmol/l - Thuốc thử 2: + Lipoprotein lipase  1100 mol/l + Glycerol kinase  800 mol/l + Glycerol phosphat oxydase  3000 mol/l + Peroxydase  350 mol/l + Aminoantipyrine 0,7 mmol/l + ATP 0,3 mmol/l - Triglycerid chuẩn 2,28 mmol/l (200 mg/dl) 1.4.3 Tiến hành: Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Dung dịch lên màu 500 l 500 l 500 l Nước cất 5l Dung dịch Triglycerid chuẩn 5l Huyết 5l Trộn đọc mật độ quang sau ủ phút, bước sóng 546 nm màu ổn định vịng 30 phút 1.4.4 Tính kết quả: Nồng độ triglycerid huyết = (E thử/ E chuẩn) x nồng độ chuẩn Nồng độ triglycerid huyết = (E thử/ E chuẩn) x 2.28 mmol/l - Độ tuyến tính: Triglycerid = 11,4 mmol/l 4.5 Nhận định kết quả: +Bình thường: Triglycerid < 2,28 mmol/l ( < 200 mg/dl) + Bệnh lý: - Triglycerid máu tăng vừa (3-4 mmol/l) thấy trường hợp sau: Đái đường, cường thiểu tuyến thượng thận, bệnh thống phong, bệnh gan (hội chứng ứ mật, xơ gan), viêm tụy cấp mãn, hội chúng thận hư, suy thận, hội chứng Cushing - Nồng độ TG huyết vượt 11,3 mmol/l dẫn đến viêm tụy cấp làm tăng thiểu mạch máu ngoại biên 18 - Cũng có khả tăng triglycerid sau dùng thuốc corticoid kéo dài phụ nữ dùng thuốc tránh thai có hoocmon sinh dục nữ KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BICARBONAT TRONG HUYẾT THANH: 2.1 Nguyên tắc: Cho lượng HCl dư biết trước vào huyết thanh, lắc hổn hợp để loại khí CO2 tạo thành chuẩn độ lượng acid dư thừa với bazơ chuẩn, suy nồng độ bicarbonat từ lượng acid trung hòa với bicarbonat H+ + HCO3H2CO3 CO2 + H2O HCl (dư) + NaOH (chuẩn) = H2O + NaCl 2.2 Tiến hành: Trong bình nón cốc có mỏ, cho vào ml huyết thanh, ml HCl 0,02 N lắc phút để loại khí CO2 Sau thêm vào cốc mỏ giọt đỏ metyl chuẩn độ nằng NaOH 0,02 N từ buret, nhỏ từ từ vào cốc có mỏ giọt thừa NaOH làm dung dịch cốc có mỏ chuyển sang màu cam (ghi V ml) 2.3 Tính kết quả: Vì thể tích HCl dư nên lượng HCl tác dụng với bicarbonat huyết - V Một đương lượng bicarbonat tác dụng với đương lượng HCl, tính tốn nồng độ bicarbonat sau: C.V  C'.V'  C HCO-  C HCO-  3- V x 0,02 Eq/l 3- V x 0,02 x 1000 mEq/l 2.4 Nhận định kết quả: * Bình thường: Bicarbonat = 25-30 mEq/l (25-30 mmol/l) * Bệnh lý: Bicarbonat tăng nhiều nguyên nhân : 2.4.1 HCO3- tăng: II.4.1.1 Nhiễm kiềm chuyển hóa: - Do H+ : nôn mữa, hẹp môn vị, cắt dày - Nhiễm bicarbonat : uống tiêm nhiều thuốc có bicarbonat 24.1.2 Nhiễm acid chuyển hóa: CO2 đào thải ứ đọng pCO2 tăng CO2 + H2O  H2CO3 HCO3- + H+  tăng HCO3- Trường hợp cịn bù pH thay đổi - Trường hợp bù pH giảm Nhiễm acid hô hấp hay gặp trường hợp giảm thơng khí phổi: liệt hơ hấp, xẹp phổi, nhiễm độc morphin 2.4.2 HCO3- giảm: 2.4.2.1 