(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC tập hóa SINH học TINH SẠCH và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỨA TRƯỜNG CHINH - MSHV: 20C61005 TỪ KHỞI THÀNH - MSHV: 20C61012 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE TÁI TỔ HỢP BÁO CÁO THỰC TẬP HĨA SINH HỌC Ngành: Hóa sinh học Mã số ngành: 8420116 GVHD: TS Trần Quốc Tuấn TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 Mục lục Tiến hành thí nghiệm 2+ Tinh Amylase tái tổ hợp sắc kí lực Ni -NTA agarose 3 Kết 4 Kết luận 15 Tiến hành thí nghiệm - Ly tâm 100 ml dịch khuẩn tốc độ 7000 vòng/phút, 10 C 10 phút để thu dịch - enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối 50ml tủa dung mơi hữu Định hoạt tính enzyme hàm lượng protein dịch enzyme ban đầu (trước tủa) mẫu tủa ly tâm, thu tủa hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa) Xác định hoạt tính enzyme hàm lượng protein dịch enzyme sau tủa Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sắc ký lực 2+ Tinh Amylase tái tổ hợp sắc kí lực Ni -NTA agarose Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị cột - Nhồi lớp bơng thủy tinh có độ dày khoảng mm vào ống tiêm ml (Lưu ý: bề mặt lớp phẳng) - Đặt lớp giấy lọc lên cột - Cố định cột lên giá đỡ nối dây truyền dịch với cột - Rửa cột với ml đệm chiết tách, lặp lại lần 2+ Cân Ni -NTA agarose 2+ - Cho 500 µl dịch Ni -NTA agarose vào tube 1,5 ml; ly tâm 13000 vòng/phút phút C, loại bỏ dịch - Huyền phù tủa ml đệm chiết tách, ly tâm 13000 vòng/phút phút C, loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước thực lần Tinh protein 2+ - Trộn ml dịch enzyme sau tủa với Ni -NTA agarose cân chuẩn bị bước trên, lắc C 2+ - Sau giờ, cho toàn hỗn hợp protein Ni -NTA agarose lên cột thu dịch qua cột (FT – flow-through), để ổn định cột 10 phút 2+ - Rửa phức hợp protein gắn với Ni -NTA agarose với ml đệm rửa Thu nhận dịch rửa giải Xác định hoạt tính hàm lượng protein dịch rửa - Thôi giải protein mục tiêu với ml đệm giải, lặp lại lần Thu nhận phân đoạn protein giải bảo quản nhiệt độ lạnh Xác định hoạt tính hàm lượng protein phân đoạn 3 Nồng độ (µg/ml) OD1 OD2 OD3 Từ kết thu nhận được, ta nhận thấy nồng độ µg/ml protein ghi nhận giá trị OD, điều không với lý thuyết Nên giá trị OD nồng độ µg/ml protein hiệu chỉnh 0, giá trị OD nồng độ khác hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2 trừ cho 0.075 nồng độ khảo sát; giá trị OD3 trừ cho 0.076 nồng độ khảo sát) Từ tính tốn ∆OD lần lập lại, ta kết bảng sau: Nồng độ (µg/ml) OD1 OD2 OD3 ∆OD Xây dựng đường chuẩn protein Đường chuẩn tinh bột Nồng độ (mg/ml) OD1 OD2 OD3 Tương tự trên, từ giá trị OD ghi nhận được, ta nhận thấy nồng độ µg/ml tinh bột ghi nhận giá trị OD, điều không với lý thuyết Nên giá trị OD nồng độ µg/ml tinh bột hiệu chỉnh 0, giá trị OD nồng độ khác hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2, OD3 trừ cho giá trị tương ứng 0.053, 0.054 0.055 nồng độ khảo sát) Từ tính tốn ∆OD lần lập lại, ta kết bảng sau: Nồng độ (mg/ml) OD1 OD2 OD3 ∆OD Xây dựng đường chuẩn tinh bột Nồng độ protein Dịch Enzyme thô trước tủa Enzyme tủa cồn Enzyme tủa muối OD 595nm Pha loãng 20 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein Dựa vào phương trình đường chuẩn protein: y = 0.001x + 0.0008 (phương trình 1) với R = 0.9983, ta tính nồng độ protein có trong: ❖ Protein dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa) Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y phương trình Từ ta suy giá trị x tương ứng với nồng độ protein có mẫu thử Thí nghiệm lặp lại lần, nên nồng độ protein có mẫu thử tương đương với giá trị trung bình lần lặp lại + Với OD = 0.118 117.2 µg/ml + Với OD = 0.120 119.2 µg/ml + Với OD = 0.121 ➔ ➔ ➔ x= x= x= 120.