Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng ức vi sinh vật của cây lá lốt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HCM KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HỐ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC VI SINH VẬT CỦA CÂY LÁ LỐT Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS TRẦN NGUYỄN MINH ÂN PGS.TS LÊ TIẾN DŨNG Sinh viên thực hiện: PHẠM TUẤN ANH MSSV: 18081861 Lớp: DHHC14B Khoá: 2018 – 2022 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP.HCM KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC VI SINH VẬT CỦA CÂY LÁ LỐT Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS TRẦN NGUYỄN MINH ÂN PGS.TS LÊ TIẾN DŨNG Sinh viên thực hiện: PHẠM TUẤN ANH MSSV: 18081861 Lớp: DHHO13 Khoá: 2018 – 2022 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2021 i TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHIỆP TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC BỘ MƠN MÁY & THIẾT BỊ - // - CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự - Hạnh phúc - // - NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: PHẠM TUẤN ANH MSSV: 18081861 Lớp: DHHC14B Chun ngành: CƠNG NGHỆ KỸ THUẬT HỐ HỌC Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC VI SINH VẬT CỦA CÂY LÁ LỐT Nhiệm vụ: − Điều chiết cao phân đoạn − Phân lập xác định cấu trúc hợp chất − Thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết phân đoạn Ngày giao nhiệm vụ đề tài: 25/09/2021 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 14/11/2021 Họ tên người hướng dẫn : PGS-TS.TRẦN NGUYỄN MINH ÂN PGS-TS.LÊ TIẾN DŨNG TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2021 Chủ nhiệm môn GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Chuyên ngành Trần Nguyễn Minh Ân ii LỜI CẢM ƠN Lời em xin cảm ơn đến tất q thầy Khoa Kỹ Thuật Hố Học Trường Đại học Cơng Nghiệp Hồ Chí Minh tận tình bảo, truyền đạt kỹ cần thiết, kinh nghiệm q báu, bên cạnh cịn hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực đề tài Thứ hai, em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Nguyễn Minh Ân PGS.TS Lê Tiến Dũng thầy truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích, hướng dẫn tận tình, chia sẻ kinh nghiệm, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực đề tài Thứ ba, em cảm ơn anh chị, bạn sinh viên, học viên phịng thí nghiệm Hóa sinh dược Viện Vật liệu ứng dụng - Viên Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ em suốt tháng thực đề tài Và cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình lúc động viên,chia sẻ, tin tưởng, giúp em có thêm động lực để học tập thực đề tài Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi thiếu sót Nên em mong nhận góp ý thầy người để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! iii NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Phần đánh giá:(thang điểm 10) • • • • Thái độ thực Nội dung thực Kỹ trình bày Tổng hợp kết Điểm số:… Điểm chữ………………………………………………… TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2021 TRƯỞNG BỘ MÔN GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Chuyên ngành Trần Nguyễn Minh Ân iv NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN TP.Hồ Chí Minh, ngày …tháng…năm 2021 Giảng viên phản biện (Ký ghi họ tên) v Mục lục CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Giới thiệu lốt (Piper CD.C) 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Phân bố 1.2.3 Vị trí phân loại 1.2.4 Điều kiện sinh trưởng 1.2.5 Đặc tính thực vật 1.2.6 Thành phần hoá học 1.2.7 Công dụng 10 1.3 Hoạt tính sinh học 10 1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 10 1.3.2 Hoạt tính kháng viêm 10 1.3.3 Hoạt tính kháng oxi hố 11 1.4 Sàng lọc ảo in silico 11 1.5 Phương pháp docking phân tử 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Mục tiêu đề tài 13 2.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Nội dung nghiên cứu 13 2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Phương pháp cô lập tinh chế hợp chất hữu 13 2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 16 2.4.3 Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha loãng 17 2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 18 2.4.5 Phương pháp Docking phân tử phần mềm Autodock 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 21 3.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất 21 3.1.1 Nguyên liệu 21 3.1.2 Dụng cụ 21 vi 3.1.3 Hoá chất 21 3.2 Xử lý nguyên liệu ban đầu 21 3.3 Phân lập tinh chế hợp chất từ lốt 22 3.3.1 Phân chia cao tổng thành cao phân đoạn 22 3.3.2 Khảo sát cao Ety Axetat 22 3.3.3 Khảo sát phân đoạn PLEA8 25 3.3.4 Khảo sát phân đoạn PLEA816 26 3.3.5 Khảo sát phân đoạn PLEA8169 27 3.3.6 Khảo sát phân đoạn PLEA81695 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn 30 4.2 Hoạt tính kháng viêm 31 4.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 32 4.3.1 Cấu trúc hợp chất APL-2 32 4.3.2 Cấu trúc hợp chất APL-4 35 4.4 Kết docking APL-2 VÀ APL-4 38 4.5 ADMET 42 4.5.1 Đặc tính hoá lý thuốc 42 4.5.2 Tính dược học thuốc 43 4.5.3 Tính hấp thụ 44 4.5.4 Tính phân phối 45 4.5.5 Trao đổi chất 46 4.5.6 Độc tính thuốc 47 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Lá lốt (Piper lolot C DC.) Hình 1.2 Các hợp chất có dịch chiết lốt Hình 2.1 Ngâm dầm lốt với dung môi ethanol 96o 14 Hình 2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 14 Hình 2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế 16 Hình 2.4 Phương pháp định lượng kháng sinh vi pha lỗng 18 Hình 2.5 Quy trình docking thuốc (ligand) đến DNA protein 20 Hình 3.1 Mẫu lốt tươi thu hái huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang 21 Hình 3.2 Quy trình xử lý nguyên liệu ban đầu 22 Hình 3.3 Quy trình phân chia cao tổng thành cao phân đoạn 22 Hình 3.4 Sắc kí lớp mỏng (TLC) cao EA với hệ dung mơi 23 Hình 3.5 Quy trình phân lập cao Ea 24 Hình 3.6 TLC phân đoạn phân lập từ cao Ea 24 Hình 3.7 TLC phân đoạn PLEA8 với hệ dung môi 25 Hình 3.8 Quy trình trình phân lập PLEA8 26 Hình 3.9 Quy trình phân lập PLEA816 27 Hình 3.10 Quy trình phân lập PLEA8169 28 Hình 3.11 TLC khảo sát PLEA81695 28 Hình 3.12 TLC chất APL-2 29 Hình 3.13 TLC chất APL-4 29 Hình 4.2 Khảo sát độc tính tế bào 31 Hình 4.3 Đánh giá khả ức chế tiết NO cao chiết tế bào RAW 264.7 31 Hình 4.4.Tương quan HMBC hợp chất APL-2 33 Hình 4.6 Tương quan HMBC hợp chất APL4 36 Hình 4.9 Các liên kết Hydro hình thành amino acid chuỗi xoắn X với nguyên tử hoạt tính ligand cấu dạng bền nhất, ligand (pose 404) 