Nhiễm acid chuyển hóa : + Do thừa H+ : tăng acid acid cetonic đái đường nhịn đói lâu ngày, tăng acid lactic, suy thận + Mất bicarbonat tiêu chảy, nôn mữa 4.2.2 Nhiễm kiềm hô hấp: CO2 tăng đào thải qua phổi làm giảm pCO2 , thận tăng đào thải HCO3- giảm HCO3- máu Nhiễm kiềm hô hấp hay gặp tăng thơng khí khí phổi : Sống vùng cao tổn thương não - Trường hợp bù pH thay đổi - Trường hợp bù pH tăng 19 Ghi chú: Biện luận kết theo phương trình Henderson-Hasselbach: [HCO 3- ] pH  pK  lg pCO2 ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT ĐIỆN GIẢI: Định lượng natri, kali, calxi huyết phương pháp dùng điện cực chọn lọc (phương pháp đo điện thế) 3.1 Nguyên tắc: Điện cực để đo ion thường có màng lọc thích hợp với ion riêng Sự chênh lệch điện đầu khác màng lọc tỷ lệ thuận với hoạt độ nồng độ ion Thường chênh lệch thấp Để đo, người ta dùng điện cực tham chiếu có đặc tính ổn định điện riêng Điện cực tham chiếu thường điện cực clorua bạc calomel Điện thu hệ thống = Sự chênh lệch điện chuẩn tham chiếu điện mẫu đo chưa biết 3.2 Tiến hành: 3.2.1 Xử lý mẫu: - Đo Na+ K+ điện cực chọn lọc thực theo cách: + Hoặc mẫu khơng pha lỗng, mẫu đo huyết tương máu toàn phần, gọi đo điện trực tiếp + Hoặc mẫu khơng pha lỗng, hoạt độ ion khác mẫu nguyên thủy Đó đo điện gián tiếp 3.2.2 Cách đo: - Điện cực đo Na+ điện cực thủy tinh (thủy tinh đặc biệt oxyde lithium aluminium, giữ vai trò màng) Người ta thu màng “vị trí anion” có ion Na+ vào phát sinh điện màng tỷ lệ thuận với khác biệt nồng độ ion Na+ hai đầu màng Tất kỹ thuật máy đo điện cực màng nhắm đến khác biệt điện thường tất yếu - Điện cực đo K+ thường sử dụng valinomycine trộn vào silicone Valinomycine loại peptid vịng bền vững, nguồn gốc vi khuẩn, có khả bắt giữ ion K+ hình thành phức hợp ổn định 3.2.3 Cách tính kết quả: + Sự liên quan hoạt độ nồng độ : Điện cực chọn lọc đáp ứng lại hoạt độ ion Sự liên quan hoạt độ đo điện cực chọn lọc mẫu khơng pha lỗng nồng độ ion biểu thị công thức tốn học Thực tế chênh lệch điện chuẩn tham chiếu mẫu đo chưa biết thành điện thu hệ thống đo + Chỉ có phương pháp đo điện trực tiếp với mẫu khơng pha lỗng cho giá trị thực ion đo Nếu người ta dùng phương pháp đo điện gián tiếp (hịa lỗng 20 lần) phương pháp đo quang kế lửa (pha loãng 200 lần), kết phải hiệu chỉnh theo nước huyết tương thật Nước chiếm 93% thể tích huyết tương, 7% lại protein lipoprotein Do gia tăng lipoprotein máu, đặc biệt triglycerid, tăng protein, tỷ lệ nước huyết tương thay đổi xác tính theo cơng thức Waugh: Nước huyết tương = 99,1 - 0,073 (P) - 0,103 (L) P biểu thị cho nồng độ protein (g/l) L biểu thị cho