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lặp lại: ̅= 117.2+119.2+120.2 = 118.87 µg/ml Vì mẫu pha loãng 20 lần trước đo OD, nên [protein] = ì 20 = 2377.4 àg/ml = 2.3734 mg/ml Vy 100 ml dịch ni cấy có: [protein]dịch enzyme thơ = 2.3774 × 100 = 237.34 mg ❖ Protein sau tủa cồn Cách tính nồng độ protein dịch enzyme sau tủa cồn tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 µg/ml + Với OD = 0.112 ➔ x = 111.2 µg/ml + Với OD = 0.111 ➔ x = 110.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= = 112.87 µg/ml 117.2+111.2+110.2 Vì mẫu pha loãng 100 lần trước đo OD, nên nồng độ protein thực có ml mẫu sau tủa cồn là: [protein]sau tủa cồn = × ̅ 100 = 11287 µg = 11.287 mg Suy 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein] sau tủa cồn = 11.287 × 10 = 112.87 mg ❖ Protein sau tủa muối Cách tính nồng độ protein dịch enzyme sau tủa muối tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.108 ➔ x = 107.2 µg/ml + Với OD = 0.110 ➔ x = 109.2 µg/ml + Với OD = 0.106 ➔ x = 105.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 107.2+109.2+105.2 = 107.2 µg/ml Vì mẫu pha lỗng 100 lần trước đo OD, nên nồng độ protein thực có ml mẫu sau tủa cồn là: [protein] sau ta mui = ì 100 = 10720 àg = 10.72 mg Suy 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein] sau tủa muối = 10.72 × 10 = 107.2 mg Tinh enzyme Dịch TG1 TG2 TG3 TG4 TG5 Dịch rửa (5 ml) ❖ Protein có dịch thơi giải (TG1) Cách tính nồng độ protein có TG1 tương tự phần dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 (µg/ml) + Với OD = 0.120 ➔ x = 119.2 (µg/ml) + Với OD = 0.121 ➔ x = 120.2 (µg/ml) Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 117.2+119.2+120.2 = 118.87 (µg/ml) 0.119 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG2) Cách tính nồng độ protein có TG2 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.113 ➔ x = 112.2 µg/ml + Với OD = 0.115 ➔ x = 114.2 µg/ml) + Với OD = 0.111 ➔ x = 110.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 112.2+114.2+110.2 = 112.2 µg/ml 0.112 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG3) Cách tính nồng độ protein có TG3 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.139 ➔ x = 138.2 µg/ml + Với OD = 0.131 ➔ x = 130.2 µg/ml + Với OD = 0.129 ➔ x = 128.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 138.2+130.2+128.2 = 132.2 µg/ml 0.132 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG4) Cách tính nồng độ protein có TG4 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.127 ➔ x = 126.2 µg/ml + Với OD = 0.127 ➔ x = 126.2 µg/ml + Với OD = 0.123 ➔ x = 122.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 126.2+126.2+122.2 = 125.2 µg/ml 0.125 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG5) Cách tính nồng độ protein có TG5 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.099 ➔ x = 98.2 µg/ml + Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml + Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 98.2+90.2+90.2 = 92.87 (µg/ml) 0.093 mg/ml ❖ Nồng độ protein trung bình có phân đoạn thơi giải [protein TB]thôi giải = 0.116 mg/ml Vậy ml dịch thơi giải có [protein] = 0.016 x = 0.58 mg ❖ Protein có dịch rửa (Flow-through) Cách tính nồng độ protein có dịch rửa tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.098 ➔ x = 97.2 (µg/ml) + Với OD = 0.090 ➔ x = 89.2 (µg/ml) + Với OD = 0.089 ➔ x = 88.2 (µg/ml) Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 97.2+89.2+88.2 = 91.53 (µg/ml) Vì mẫu pha lỗng 30 lần trước đo OD, nên nồng độ protein thực có ml dịch rửa là: [protein] dịch = ì 30 = 2746 (àg/ml) = 2.746 (mg/ml) Vậy ml dịch rửa có [protein] = 2.746 x = 13.73 mg Hoạt tính enzyme Dịch OD thử không - thử thật Enzyme thô trước tủa Pha lỗng 15 lần đo hoạt tính Enzyme tủa cồn Enzyme tủa muối Pha lỗng 50 lần đo hoạt tính Pha lỗng 50 lần đo hoạt tính Cơng thức tính hoạt tính enzyme × × (Cơng thức 1) Trong : X : Số mg tinh bột suy từ đường chuẩn v : Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme t : Thời gian enzyme phản ứng K : Hệ số pha loãng Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng ml, thời gian