Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của một số loài thực vật định hướng nghiên cứu nguyên liệu có tiềm năng chống tăng đường huyết trên mô hình động vật

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Dƣơng Minh Trí ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, q thầy giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Nguyễn Ngọc Hồng, người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phịng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường anh chị, bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Tp Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 11 năm 2017 Dƣơng Minh Trí iii TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu để đánh giá hoạt tính chống oxy h a tiềm chống tăng đường huyết cao chiết ethanol từ 20 lồi thực vật Việt Nam Hoạt tính chống oxy h a phân tích qua phương pháp qu t gốc tự diphenyl- -picryl-hydrazyl FRAP ( erric Reducing cho thấy PPH - ntioxidant Power Kết mẫu cao chiết ethanol từ chôm chôm Nephelium lappaceum) ổi (Psidium guajava c hoạt tính chống oxy h a cao với giá trị I phương pháp PPH lần so với đối chứng ascor ic acid I 50 g ml 4,14 µg/ml, cao 2,51 lần 50 52 = 2,73 g ml Trong phương pháp R P giá trị chống oxy h a cao chiết chôm chôm chiết ổi 5794  42 μmol e2+ L giá trị ằng μmol e2+/L cao lần 51 lần so với ascorbic acid (11390 ± 98 μmol Fe2+ L Hàm lượng polyphenol tổng c chôm chôm ổi  8,45 mg GAE/g 150,47  6,49 mg G E g khô Hàm lượng flavonoid tổng số hai loại cao chiết chôm chôm ổi  0,81 mg RE/g 97,45  1,03 mg RE/g khô Sự ảnh hưởng cao chiết với liều thử 00-200mg.kg-1 mơ hình chuột tăng đường huyết cấp tính cho thấy chuột uống cao chiết ethanol từ chôm chôm ổi nồng độ 150mg.kg-1 thể trọng c nồng độ glucose máu giảm đáng kể so với nh m chứng tăng đường huyết tương đương với nh m chứng trắng ao chiết ethanol từ mẫu tiếp tục thử nghiệm mơ hình chuột tiểu đường type gây ởi streptozocin STZ kết cho thấy vào ngày thứ trình theo dõi cao chiết ethanol từ chôm chôm c hoạt tính tốt cao chiết từ ổi tương đương với nh m sử dụng thuốc trị tiểu đường glibenclamide (10mg.kg-1 thể trọng Những kết thu nghiên cứu chứng minh chôm chôm ổi nguồn chất chống oxy h a tự nhiên c tiềm làm ổn định đường huyết liều dùng phù hợp iv ABSTRACT The aim of the present study was to evaluate antioxidant activity and the antihyperglycemic potential of ethanolic extract from 20 plant species in Vietnam Antioxidant activity were tested on the 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay and the ferric reducing/antioxidant power assay (FRAP) The results revealed that the ethanolic extract of rambutan (Nephelium lappaceum) leaves and guava (Psidium guajava) leaves have high antioxidant activities which showed an IC50 values in the DPPH method respectively of 6,85 µg/ml and 4,14 µg/ml were 2,51 and 1,52 fold higher that of ascorbic acid (IC50 = 2,73 µg/ml) In FRAP method, the antioxidant values were 6428 ± μmol e2+/L of rambutan leaves extract and 5794  42 μmol Fe2+/L of 1mg/ml concentration of sample of guava leaves extract, this values by 0.56 fold and 0.51 fold than ascorbic acid 390 μmol e2+/L) Total phenolic content of rambutan and guava leaves with values were 168,73  8,45 mg GAE/g of dry weight and 150,47  6,49 mg GAE/g of dry weight Total flavonoid content of rambutan and guava leaves with values were 74,45  0,81 mg RE/g of dry weight and 97,45  1,03 mg RE/g of dry weight Effect of oral glucose tolerance of ethanol extract of leaves was examined with dose