lipid máu (g/l) 3.2.4 Nhận định kết quả: + Trị số bình thường: + Natri: 136-148 mEq/l + Kali: 3,5-5,0 mEq/l + Calci: 4,5-5,5 mEq/l +Thay đổi bệnh lý: - Natri tăng : viêm thận có phù 20 - Natri giảm : Thiểu vỏ thượng thận, (bệnh Addison), viêm thận có ure máu cao - Kali tăng : Sốc chấn thương, tắc ruột cấp, tan máu, thiểu vỏ thượng thận, suy tim nặng - Kali giảm : nhiễm độc thuốc ngủ, Nicotin, Strophantin, viêm cầu thận nặng, rối loạn hậu phẫu - Calci tăng : sau lao động chân tay nhiều, dùng nhiều sinh tố D, sau tiêm nội tiết tố cận giáp, thần kinh giao cảm bị kích thích - Calci giảm : Thần kinh phó giao cảm bị kích thích mềm xung, thiểu phó giáp trạng chứng Tetani 21 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN HUYẾT THANH ĐO HOẠT ĐỘ ENZYM SGOT – SGPT HUYẾT THANH TÌM CÁC CHẤT BẤT THƯỜNG TRONG NƯỚC TIỂU 1.ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN HUYẾT THANH: 1.1 Nguyên tắc: Acid sulfanilic phản ứng với sodium nitrit hình thành acid diazo sulfanilic Trong diện dimethylsulfoxide, bilirubin toàn phần phản ứng với acid diazo sulfanilic tạo thành azobilirubin (màu hồng) Khơng có dimethylsulfoxide, có bilirubin trực tiếp phản ứng azobilirubin 1.2 Thuốc thử: 1.2.1 Bilirubin toàn phần: Acid sulfanilic : 28,9 mmol/l Acid hydrochloric : 165 mmol/l Dimethysulfoxide : mol/l Sodium nitrit : 43mmol/l 1.2.2 Bilirubin trực tiếp: Acid sulfanilic : 28,9 mmol/l Acid hydrochloric : 165 mmol/l Sodium nitrit : 43 mmol/l 1.3 Tiến hành: 1.3.1 Bilirubin toàn phần: Hóa chất Thuốc thử Nước cất Bilirubin TP chuẩn (73,7 µmol/L) Huyết Ống trắng 500 µl Ống chuẩn 500 µl Ống thử 500 µl 20 l 20 µl 20 l Trộn đọc mật độ quang sau ủ phút, bước sóng 555 nm (530 – 580 nm) I.3.2 Bilirubin trực tiếp: Hóa chất Ống trắng Ống chuẩn Ống thử Thuốc thử 500 µl 500 µl 500 µl Nước cất 20 l Bilirubin TT chuẩn 20 µl (31,3 µmol/L) Huyết 20 l Trộn đọc mật độ quang sau ủ phút, bước sóng 555 nm (530 – 580 nm) 1.4 Tính kết quả: Nồng độ bilirubin huyết = (E thử / E chuẩn) x nồng độ bilirubin chuẩn 1.5 Nhận định kết quả: 1.5.1 Bình thường: Bilirubin tồn phần: - 10 mg %0 (5,13 - 17,1mol/l) Bilirubin trực tiếp: dạng vết 1.5.2 Bệnh lý: - Bilirubin tăng bệnh gây vàng da, kể vàng da tắc mật, viêm gan hay tắc mật, huyết tán - Bilirubin gián tiếp tăng hội chứng vàng da sinh lý trẻ sơ sinh bệnh vàng da di truyền Gibert thiếu men glucuronyl transferase trường hợp suy gan nặng Bilirubin trực tiếp tăng bệnh có tổn thương đến tế bào nhu mơ gan viêm 22 gan, xơ gan, bệnh gây viêm tắc mật sỏi mật, u đầu tụy, hạch to đè vào đường dẫn mật ĐỊNH LƯỢNG HOẠT ĐỘ ENZYM SGOT – SGPT TRONG HUYẾT THANH (Phương pháp đo động học enzyme) 2.1 Nguyên tắc: 2.1.1 SGOT (ASAT): Xác định động học Aspartat aminotransferase (ASAT) dựa trên: L Aspartat +  Xetoglutarat ASAT Oxaloacetat + L.Glutamat Oxaloacetat + NADH + H+ MDL L - Malat + NAD+ (MDH: Malat dehydrogenase) Sự giảm độ hấp thụ ánh sáng NADHH+ tỷ lệ với hoạt độ enzym SGOT 2.1.2 SGPT ( ALAT): 2.1.2.1 GOT: Đệm pH 7,8 88 mmol/l L Aspartat 260 mmol/l MDH  600 U/l LDH  900 U/l NADH 0,20 mmol/l  cetoglutarat 12 mmol/l 2.2.2 GPT: Đệm pH 7,5 110 mmol/l L Alanin 550 mmol/l LDH  1200 U/l NADH 0,20 mmol/l  xetoglutarat 16 mmol/l 2.2 Tiến hành: Thuốc thử 500 l Huyết 50 l Trộn sau ủ 30 giây, đo biến thiên mật độ quang phút (∆E) kéo dài phút bước sóng 340 nm Tính kết quả: 340 nm : Hoạt tính (U/l) = (E/phút) x 1746 334 nm : Hoạt tính (U/l) = (E/phút) x 1780 365 nm : Hoạt tính (U/l) = (E/phút) x 3235 2.4 Nhận định kết quả: 2.4.1 Bình thường : 30 oC 37oC ASAT (GOT) < 30 U/I < 46 U/l ALAT (GPT) < 35 U/l < 49 U/l 2.4.2 Thay đổi bệnh lý: (Chỉ ý tăng) 2.4.2.1 Bệnh gan: Là xét nghiệm phản ánh tình trạng tiêu tế bào - Viêm gan cấp: điển hình viêm gan virut ALAT tăng cao ASAT, tỉ số De Ritis đảo ngược Trong trường hợp ALAT tăng cao > 20 lần giá trị bình thường - Viêm gan mãn: tăng viêm gan cấp, ưu tăng GOT - Xơ gan: men gan tăng vừa GOT tăng nhiều GPT 2.4.2.2 Bệnh tim: Trong nhồi máu tim hai men tăng GOT tăng nhiều tỉ số De Ritis > 23 2.4.2.3 Bệnh bệnh khác Loạn dưỡng xương, bệnh viêm cơ, viêm xương, tiêu myoglobin TÌM CÁC CHẤT BẤT THƯỜNG TRONG NƯỚC TIỂU: 3.1 Tìm protein nước tiểu: 3.1.1 Nguyên tắc: Protein bị kết tủa nhiều yếu tố: - Nhiệt độ - Acid hữu (acid Sulfosalicylic, acid Trichloacetic) - Acid vô HNO3 - Muối (NH4)2SO4 3.1.2 Tiến hành Dùng phương pháp acid hữu Cho vào ống nghiệm 2,5 ml nước tiểu, 10 giọt Trichloacetic, có tủa đục, phản ứng dương tính (+) 3.1.3 Nhận định kết Protein xuất bệnh: - Bệnh thận, viêm thận, thận hư nhiễm mỡ - Bệnh nhiễm khuẩn (thương hàn, viêm phổi), nhiễm độc (Hg, Pb) - Phụ nữ có thai Tìm mật nước tiểu: 3.2.1 Sắc tố mật (phản ứng Harrison) 3.2.1.1 Nguyên tắc Bilirubin tác dụng với Bari Chlorua tạo kết tủa muối không tan, sau dùng Fe+++ (thuốc thử Fouchet) để oxy hóa Bilirubin thành Biliverdin có màu xanh 3.2.1.2 Tiến hành Cho vào ống nghiệm: - Nước tiểu (mới lấy) 2,5 ml - Dung dịch Bari Chlorua 10% 2,5 ml - Dung dịch (NH4)2SO4 giọt Lắc đều, lọc lấy nước tiểu giấy lọc, đợi mở rộng giấy lọc ra, sấy khơ Nhỏ vào tủa giọt thuốc thử Fouchet, có Bilirubin xuất màu xanh lục 3.2.2 Muối mật (phản ứng Legal) 3.2.2.1 Nguyên tắc Dựa tính chất muối mật làm giảm sức căng bề mặt nước, người ta dùng