phản ứng 10 phút Dựa vào phương trình đường chuẩn tinh bột: y = 0.0231x + 0.0073 (phương trình 2) với R = 0.9812, ta tính hoạt tính enzyme có trong: ❖ Enzyme dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa) Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y phương trình Từ ta suy giá trị x tương ứng với lượng tinh bột có mẫu thử Thí nghiệm lặp lại lần, nên lượng tinh bột có mẫu thử tương đương với giá trị trung bình lần lặp lại + Với OD = 0.157 + Với OD = 0.167 + Với OD = 0.143 Suy giá trị trung bình lần lặp lại: ̅= 6.481+6.913+5.874 ➔ ➔ ➔ x = 6.481 mg x = 6.913 mg x = 5.874 mg = 6.423 mg Vì mẫu enzyme thơ pha lỗng 15 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase dịch ni cấy = 10 ×1 6.423 ×15 = 9.635 U ❖ Enzyme tủa cồn Cách tính hoạt tính enzyme mẫu sau tủa cồn tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.118 ➔ x = 4.792 mg + Với OD = 0.119 ➔ x = 4.835 mg + Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg 10 Suy giá trị trung bình lần lặp lại: ̅= 4.792+4.835+4.922 = 4.850 mg Vì mẫu enzyme sau tủa cồn pha lỗng 50 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính enzyme sau tủa cồn = ❖ Enzyme tủa muối Cách tính hoạt tính enzyme mẫu sau tủa muối tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.226 ➔ x = 9.468 mg + Với OD = 0.225 ➔ x = 9.424 mg + Với OD = 0.226 ➔ x = 9.468 mg Suy giá trị trung bình lần lặp lại: ̅= 9.468+9.424+9.468 = 9.453 mg Vì mẫu enzyme sau tủa muối pha loãng 50 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase sau tủa muối = 9.453×50 10×1 = 47.265 U Hoạt tính enzyme sau tinh sắc ký lực Dịch TG1 TG2 TG3 TG4 TG5 OD thử không - thử thật Pha lỗng 30 lần đo hoạt tính Pha lỗng 20 lần đo hoạt tính Pha lỗng 10 lần đo hoạt tính Pha lỗng lần đo hoạt tính Dịch rửa (5 ml) ❖ Hoạt tính amylase dịch thơi giải (TG1) Cách tính hoạt tính enzyme TG1 tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.161 ➔ x = 6.654 mg + Với OD = 0.161 ➔ x = 6.654 mg 11 + Với OD = 0.169 ➔ x = 7.0 mg Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 6.654+6.654+7.0 = 6.769 mg Vì mẫu enzyme TG1 pha lỗng 30 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase TG1 = ❖ Hoạt tính amylase dịch thơi giải (TG2) Cách tính hoạt tính enzyme TG2 tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.173 ➔ x = 7.173 mg + Với OD = 0.175 ➔ x = 7.260 mg + Với OD = 0.171 ➔ x = 7.090 mg Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 7.173+7.260+7.090 = 7.174 mg Vì mẫu enzyme TG1 pha lỗng 20 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase TG2 = 7.171×20 10 ×1 ❖ = 14.384 U Hoạt tính amylase dịch thơi giải (TG3) Cách tính hoạt tính enzyme TG3 tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg + Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg + Với OD = 0.129 ➔ x = 5.268 mg Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 4.922+4.922+5.268 = 5.037 mg Vì mẫu enzyme TG1 pha lỗng 10 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase TG3 = 5.037×10 10 ×1 ❖ = 5.037 U Hoạt tính amylase dịch thơi giải (TG4) Cách tính hoạt tính enzyme TG4 tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.157 ➔ x = 6.481 mg + Với OD = 0.167 ➔ x = 6.913 mg 12 + Với OD = 0.143 ➔ x = 5.874 mg Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 6.481+6.913+5.874 = 6.422 mg Vì mẫu enzyme TG1 pha lỗng lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase TG4 = ❖ Hoạt tính amylase dịch thơi giải (TG5) 422×5 10 ×1 = 3.211 U Cách tính hoạt tính enzyme TG5 tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.069 ➔ x = 2.671 mg + Với OD = 0.071 ➔ x = 2.758 mg + Với OD = 0.009 ➔ x = 0.074 mg Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 2.671+2.758+0.074 = 1.834 mg Dựa vào công thức ta được: Hoạt tính amylase TG5 = 834×1 10 ×1 = 0.183 U Hoạt tính chung phân đoạn giải = ổ ℎ = í 20.307 ℎ +ủ14.3845+ 5.037 ℎâ+ 3.211 đ + 0.183 ℎô ả 5 = 8.624 U ❖ Hoạt tính amylase dịch