38 Hình 4.10 Các tương tác ligand quan trọng hình thành amino acid hoạt tính nguyên tử hoạt đông ligand cấu dạng bền nhất, (docking pose 404/500) trình bày sơ đồ 2D 39 Hình 4.11 Bản đồ ligand trình bày tương tác thứ cấp amino acid DNA protein với vị trí hoạt động ligand sơ đồ 2D gồm tương tác Hydrogen viii (đường màu xanh) tương tác lập thể (đường màu nâu đỏ), tương tác phủ lấp đường tròn màu xanh 39 Hình 4.12 Các liên kết Hydro hình thành amino acid chuỗi xoắn X với nguyên tử hoạt tính ligand cấu dạng bền nhất, ligand (pose 460) 40 Hình 4.13 Các tương tác ligand quan trọng hình thành amino acid hoạt tính nguyên tử hoạt đông ligand cấu dạng bền nhất, (docking pose 460/500) trình bày sơ đồ 2D 40 Hình 4.14 Bản đồ ligand trình bày tương tác thứ cấp amino acid DNA protein với vị trí hoạt động ligand sơ đồ 2D gồm tương tác Hydrogen (đường màu xanh) tương tác lập thể (đường màu nâu đỏ), tương tác phủ lấp đường tròn màu xanh 41 Hình S.1 Phổ 1H - NMR APL-2 54 Hình S.2 Phổ 13C - NMR APL-2 55 Hình S.3 Phổ DEPT - NMR APL-2 56 Hình S.4 Phổ HMBC - NMR APL-2 57 Hình S.5 Phổ HSQC - NMR APL-2 58 Hình S.6 Phổ 1H - NMR APL-4 59 Hình S.7 Phổ 13C - NMR APL-4 60 Hình S.8 Phổ HMBC - NMR APL-4 61 Hình S.9 Phổ HSQC - NMR APL-4 62 48 Property Ăn mòn mắt Value APL-2 APL-4 0.964 0.986 Comment Loại 1: chất ăn mịn; Loại 0: khơng ăn mịn; Giá trị đầu xác suất chất ăn mòn Kích ức mắt 0.991 0.993 Loại 1: chất gây kích ứng; Loại 0: khơng gây kích ứng; Giá trị đầu xác suất có chất kích thích Độc tính đường hô hấp 0.961 0.973 Loại 1: chất độc đường hô hấp; Loại 0:chất không hại đường hô hấp; Giá trị đầu xác suất độc hại Nhận xét Hợp chất APL-2 APL-4 có giá trị hERG Blockers 0.04 0.033 điều cho thấy múc độ gây độc với tim hai chất tương đối thấp Chỉ số H-HT 0.019 0.03 giá trị cho thấy hai hợp chất có mức độ gây độc gan thấp Chỉ số DILI 0.033 0.03 giá trị dự đốn thuốc khơng gây tổn hại đến gan Chỉ số AMES Toxicity 0.072 0.046 giá trị cho thấy hai không gây biến đổi Gen độc tính chuột hai chất dự đoán thấp với giá trị ROAT 0.028 0.054 mức độ gây nhạy cảm với da mức thấp thấp APL-2 mức trung bình với APL-4 Khả gây ung thư hợp hai hợp chất mức thấp Tuy nhiên hai dự đoán gây tổn hại đến mắt 49 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đối chiếu với nhiệm vụ đặt ra, đề tài bước đầu xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kháng viêm cao chiết lốt đồng thời phân lập xác định cấu trúc hai chất Axit Vanillic (APL-2) 4-hydroxy benzaldehyde (APL-4) 5.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn nên chúng tơi dừng lại mức độ phân tích định danh hợp chất từ cao ethyl acetate lốt Để phát triển mở rộng đề tài nghiên cứu này, chúng tơi có số kiến nghị sau: − Tiến hành nghiên cứu thêm thành phần hóa học hoạt tính sinh học khác từ phân đoạn cao ethyl acetate cao khác từ lốt − Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kháng viêm hợp chất phân lập 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Jussi-Pekka Rauha, Susanna Remes, Marina Heinonen, Anu Hopia, Marja Kahkonen, Tytti Kujala, Kalevi Pihlaja, Heikki Vuorela, Pia Vuorela, (2000) “Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compounds”, International Journal of Food Microbiology, 56, 3-12 [2] Huda