lưu huỳnh thăng hoa để định tính có mặt muối mật nước tiểu 3.2.2.2 Tiến hành Cho 5ml nước tiểu vào ống nghiệm, rắc nhẹ bề mặt lưu huỳnh thăng hoa, có muối mật nước tiểu, bột lưu huỳnh rơi xuống đáy ống nghiệm 3.2.2.3 Nhận định kết quả: Bilirubin thoát nước tiểu bilirubin trực tiếp, tan nước Bình thường khơng có bilirubin tiết nước tiểu, bệnh vàng da tổn thương gan mật, bilirubin lẫn muối mật tràn vào máu tiết ngồi qua nước tiểu 3.3 Tìm glucose nước tiểu: 3.3.1 Nguyên tắc: Glucose khử dung dịch CuSO4 nhiệt độ sôi môi trường kiềm thành kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch 3.3.2 Tiến hành Cho vào ống nghiệm : Thuốc thử Benedict 2ml, đun cách thủy sôi phút, thấy có màu xanh ban đầu cho vào tiếp 0,5ml nước tiểu Đun cách thủy sôi phút, làm lạnh 24 Kết quả: dung dịch trong: (-) - Dung dịch chuyển màu xanh lục : (+) < 5g/l - Có kết tủa vàng sẫm : (++) - 10g/l - Có kết tủa vàng gạch: (+++) > 10 - 20g/l Có kết tủa vảng sẫm lúc sôi : (++++) > 20g/l 3.3.3 Nhận định kết quả: Xem phần định lượng đường nước tiểu 3.4 Tìm thể cetomic nước tiểu: 3.4.1 Nguyên tắc: (phản ứng Legal) Cetonic cho vào Natri Nitroprussiat môi trường kiềm (NH4OH) cho phức chất có màu tím 3.4.2 Tiến hành Cho vào ống nghiệm - 2,5ml nước tiểu - giọt Natri Nitroprussiat 5% - giọt acid acetic đậm đặc Trộn đều, nghiêng ống nghệm cho chảy từ từ theo thành ống vào khoảng 1ml NH4OH đậm đặc (không lắc)  Kết quả: Sau chừng vài phút, Cetonic có vịng màu tím hai lớp dung dịch Màu tím xuất nhanh hay chậm tùy thuộc lượng cetonic nhiều hay 3.4.3 Nhận định kết Cetonic xuất nước tiểu trường hợp : đái tháo đường, nhịn đói lâu ngày XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN NƯỚC TIỂU BẰNG MÁY PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU TỰ ĐỘNG: (Phần kiến tập) Máy phân tích nước tiểu sử dụng que thử 10 thông số để định tính, bán định lượng nhanh chất nước tiểu: tỷ trọng nước tiểu, pH, glucose, protein, cetonic, urobilinogen, bilirubin, máu, bạch cầu, nitrit Máy phân tích nước tiểu tự động có nhiều loại khác nhau: Máy Diditron, Miditron, Junior, Dimitron, Urilux 4.1 Nguyên tắc hoạt động máy phân tích nước tiểu tự động Máy phân tích nước tiểu tự động máy quang kế khúc xạ sử dụng để đo bán định lượng 10 thông số nước tiểu cách sử dụng nhúng nước tiểu Các bóng đèn cực phát ánh sáng sử dụng nguồn sáng thời gian đo tối ưu hóa để phản ứng hóa học tạo màu xảy vùng phản ứng thuốc thử Ðầu đo máy chứa bóng đèn có bước sóng khác Que thử đặt vị trí cố định đầu đo di chuyển miếng đệm thuốc thử, vị trí “tham chiếu” - nơi hệ thống quang học bắt đầu hoạt động Trong trình