of 100-200mg.kg-1 based on the body weight, the result showed that the mice were fed ethanol extract of Nephelium lappaceum and Psidium guajava leaves with dose of 150mg.kg-1 body weight decreased serum glucose levels significantly when compared to high glucose control group and was equivalently when compared with that of normal mice control group The ethanol extracts from two samples were tested in type streptozocin induced diabetic mice The results showed that on day 21 of the test, ethanol extracts from rambutan leaves has a higher activity than guava leaves and was comparable to that used in the glibenclamide group (10mg.kg1 body weight) The results obtained in the present study demonstrated that Nephelium lappaceum leaves and Psidium guajava leaves are potential sources of v natural antioxidants, possibly be used for improvement of blood glucose at right dosage vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH .xii MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Gốc tự stress oxy hóa 1.1.1 Khái niệm gốc tự 1.1.2 Mối liên hệ stress oxy hóa bệnh tiểu đƣờng 1.2 Hợp chất polyphenol mối liên hệ với bệnh tiểu đƣờng 1.2.1 Ảnh hƣởng chất polyphenol lên hấp thụ glucose ruột 1.2.2 Ảnh hƣởng polyphenol lên chức tế bào β tuyến tụy 1.2.3 Ảnh hƣởng polyphenol lên chức gan để trì cân glucose nội mô 1.3 Sơ lƣợc bệnh tiểu đƣờng 10 1.3.1 Phân loại 10 1.3.2 Các yếu tố nguy dẫn đến bệnh tiểu đƣờng 12 1.3.3 Xét nghiệm hóa sinh chẩn đốn bệnh tiểu đƣờng 15 1.3.4 Chế độ dùng thuốc điều trị tiểu đƣờng 16 vii 1.3.5 Nghiên cứu điều trị tiểu đƣờng thảo dƣợc giới 18 1.3.6 Nghiên cứu điều trị tiểu đƣờng từ nguồn thực vật Việt Nam 19 1.3.7 Mơ hình chuột tiểu đƣờng 21 1.3.7.1 Mơ hình bệnh lý động vật thực nghiệm 21 1.3.7.2 Mơ hình tiểu đƣờng type 22 1.3.8 Tổng quan số nghiên cứu 25 1.3.8.1 Cây xoài 25 1.3.8.2 Cây chôm chôm 27 1.3.8.3 Cây núc nác 29 1.3.8.4 Cây ổi 30 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành đề tài 33 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 33 2.2.1 Nguyên liệu thực vật 33 2.2.2 Đối tƣợng động vật 36 2.2.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm 36 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Phƣơng pháp xử lý mẫu, tách chiết thu nhận cao chiết 39 2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá khả chống oxy hóa 39 2.3.2.1 Mơ hình qt gốc tự DPPH 39 2.3.2.2 Mơ hình FRAP 41 2.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số flavonoid tổng số 42 2.3.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số 43 2.3.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid tổng số 43 2.3.4 Phƣơng pháp đánh giá khả chống tăng đƣờng huyết 44 2.3.4.1 Xác định độc tính cấp 44 2.3.4.2 Khảo sát mơ hình in vivo chuột tăng đƣờng huyết cấp tính 45 2.3.4.3 Khảo sát mơ hình in vivo chuột gây tiểu đƣờng streptozocin 47 2.3.4.4 Phƣơng pháp định lƣợng glucose máu 50 viii 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Kết đánh giá khả chống oxy hóa 52 3.1.1 Mơ hình quét gốc tự DPPH 52 3.1.2 Mơ hình FRAP 56 3.2 Kết định lƣợng polyphenol tổng số flavonoid tổng số 60 3.2.1 Kết định lƣợng polyphenol tổng số 60 3.2.2 Kết định lƣợng flavonoid tổng số 61 3.3 Kết đánh giá khả chống tăng đƣờng huyết 63 3.3.1 Xác định độc tính cấp 63 3.3.2 Kết đánh giá khả điều hòa đƣờng huyết mẫu cao chiết mơ hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính 63 3.3.2.1 Khả điều hịa đƣờng huyết nhóm cao chiết từ Mangifera indica 64 3.3.2.2 Khả điều hịa đƣờng huyết nhóm cao chiết từ Nephelium lappaceum 