BÁO cáo THỰC tập hóa SINH học TINH SẠCH và xác ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN HỨA TRƯỜNG CHINH - MSHV: 20C61005 TỪ KHỞI THÀNH - MSHV: 20C61012 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE TÁI TỔ HỢP BÁO CÁO THỰC TẬP HĨA SINH HỌC Ngành: Hóa sinh học Mã số ngành: 8420116 GVHD: TS Trần Quốc Tuấn TP Hồ Chí Minh - Năm 2021 Mục lục Tiến hành thínghiệm Tinh sạchAmylasetái tổ hợp sắc kí lực Ni2+-NTA agarose .3 Kết Kết luận 15 Tiến hành thí nghiệm - Ly tâm 100 ml dịch khuẩn tốc độ 7000 vòng/phút, 10 0C 10 phút để thu dịch enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào - Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối 50ml tủa dung môi hữu - Định hoạt tính enzyme hàm lượng protein dịch enzyme ban đầu (trước tủa) - mẫu tủa ly tâm, thu tủa hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa) Xác định hoạt tính enzyme hàm lượng protein dịch enzyme sau tủa - Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sắc ký lực Tinh Amylase tái tổ hợp sắc kí lực Ni2+-NTA agarose Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị cột - Nhồi lớp bơng thủy tinh có độ dày khoảng mm vào ống tiêm ml (Lưu ý: bề mặt lớp phẳng) - Đặt lớp giấy lọc lên cột - Cố định cột lên giá đỡ nối dây truyền dịch với cột - Rửa cột với ml đệm chiết tách, lặp lại lần Cân Ni2+-NTA agarose - Cho 500 pl dịch Ni2+-NTA agarose vào tube 1,5 ml; ly tâm 13000 vòng/phút phút 40C, loại bỏ dịch - Huyền phù tủa ml đệm chiết tách, ly tâm 13000 vòng/phút phút 0C, loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước thực lần Tinh protein - Trộn ml dịch enzyme sau tủa với Ni2+-NTA agarose cân chuẩn bị bước trên, lắc 40C - Sau giờ, cho toàn hỗn hợp protein Ni 2+-NTA agarose lên cột thu dịch qua cột (FT - flow-through), để ổn định cột 10 phút - Rửa phức hợp protein gắn với Ni 2+-NTA agarose với ml đệm rửa Thu nhận dịch rửa giải Xác định hoạt tính hàm lượng protein dịch rửa - Thôi giải protein mục tiêu với ml đệm giải, lăp lại lần Thu nhận phân đoạn protein giải bảo quản nhiệt độ lạnh Xác định hoạt tính hàm lượng protein phân đoạn 3 Kết Nồng độ (pg/ml) OD1 OD2 OD3 Đường chuẩn Bradford 10 20 0.075 0.086 0.099 30 0.107 0.117 50 0.128 0.075 0.087 0.097 0.107 0.119 0.126 0.076 0.087 0.099 0.109 0.116 0.129 40 Từ kết thu nhận được, ta nhận thấy nồng độ pg/ml protein ghi nhận giá trị OD, điều không với lý thuyết Nên giá trị OD nồng độ pg/ml protein hiệu chỉnh 0, giá trị OD nồng độ khác hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2 trừ cho 0.075 nồng độ khảo sát; giá trị OD3 trừ cho 0.076 nồng độ khảo sát) Từ tính tốn AOD lần lập lại, ta kết bảng sau: Nồng độ (pg/ml) 10 20 30 40 50 OD1 0.011 0.024 0.03 0.042 0.053 OD2 0.012 0.022 0.03 0.044 0.051 OD3 AOD 0 0.011 0.011 0.03 0.023 0.023 0.03 0.040 0.042 0.053 0.052 Xây dựng đường chuẩn protein 2 0.053 0.054 0.055 0.119 0.112 0.111 0.161 0.161 0.160 0.207 0.206 0.203 0.227 0.228 0.221 10 0.302 0.305 0.300 Đường chuẩn tinh bột Nồng độ (mg/ml) OD1 OD2 OD3 Tương tự trên, từ giá trị OD ghi nhận được, ta nhận thấy nồng độ pg/ml tinh bột ghi nhận giá trị OD, điều không với lý thuyết Nên giá trị OD nồng độ pg/ml tinh bột hiệu chỉnh 0, giá trị OD nồng độ khác hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2, OD3 