đo, máy kiểm tra vị trí thử đầu đo cách thực kiểm tra cách xác dòng ánh sáng khúc xạ đo Nếu đặt que nhúng khơng xác đầu đo, máy báo lỗi Nguyên tắc phản ứng xét nghiệm thử: 4.2.1 Tỷ trọng nước tiểu: Thử nghiệm phản ánh nồng độ ion nước tiểu Với có mặt cation, proton giải phóng thuốc thử hỗn hợp, tạo nên thay đổi màu chất thị bromthymol có màu xanh da trời sang màu xanh sang màu vàng 4.2.2 pH nước tiểu: Giấy thử chứa chất thị màu: đỏ methyl, phenolphtalein xanh bromthymol 4.2.3 Các bạch cầu (leukocytes): 25 Xét nghiệm thể có mặt enzym esterase bạch cầu có hạt Các enzym esterase có tác dụng thủy phân este acid indoxylcarbonic, giải phóng indoxyl Và indoxyl tạo thành phản ứng với muối diazonium sản phẩm màu tím 4.2.4 Nitrit: Xét nghiệm dựa nguyên tắc xét nghiệm Griess đặc hiệu với nitrit Nitrit có mặt nước tiểu phản ứng với amin thơm tạo muối diazonium, cho phức chất màu đỏ tím Phản ứng giúp phát cách gián tiếp vi khuẩn tạo nên nitrit có nước tiểu đổi màu từ hồng đến đỏ thử 4.2.5 Protein: Xét nghiệm dựa nguyên tắc thay đổi nồng độ protein phụ thuộc vào chất thị pH, 3',3",5',5" tetrachlorophenol-3,4,5,6-tetrabromosulfophthale Phản ứng dương tính xảy màu thử chuyển từ màu vàng sang màu xanh 4.2.6 Glucose: Xác định glucose nước tiểu dựa phản ứng đặc hiệu glucoseoxidase/peroxidase Enzym glucoseoxidase xúc tác phản ứng oxy hóa glucose tạo thành acid glucuronic H2O2, sau xúc tác enzym peroxidase, H2O2 kết hợp với tetramethylbenzidine tạo phức chất màu xanh Phản ứng dương tính thử chuyển từ màu vàng sang xanh 4.2.7 Các thể cetonic: Xét nghiệm dựa nguyên tắc phản ứng Legal, Natrinitroferricyanide glycine phản ứng với acetoacetate acetone tạo thành phức chất có màu tím Bình thường thể ceton khơng có nước tiểu, xuất có tiểu đường nặng (giai đoạn tiền mê mê), đói kéo dài, chế độ ăn giàu lipid, tiêu chảy nước nặng, nhiễm độc giáp Chỉ trường hợp tiểu đường ceton niệu có kèm thêm glucose niệu, cịn trường hợp khác khơng có glucose niệu 4.2.8 Urobilinogen: Muối 4-methoxybenzene-diazonium-tetrafluoroborate phản ứng tức với urobilinogen để tạo nên chất azo có màu đỏ Xét nghiệm đặc hiệu với urobilinogen không bị ảnh hưởng yếu tố gây nhiễu 4.2.9 Bilirubin: Nguyên tắc phản ứng dựa kết hợp bilirubin với muối 2,6-dichlorobenzenediazonium-tetrafluoroborate cho màu đỏ Ðậm độ màu thử từ hồng đến đỏ tỷ lệ thuận với nồng độ bilirubin nước tiểu 4.2.10 Hồng cầu: Hemoglobin myoglobin xúc tác cho oxy hóa chất thị hydroperoxid hữu chứa giấy thử Hồng cầu bị ly giải giấy thử, giải phóng hemoglobin tạo chấm màu xanh thử Nước tiểu có hồng cầu viêm thận cấp, lao thận, ung thư thận 26