Nghiên cứu ảnh hưởng của thủy châm chế phẩm chứa nọc ong lên mô hình động vật gây viêm và thoái hóa khớp gối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ HỌC VIỆN Y DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM PHẠM VĂN THI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THỦY CHÂM CHẾ PHẨM CHỨA NỌC ONG TRÊN MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT GÂY VIÊM VÀ THỐI HĨA KHỚP GỐI LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 HỌC VIỆN Y DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM PHẠM VĂN THI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THỦY CHÂM CHẾ PHẨM CHỨA NỌC ONG TRÊN MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT GÂY VIÊM VÀ THỐI HĨA KHỚP GỐI LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Chuyên ngành: Y học cổ truyền Mã số: 8720115 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Lê Văn Quân TS Phạm Hồng Vân HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Sau năm học tập khóa cao học Học viện Y học cổ truyền Việt Nam, đến tơi hồn thành chƣơng trình học tập Với lịng biết ơn kính trọng xin chân thành cám ơn: - Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học Học viện Y Dƣợc học cổ truyền Việt Nam - Ban Giám đốc, Viện nghiên cứu Học viện Y Dƣợc học cổ truyền Việt Nam - Tập thể môn Sinh lý bệnh Học viện Qn Y giúp đỡ tơi tận tình để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ngƣời Thầy TS Lê Văn Quân TS Phạm Hồng Vân trực tiếp giúp đỡ, hƣớng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tận tâm dìu dắt tơi bƣớc hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tất Giáo sƣ, Phó giáo sƣ, Tiến sỹ Hội đồng: Là ngƣời thầy, Nhà khoa học dạy dỗ tơi suốt q trình học tập đóng góp cho tơi ý kiến q báu để tơi hồn thành bảo vệ thành cơng luận văn Cuối tơi xin dành tình cảm trân trọng cảm ơn gia đình, quan nơi công tác, anh chị em, bạn bè ngƣời ln quan tâm giúp đỡ tơi có đƣợc thành công ngày hôm Hà Nội, ngày tháng Học viên Phạm Văn Thi năm 2019 LỜI CAM ÐOAN Tôi Phạm Văn Thi, học viên cao học khóa 10 Học viện Y Dƣợc học cổ truyền Việt Nam, chuyên ngành Y học cổ truyền, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn Thầy TS Lê Văn Qn TS Phạm Hồng Vân Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác đƣợc công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, đƣợc xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Ngƣời viết cam đoan Phạm Văn Thi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CFA: complete Freund’s adjuvant NGF: Yếu tố phát triển thần kinh TGF beta: Yếu tố tăng trƣởng chuyển dạng beta MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh thối hóa khớp gối giới Error! Bookmark not defined 1.2 Sinh lý bệnh thối hóa khớp gối Error! Bookmark not defined 1.3 Các mơ hình thực nghiệm gây thối hóa khớp gối 1.3.1 Mơ hình thối hóa khớp ngun phát Error! Bookmark not defined 1.3.2 Mơ hình thối hóa khớp thứ phát Error! Bookmark not defined 1.4 Phƣơng pháp đánh giá đau vận động động vật thực nghiệm Error! Bookma 1.4.1 Phƣơng pháp sử dụng tập hành vi trụ quay Rotarod Error! Bookmar 1.4.2 Phƣơng pháp sử dụng tập môi trƣờng mở Error! Bookmark not defined 1.4.3 Phƣơng pháp xác định ngƣỡng đau Error! Bookmark not defined 1.4.4 Phƣơng pháp xác định tầm vận động Error! Bookmark not defined 1.5 Sự thay đổi giá trị huyết học mediator viêm thối hóa khớp Error! Book 1.5.1 Sự thay đổi bạch cầu viêm 1.5.2 Vai trò cytokin viêm 1.6 Tổng quan sản phẩm nọc ong dự kiến nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chứa nọc ong điều trị bệnh .11 1.6.1 Sản phẩm nọc ong dự kiến nghiên cứu 11 1.6.2 Các nghiên cứu liên quan đến độc tính nọc ong 12 1.6.3 Các nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chứa nọc ong điều trị bệnh 13 1.7 Phƣơng pháp thủy châm ứng dụng thủy châm điều trị bệnh Error! Bookm Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 MỤC LỤC 2.1 Xây dựng mơ hình viêm thối hóa khớp gối động vật thực nghiệm 17 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.1.2 Phân nhóm nghiên cứu 