Jasim Altameme, Imad Hadi Hameed, Muhanned Abdulhasan Kareem, (2015) “Analysis of alkaloid phytochemical compounds in the ethanolic extract of Datura stramonium and evaluation of antimicrobial activity”, African Journal of Biotechnology, Vol 14(19), pp 1668-1674 [3] M Benziane Maatalah, N Kambuche Bouzidi, S Bellahouel, B Merah, Z Fortas, R Soulimani, S Saidi, A Derdour, (2012) “Antimicrobial activity of the alkaloids and saponin extracts of Anabasis articulata”, E3 Journal of Biotechnology and Pharmaceutical Research, Vol 3(3), pp 54-57 [4] Hoàng Việt Dũng, Đỗ Qun, Nguyễn Minh Chính, Hà Minh Tâm, Tơ Đào Cường (2013), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase loài tiêu mỏng (Piper hymenophyllum Miq., chi Piper L., họ Piperaceae)”, Tạp chí Dược học, tập 449, số 01/2013, tr.18-21 [5] Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thanh, Tạ Thi Khôi, Piper A Leclercq, (2013) “Compositional analysis of the leaf, stem and rhizome oils of Piper lolot C DC from Vietnam”, Journal of Essential Oil Research, 8, 649-652 [6] Võ Văn Chi, Dương Ðức Tiến, (1978) “Phân loại thực vật bậc cao”, Nhà xuất Ðại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, tr [7] Nguyễn Văn Đàn, (1999) “Cây thuốc Việt Nam”, NXB Khoa học kĩ thuật Hà Nội, trang 174 [8] Phạm Hoàng Hộ, (1999) “Cây cỏ Việt Nam”, NXB trẻ 1, trang 288 51 [9] B Burke, M Nair, (1986) “Phenylpropene, Benzoic Acid And Flavonoid Derivatives From Fruits Of Jamaican Piper Species”, Phytochemistry, Vol 25, No.6, pp.1427-1430 [10] Stephen A Ampofo, Vassilios Rousis, David F Wiemer, (1987) “New Prenylated Phenolics From Piper Auritum”, Phytochemistry, Vol 26, No 8, pp 2367-2370 [11] Sanjay J Desai, Bharathi R Prabhu, Newand B Mulchandani, (1988) “AristolacTams And 4,5-Dioxoaporphines from Piper Longum”, Phytochemistry, Vol 29, No 5, pp 1511-1515 [12] S K Koul, S C Taneja, V K Agarwal, K L Dhar, (1988) “Minor Amides of Piper Species”, Phytochemistry, Vol 27, No 11, pp 3523-3527 [13] Sanjayk Singh, Ashokk Prasad, Carle Olsen, Amitabhjha, Subhashc Jain, Virinders Parmar, Jesperwengel, (1996) “Neoligans And Alkaloids From Piper Argyrophylum”, Phytochemistry, Vol 43, No 6, pp 1355-1360 [14] Craig D Dodson, Lee A Dyer, Justin Searcy, Zane Wright, Deborah K Letourneau, (2000) “Cenocladamide, a dihydropyridone alkaloid from Piper Cenocladum”, Phytochemistry, 53, 51-54 [15] Ninoska Flores, Ignacio A Jime nez, Alberto Gime nez, Grace Ruiz, David Gutie rrez, Genevieve Bourdy, Isabel L Bazzocchi, (2008) “Benzoic Acid Derivatives from Piper Species and Their Antiparasitic Activity”, Journal of Natural Products, Vol 71, No 9, 1838-1543 [16] Kooi-Mow Sim, Choon-Ngo Mak, Li-Ping Ho, (2009) “A new amide alkaloid from the leaves of Piper sarmentosum”, Journal of Asian Natural Products Research, Vol 11, No 8, 757-760 [17] Candy Ruiz, Mohamed Haddad, Joaquina Alban, Gennieve Buordy, Ricardo Reategui, Denis Castillo, Michel Sauvain, Eric Deharo, Yannick Estevez, Jorge Arevalo, Rosario Rojas, (2011) “Activity-guided Isolation of Antileishmanial Compounds from Piper Hispidum, PhytochemistryLetters, 4, 363-366 52 [18] Thanakorn Damsud, Sirichai Adisakwattana, Preecha Phuwapraisirian, (2013) “Three new phenylpropanol