trừ cho giá trị tương ứng 0.053, 0.054 0.055 nồng độ khảo sát) Từ tính tốn AOD lần lập lại, ta kết bảng sau: Nồng độ (mg/ml) OD1 0.066 0.108 OD2 0.058 0.107 OD3 AOD 0 0.056 0.060 Xây dựng đường chuẩn tinh bột 10 0.15 0.174 0.249 0.15 0.174 0.251 0.14 0.105 0.107 0.15 0.166 0.171 0.245 0.248 Dịch Enzyme thô trước tủa Enzyme tủa cồn Enzyme tủa muối OD 595nm 0.118 0.12 0.118 0.112 0.108 0.11 0.121 0.111 0.106 Nồng độ protein Dựa vào phương trình đường chuẩn protein: y = 0.001x + 0.0008 (phương trình 1) với R2 = 0.9983, ta tính nồng độ protein có trong: ❖ Protein dịch ni cấy (enzyme thơ trước tủa) Pha lỗng 20 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein Pha lỗng 100 lần đo protein Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y phương trình Từ ta suy giá trị x tương ứng với nồng độ protein có mẫu thử Thí nghiệm lặp lại lần, nên nồng độ protein có mẫu thử tương đương với giá trị trung bình lần lặp lại + Với OD = 0.118^ x= 117.2 gg/ml + Với OD = 0.120■*x= 119.2 gg/ml + Với OD = 0.121■*x=120.2 gg/ml 117.2 + 119.2 + 120.2 , , Suy giá trị trung bình lần lặp lại: X = -= 118.87 pg/ml Vì mẫu pha loãng 20 lần trước đo OD, nên [protein] = X X 20 = 2377.4 pg/ml = 2.3734 mg/ml Vậy 100 ml dịch ni cấy có: [protein] dịch enzyme thô = 2.3774 X 100 = 237.34 mg ❖ Protein sau tủa cồn Cách tính nồng độ protein dịch enzyme sau tủa cồn tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.118 ^ x= 117.2 gg/ml + Với OD = 0.112 ^ x= 111.2 gg/ml + Với OD = 0.111 ^ x= 110.2 gg/ml 117.2+111.2+110.2 Suy giá trị trung bình củapg/ml lần lập lại: X = 112.87 = Vì mẫu pha loãng 100 lần trước đo OD, nên nồng độ protein thực có ml mẫu sau tủa cồn là: [protein]sau tủa cồn = X X 100 = 11287 pg = 11.287 mg Suy 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein]sau tủa cồn = 11.287 X 10 = 112.87 mg ❖ Protein sau tủa muối Cách tính nồng độ protein dịch enzyme sau tủa muối tương tự phần dịch ni cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD =0.108 +x = 107.2 pg/ml + Với OD =0.110 +x = 109.2 pg/ml + Với OD =0.106 +x = 105.2 pg/ml Suy giá trị trung bình lần lập lại: X = 107.2 + 109.2 + 105.2 — = 107.2 gg/ml Vì mẫu pha loãng 100 lần trước đo OD, nên nồng độ protein thực có ml mẫu sau tủa cồn là: [protein]sau tủa muối = X X 100 = 10720 gg = 10.72 mg Suy 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein]sau tủa muối = 10.72 X 10 = 107.2 mg ❖ Protein có dịch thơi giải (TG1) Cách tính nồng độ protein có TG1 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD=0.118 + x=117.2 (pg/ml) + Với OD=0.120 ■* x=119.2 (pg/ml) + Với OD=0.121 ■* x=120.2 (pg/ml) 117.2+119.2+120.2 Suy giá trị trung 118.87 bình lần lập lại: X = (gg/ml) » 0.119 mg/ml = ❖ Protein có dịch thơi giải (TG2) Cách tính nồng độ protein có TG2 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.113 ■* x= 112.2pg/ml + Với OD = 0.115 ■* x= 114.2pg/ml) + Với OD = 0.111 ■* x= 110.2pg/ml , 112.2 + 114.2 + 110.2 Suy giá trị trung bình lần lập lại: X — - = 112.2 pg/ml « 0.112 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG3) Cách tính nồng độ protein có TG3 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.139+ x = 138.2 pg/ml + Với OD = 0.131■*x = 130.2 pg/ml + Với OD = 0.129■*x = 128.2 pg/ml , ,.