65 3.3.2.3 Khả điều hịa đƣờng huyết nhóm cao chiết từ Psidium guajava 67 3.3.2.4 Khả điều hịa đƣờng huyết nhóm cao chiết từ Oroxylum indicum 69 3.3.2.5 Khả điều hịa đƣờng huyết nhóm mẫu cao chiết từ có hoạt tính chống oxy hóa tốt 71 3.3.3 Kết tạo mơ hình chuột tiểu đƣờng type STZ 73 3.3.4 Kết thử nghiệm khả ổn định đƣờng huyết mẫu mơ hình chuột tiểu đƣờng type 74 3.3.4.1 Kết khả ổn định đƣờng huyết mẫu mơ hình chuột tiểu đƣờng type vào ngày thứ 74 3.3.4.2 Kết khả ổn định đƣờng huyết mẫu mô hình chuột tiểu đƣờng type vào ngày thứ 75 ix 3.3.4.3 Kết khả ổn định đƣờng huyết mẫu mơ hình chuột tiểu đƣờng type vào ngày thứ 14 76 3.3.4.4 Kết khả ổn định đƣờng huyết mẫu mơ hình chuột tiểu đƣờng type vào ngày thứ 21 77 3.3.4.5 Kết khả ổn định đƣờng huyết mẫu mô hình chuột tiểu đƣờng type vào thời điểm 21 ngày thử nghiệm 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AGEs: advanced glycation endproducts DMSO: Dimethyl sulfoxyde DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EGCG: Epigallocatechin gallate FRAP: ferric reducing/antioxidant power G6PD: glucose-6 phosphate dehydrogenase G6Pase: glucose-6-phosphatase GAE: Gallic acid equivalent đương lượng gam acid gallic GSH-Px: glutathione peroxidase HbA1c: Glycosylated hemoglobin IC50: half maximal inhibitory concentration LDL: low density lipoprotein NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NO: nitric oxide RE: Rutin equivalent đương lượng gam rutin RNS: Reactive Nitrogen Species ROS: Reactive Oxygen Species SOD: superoxide dismutase STZ: streptozocin hay streptozotocin TPTZ: 2,4,6-tripyridyl-s-triazin PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase 95 Silink M., Kida K., Rosenbool A.L (2003), Type Diabetes in Childhood and Adolescence, Martin Dunitz, London Singh N and Rajini P S (2004) Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel Food chemistry, 85, 611-616 Srinivasan K, Ramarao K (2007), Animal models in type diabetes research: An overview, Indian J Med Res, 125, pp 451-472 Stanley M P, P.; Kamalakkannan, N Rutin improves glucose homeostasis in streptozotocin diabetic tissues by altering glycolytic and gluconeogenic enzymes J Biochem Mol Toxicol 2006, 20, 96-102 Subramaniam SS, Nair AG (1972) Flavonoids of the stem bark of Oroxylum indicum Curr Sci 41:62–3 Timsina B, Kilingar N (2015) Mango seeds: A potential source for the isolation of bioactive compounds with anti-cancer activity International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science 7(3):89-95 Torronen, R.; Sarkkinen, E.; Tapola, N.; Hautaniemi, E.; Kilpi, K.; Niskanen, L Berries modify the postprandial plasma glucose response to sucrose in healthy subjects Br J Nutr 2009, E-pub ahead of a printgric Food Chem 2007, 55, 99-105 Uusitupa, M Gene-diet interaction in relation to the prevention of obesity and type diabetes: Evidence from the Finnish Diabetes Prevention Study Nutr Metab Cardiovasc Dis 2005, 15, 225-233 U Palanisamy, T Manaharan, LL Teng, Ammu K.C Radhakrishnan, T Subramaniam, T Masilamani (2011a) Rambutan rind in the management of hyperglycemia Food Research International 44: 2278-2282 U Palanisamy, L.T Ling, T Manaharan and D Appleton, 2011b Rapid isolation of geraniin from Nephelium lappaceum rind waste and its anti-hyperglycemic activity Food Chem., 127: 21-27 Upaganlawar AB, Tende CR (2007) In vitro antioxidant activity of leaves of Oroxylum indicum Vent Biomed 2:300 96 Venkatesh S Reddy G Reddy YSR Sathyavathy 00 “Effect of Helicteres isora root