amides from the leaves of Piper sarmentosum and their α-glucosidase inhibitory activities”, Phytochemistry Letters, 6, 350-354 [19] Nguyễn Xuân Dũng., Lê Thanh, Tạ Thị Khôi, Piet A Leclercq (1996) Compositional analysis of the leaf, stem and rhizome oils of Piper lolot C DC from Vietnam Journal of Essential Oil Research, 8:6, 649-652 [20] Đặng Thị Thanh Nhàn, (2013) “Nghiên cứu thành phần hoá học lốt (Piper sarmentosum Roxb.) tỉnh Thừa Thiên Huế”, Tạp chí khoa học giáo dục, trường đại học sư phạm Huế, 1859-1612 [21] Đỗ Tất Lợi, (2007) “Những Cây Thuốc Vị Thuốc Việt Nam”, Nhà xuất Thời Thời Đại [22] Huỳnh Kim Diệu, Nguyễn Thành Văn, (2011) “Sự Thuần Chủng Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Cây Trầu Không (Piper Betle) Cây Lốt (Piper Lolot) Đồng Bằng Sơng Cửu Long”, Tạp chí Khoa Học, 282-288 [23] Wibool Ridtitid, Peerati Ruangsang, Wantana Reanmongkol, Malinee Wongnawa, (2007) “Studies of the anti-inflammatory and antipyretic activities of the methanolic extract of Piper sarmentosum Roxb leaves in rats”, Songklanakarin J Sci Technol., Vol 29, No 6, 1519-1526 [24] Nguyễn Xuân Duy, Hồ Bá Vương, (2013) “Hoạt Tính Chống Oxi Hoá Và Ức Chế Enzyme Polyphenoloxidase số loại thực vật ăn Việt Nam”, Tạp chí Khoa Học Phát Triển, Số 3, 364-372 [25] Hứa Thị Toàn, Nguyễn Thị Thuỷ, Trương Đức Cường, (2017) “Công Nghệ Sàng Lọc Ảo, Docking Protein Một Số Ứng Dụng Tiêu Biểu”, Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ, 106(09), 29-32 [26] Thi Bich Ngoc Dao, Truong Minh Chi Nguyen, Van Quy Nguyen, Thi Minh Dinh Tran, Nguyen Minh An Tran, Chuong Hoang Nguyen, Thi Hoai Thu Nguyễn, Huu Hung Nguyen, Jirapast Sichaem, Cong Luan Tran, Thuc Huy Duong, (2021) “Flavones from Combretum quadrangulare Growing in Vietnam and Their AlphaGlucosidase Inhibitorty Activity”, Molecules, 26, 2531-2546 53 [27] Thuy Trang Nguyen, Thi Thuy Dung Nguyen, Tuong Kha Vo, Nguyen Minh An Tran, Minh Kim Nguyen, Toi Van Vo, Giau Van Vo, (2021) “Nanotechnology-based drug delivery for central nervours system disorders”, Biomedicine & Pharmacotherapy, 143, 112-117 [28] Zhang, H J., Wang, X Z., Cao, Q., Gong, G H & Quan, Z S, (2017), “Design, synthesis, anti-inflammatory activity, and molecular docking studies of perimidine derivatives containing triazole”, Bioorganic Med Chem Lett 27, 4409–4414 [29] Eze, F U., Okoro, U C., Ugwu, D I & Okafor, S N, (2019) “Biological Activity Evaluation of Some New Benzenesulphonamide Derivatives” Front Chem 7, 1–12 [30] Meng, X Y., Zhang, H X., Mezei, M., & Cui, M, (2011) “Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery Current computer-aided drug design”, Curr Comput Aided Drug Des 7, 146–157 [31] Florence Uchenna Eze, Uchechukwu Christopher Okoro, David Izuchukwu Ugwu, Sunday N Okafor, (2019) “Biological Activity Evaluation of Some New Benzenesulphonamide Derivatives”, Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, Volume 7, Article 634 54 PHỤ LỤC Hình S.1 Phổ 1H - NMR APL-2 55 Hình S.2 Phổ 13C - NMR APL-2 56 Hình S.3 Phổ DEPT - NMR APL-2 57 Hình S.4 Phổ HMBC - NMR APL-2 58 Hình S.5 Phổ HSQC - NMR APL-2 59 Hình S.6 Phổ 1H - NMR APL-4 60 Hình S.7 Phổ 13C - NMR APL-4 61 Hình S.8 Phổ HMBC - NMR APL-4 62 Hình S.9 Phổ HSQC - NMR APL-4