rửa (Flow-through) Cách tính hoạt tính enzyme dịch rửa tương tự cách tính hoạt tính enzyme có dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta lượng tinh bột tương ứng sau: + Với OD = 0.008 ➔ x = 0.030 mg + Với OD = 0.01 ➔ x = 0.117 mg + Với OD = 0.009 ➔ x = 0.074 mg Suy giá trị trung bình lần lập lại: ̅= 0.030+0.117+0.074 = 0.074 mg Dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase dịch rửa = 074×1 10 ×1 = 0.007 U 13 Fraction Dịch enzyme thô Enzyme sau tủa cồn Enzyme sau tủa muối Enzyme giải Enzyme dịch rửa ❖ Tính hoạt tính riêng Hoạt tính riêng = + + + + + ❖ Hoạt tính riêng dịch enzyme thơ = 237 Hoạt tính riêng enzyme sau tủa cồn = 9.635 112 Hoạt tính riêng enzyme sau tủa muối = 74 24.25 = 0.04 U/mg 87 = 0.215 U/mg 47 265 107 Hoạt tính riêng enzyme thơi giải = 624 58 Hoạt tính riêng enzyme dịch rửa = 007 13 73 = 0.44 U/mg = 14.87 U/mg = 0.0005 U/mg Tính độ tinh Độ tinh = Hoạt tính riêng enzyme sau tinh Hoạt tính riêng ban đầu + Độ tinh enzyme thô = + Độ tinh enzyme sau tủa cồn = = 5.375 + Độ tinh enzyme sau tủa muối = = 11 + Độ tinh enzyme giải = = 371.75 + Độ tinh enzyme dịch rửa = = 0.0125 0.215 0.04 44 04 14.87 0.04 0.0005 0.04 14 ❖ Tính hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme Hiệu suất thu hồi hoạt tính = Tổng hoạt tính enzyme có phân đoạn x 100 Tổng hoạt tính enzyme thơ + Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme thô = 100% 24 25 9.635 x 100 = 490.6% + Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn tủa cồn = + Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn tủa muối = + + ❖ 47.265 Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn giải = Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn dịch rửa= x 100 = 251.7% 9.635 624 635 007 635 x 100 = 89.5% x 100 = 0.07% Tính hiệu suất thu hồi protein Hiệu suất thu hồi protein = Tổng protein có phân đoạn x 100 Tổng protein dịch thô + Hiệu xuất thu hồi protein dịch enzyme thô = 100% + Hiệu xuất thu hồi protein phân đoạn tủa cồn = x 100 = 47.47% + Hiệu xuất thu hồi protein phân đoạn tủa muối = x 100 = 45.1% + Hiệu xuất thu hồi protein phân đoạn giải = x 100 = 0.24% + Hiệu xuất thu hồi protein phân đoạn dịch rửa = x 100 = 5.78% 112 87 237 74 107 237 74 237 0.58 74 13.73 237 74 Kết luận Fraction Dịch enzyme thô Enzyme sau tủa cồn Enzyme sau tủa muối Enzyme giải Enzyme dịch rửa Thể tích (ml) 100 10 10 5 Từ kết trên, ta thấy hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme phân đoạn sau tủa muối (đạt 490.6%) đạt cao phân đoạn khảo sát Trong đó, hiệu suất thu hồi protein hai phân đoạn tủa muối cồn tương đương nhau, 45.1% 47.47% Hoạt tính enzyme sau tủa cồn thấp sau tủa muối có mặt dung môi hữu (cồn) làm ảnh hưởng đến việc phục hồi hoạt tính sinh học tác động lên cấu trúc bậc ba enzyme làm chúng hoạt tính Điểm đáng ý là, hoạt tính riêng enzyme phân đoạn giải đạt cao phân đoạn khảo sát (14.86 U/mg), độ tinh enzyme phân đoạn gấp gần 372 lần so với enzyme thô Điều chứng tỏ rằng, phân đoạn thơi giải cho enzyme có hoạt tính riêng độ tinh cao Ngoài ra, đề xuất nhóm em sau thí nghiệm nên khảo sát nồng độ cồn giai đoạn tủa enzyme Thực thêm thí nghiệm chạy SDS-PAGE để khẳng định xác hoạt tính riêng hiệu suất thu hồi enzyme, protein tinh hồn tồn, khơng lẫn hợp chất khác 16 ... 0.0005 0.04 14 ❖ Tính hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme Hiệu suất thu hồi hoạt tính = Tổng hoạt tính enzyme có phân đoạn x 100 Tổng hoạt tính enzyme thơ + Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme thơ =... Vì mẫu enzyme TG1 pha lỗng 30 lần, dựa vào cơng thức ta được: Hoạt tính amylase TG1 = ❖ Hoạt tính amylase dịch thơi giải (TG2) Cách tính hoạt tính enzyme TG2 tương tự cách tính hoạt tính enzyme. .. 107 Hoạt tính riêng enzyme thơi giải = 624 58 Hoạt tính riêng enzyme dịch rửa = 007 13 73 = 0.44 U/mg = 14.87 U/mg = 0.0005 U/mg Tính độ tinh Độ tinh = Hoạt tính riêng enzyme sau tinh Hoạt tính