^ 138.2+130.2+128.2 „_ ,, Suy giá trị trung bình lần lập lại: X — -— 132.2 pg/ml » 0.132 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG4) Cách tính nồng độ protein có TG4 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.127 ^ x = 126.2 pg/ml + Với OD = 0.127 ^ x = 126.2 pg/ml + Với OD = 0.123 ^ x = 122.2 pg/ml , ,.^ 126.2+126.2+122.2 ,, Suy giá trị trung bình lần lập lại: X — -— 125.2 pg/ml » 0.125 mg/ml ❖ Protein có dịch thơi giải (TG5) Cách tính nồng độ protein có TG5 tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.099 ^ x = 98.2 pg/ml + Với OD = 0.091 + x = 90.2 gg/ml + Với OD = 0.091 + x = 90.2 pg/ml 98.2+90.2+90.2 Suy giá trị trung bình lần lập lại: X = -= 92.87 (gg/ml) « 0.093 mg/ml ❖ Nồng độ protein trung bình có phân đoạn thơi giải TG1+TG2+TG3+TG4+TG5 118.87+112.2 + 132.2+125.2 + 92.87 [protein TB]thôi giải = -= -= 116.27 gg/ml a 0.116 mg/ml Vậy ml dịch thơi giải có [protein] = 0.016 x = 0.58 mg ❖ Protein có dịch rửa (Flow-through) Cách tính nồng độ protein có dịch rửa tương tự phần dịch nuôi cấy, giá trị OD vào phương trình ta được: + Với OD = 0.098 ^ x= 97.2 (pg/ml) + Với OD = 0.090 ^ x= 89.2 (pg/ml) + Với OD = 0.089 ^ x= 88.2 (pg/ml) Suy giá trị trung bình lần lập lại: X = 97.2+89.2 + 88.2 -= 91.53 (gg/ml) Vì mẫu pha lỗng 30 lần trước đo OD, nên nồng độ protein thực có ml dịch rửa là: [protein]dịch rửa = X X 30 = 2746 (gg/ml) = 2.746 (mg/ml) Vậy ml dịch rửa có [protein] = 2.746 x = 13.73 mg Hoạt tính enzyme Dịch Enzyme thô trước tủa Enzyme tủa cồn Enzyme tủa muối OD thử không - thử thật 0.1 0.1 0.167 57 0.1 0.119 43 0.1 18 0.2 0.225 21 0.2 26 26 + Với OD =0.121 ^ x = 4.922 mg Pha lỗng 15 lần đo hoạt tính Pha lỗng 50 lần đo hoạt tính Pha lỗng 50 lần đo hoạt tính Cơng thức tính hoạt tính enzyme XXK tXV (Cơng thức 1) Trong : X : Số mg tinh bột suy từ đường chuẩn v : Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme t : Thời gian enzyme phản ứng K : Hệ số pha lỗng Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng ml, thời gian phản ứng 10 phút Dựa vào phương trình đường chuẩn tinh bột: y = 0.0231x + 0.0073 (phương trình 2) với R2 = 0.9812, ta tính hoạt tính enzyme có trong: ❖ Enzyme dịch ni cấy (enzyme thơ trước tủa) Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y phương trình Từ ta suy giá trị x tương ứng với lượng tinh bột có mẫu thử Thí nghiệm lặp lại lần, nên lượng tinh bột có mẫu thử tương đương với giá trị trung bình lần lặp lại + Với OD =0.157 ^ x = 6.481mg + Với OD =0.167 ^ x = 6.913mg 1 ... hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa) Xác định hoạt tính enzyme hàm lượng protein dịch enzyme sau tủa - Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sắc ký lực Tinh Amylase tái tổ hợp sắc kí lực Ni2+-NTA... lần đo hoạt tính Pha lỗng 50 lần đo hoạt tính Pha lỗng 50 lần đo hoạt tính Cơng thức tính hoạt tính enzyme XXK tXV (Cơng thức 1) Trong : X : Số mg tinh bột suy từ đường chuẩn v : Thể tích enzyme. .. cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme t : Thời gian enzyme phản ứng K : Hệ số pha lỗng Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng ml, thời gian phản ứng 10 phút Dựa vào phương trình đường chuẩn tinh