extracts on glucose tolerance in glucose-induced hyperglycemic rats” Fitoterapia 75 364-367 Von Gadow Jou ert E and Hansmann 99 “ omparison of antioxidant activity of aspalanthin with that of orther plant phenols of Rooibos tea (Aspalathus linearis α-tocopherol BHT and BH ” Journal of Agricultural and Food Chemistry 45632-638 Yen G and uh P 99 “Scavenging effect of methanolic extracts of peanut hulls on free radical and active oxygen species” Agricultural and Food Chemistry 42(3) 629-632 Wadood N, Abmad N, Wadood A 2000 Effect of Mangifera indica on blood glucose and total lipid levels of normal and alloxan diabetic rabbits Pakistan Journal of Medical Research 39(4):142-145 Waheed A, Ahmad SI 2006 Clinical investigation of hypoglycemic effect of leaves of M indica in type-2 (NIDDM) diabetes mellitus Pakistan Journal of Pharmacology 23(2):13-18 Waltner-Law, M.E.; Wang, X.L.; Law, B.K.; Hall, R.K.; Nawano, M.; Granner, D.K Epigallocatechin gallate, a constituent of green tea, represses hepatic glucose production J Biol Chem 2002, 277, 34933-34940 Waterhouse, AL (2002) Determination of total phenolics Current protocols in food analytical chemistry Woisky, RG, Salatino, A (1998) Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control, Journal of apicultural research, 37(2), 99-105 Wolfram, S.; Raederstorff, D.; Preller, M.; Wang, Y.; Teixeira, S.R.; Riegger, C.; Weber, P Epigallocatechin gallate supplementation alleviates diabetes in rodents J Nutr 2006, 136, 2512-2518 97 Zaveri M, Khandhar A, Jain S (2008) Quantification of Baicalein, Chrysin, Biochanin-A and Ellagic acid in root bark of Oroxylum indicum by RP-HPLC with UV detection Eurasian J Anal Chem 3:245–57 Zaveri M, Jain S Hepatoprotective effect of root bark of Oroxylum indicum on carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatotoxicity in experimental animals [Last updated on 2009 Aug 08] Available from: http://www.biologyonline.org/articles/hepatoprotective-effect-root-bark-oroxylum.html PHỤ LỤC Xếp hạng mơ hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính theo Xồi (Mangifera indica) ‘CHI SO DUONG HUYET XOAI’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: GLU Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 282.0193556 56.4038711 Error 30 12.5050333 0.4168344 Corrected Total 35 294.5243889 135.31 F 282.0193556 56.4038711 135.31 F Model 279.4337556 55.8867511 Error 30 14.8402333 0.4946744 Corrected Total 35 294.2739889 112.98 F 279.4337556 55.8867511 ‘CHI SO DUONG HUYET’ 112.98 F Model 14 408.6194622 29.1871044 Error 75 32.2395333 0.4298604 Corrected Total 89 440.8589956 67.90 F 14 408.6194622 29.1871044 67.90 F Model 792.5354833 264.1784944 Error 20 57.2245000 Corrected Total 23 849.7599833 92.33 F 792.5354833 264.1784944 92.33 F Model 52.19684583 17.39894861 Error 20 40.40225000 Corrected Total 23 92.59909583 8.61 0.0007 2.02011250 R-Square Coeff Var Root MSE duonghuyet Mean 0.563686 18.06076 Source DF mau 1.421307 7.869583 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 52.19684583 17.39894861 8.61 0.0007 The SAS System The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for duonghuyet Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ 0.01 Alpha 20 Error Degrees of Freedom 2.020112 Error Mean Square Critical Value of Studentized Range 5.01776 Minimum Significant Difference 2.9115 Means with the same letter are not significantly different Tukey Grouping A Mean N mau 9.9233 OI 8.5117 CC 6.9883 Gliben 6.0550 trang A B A B B B B u