17 2.1.3 Phƣơng pháp gây viêm thối hóa khớp gối 17 2.1.4 Các tiêu đánh giá 18 2.2 Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau cải thiện vận động chế phẩm chứa nọc ong 19 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.2.2 Hóa chất, phƣơng tiện dụng cụ 20 2.2.3 Phân nhóm nghiên cứu 20 2.2.4 Phƣơng pháp thủy châm điều trị 21 2.2.5 Các tiêu đánh giá 21 2.3 Cách xác định số nghiên cứu 22 2.4 Phân tích số liệu Error! Bookmark not defined Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Kết gây mơ hình thực nghiệm 28 3.1.1 Nhiệt độ chỗ 28 3.1.2 Ngƣỡng đau 28 3.1.3 Tầm vận động 29 3.1.4 Khả phối hợp vận động chuột 30 3.1.5 Xét nghiệm huyết học cytokin viêm 31 3.1.6 Hình ảnh mô học ổ khớp 34 3.2 Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm, cải thiện vận động thủy châm chế phẩm chứa nọc ong chuột gây viêm thoái hóa khớp 36 3.2.1 Nhiệt độ vùng khớp gối gây thối hóa 36 3.2.2 Ngƣỡng đau trƣớc sau điều trị 38 MỤC LỤC 3.2.3 Sự thay đổi khả vận động 39 3.2.4 Tầm vận động 40 3.2.5 Khả phối hợp vận động 43 3.2.6 Sự thay đổi số lƣợng bạch cầu 45 3.2.7 Sự thay đổi nồng độ cytokin huyết tƣơng .45 3.2.8 Sự thay đổi hình ảnh mơ học vùng khớp gối 50 Chƣơng BÀN LUẬN 51 4.1 Về kết mơ hình gây viêm thối hóa khớp gối chuột 51 4.2 Về đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau cải thiện vận động thủy châm chế phẩm chứa nọc ong mơ hình động vật gây viêm thối hóa khớp gối 55 Chƣơng KẾT LUẬN 62 Chƣơng KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các mơ hình gây thối hóa khớp gối .8 Bảng 3.1 Nhiệt độ chỗ nhóm nghiên cứu .28 Bảng 3.2 Ngƣỡng đau hai nhóm nghiên cứu 29 Bảng 3.3 Độ gấp khớp gối chuột nhóm nghiên cứu 29 Bảng 3.4 Độ duỗi khớp gối chuột nhóm nghiên cứu 30 Bảng 3.5 Thời gian chuột rơi xuống tập rotarod 31 Bảng 3.6 Số lƣợng bạch cầu trƣớc sau gây thoái hóa khớp gối 32 Bảng 3.7 Nồng độ TNF-α huyết tƣơng trƣớc sau gây thối hóa 32 Bảng 3.8 Nồng độ IL-1β huyết tƣơng trƣớc sau gây thối hóa 33 Bảng 3.9 Nồng độ IL-10 huyết tƣơng trƣớc sau gây thối hóa 34 Bảng 3.10 Nhiệt độ trƣớc sau điều trị nhóm nghiên cứu .37 Bảng 3.11 Ngƣỡng đau trƣớc sau điều trị .38 Bảng 3.12 Khả vận động trƣớc sau điều trị 39 Bảng 3.13 Góc duỗi khớp gối trƣớc sau điều trị 40 Bảng 3.14 Góc gấp khớp gối trƣớc sau điều trị .42 Bảng 3.15 Thời gian chuột rơi xuống trƣớc sau điều trị 43 Bảng 3.16 Sự thay đổi số lƣợng bạch cầu trƣớc sau điều trị 45 Bảng 3.17 Sự thay đổi nồng độ TNF-α huyết tƣơng trƣớc sau điều trị 46 Bảng 3.18 Sự khác biệt nồng độ IL-1β huyết tƣơng trƣớc sau điều trị 47 Bảng 3.19 Sự khác biệt nồng độ IL-10 huyết tƣơng trƣớc sau điều trị 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 chế phẩm chứa nọc ong nghiên cứu 12 Hình 2.1 Tiêm CFA vào khớp gối chuột 18 Hình 2.2 Lấy máu xét nghiệm .Error! Bookmark not defined Hình 2.3 Bộ Kit ELISA TNF-alpha, IL-10, IL-1beta 19 Hình 2.4 Đo nhiệt độ khớp gối 23 Hình 2.5 Đánh giá ngƣỡng đau hệ thống Analgesy-Meter 24 Hình 2.6 Phần mềm Anymaze ghi lại hoạt động chuột 24 Hình 2.7 Đánh giá tầm vận động chuột 25 Hình 3.1, 3.2 Mơ học khớp gối sau gây viêm thối hóa 38 Hình 3.3 Hình ảnh khớp gối tổ chức cạnh khớp sau tuần điều trị 50 phần mềm quanh ổ khớp gối Khi điều trị, số lƣợng bạch cầu tất nhóm giảm nhanh rõ rệt, tƣơng ứng với số lƣợng bạch cầu nhóm chứng khơng gây viêm Sau tuần điều trị, thấy số lƣợng bạch cầu giảm rõ rệt Điều cho thấy thủy châm chế phẩm chứa nọc ong có tác dụng chống viêm mạnh nhanh Để đánh giá viêm có hai loại cytokin chủ yếu máu ngoại vi theo tác dụng loại cytokin Đó cytokin gây viêm cytokin chống viêm Cơ sở phân loại nhƣ ý nghĩa loại cytokin tham khảo cơng trình tổng kết gần tác giả giới Tuy nhiên, tóm tắt nhƣ sau: Các cytokin gây viêm đƣợc sản xuất chủ yếu đại thực bào hoạt động liên quan đến điều hịa tăng phản ứng viêm cytokin chống viêm chuỗi phân tử có chức điều hịa miễn dịch mà kiểm sốt phản ứng cytokin viêm Các cytokin gây viêm có loại chủ yếu IL-1β, IL-6, TNF-α cytokin chống viêm chủ yếu IL-10, IL-11, and IL-13 Cần ý vai trò chống viêm cytokin chống viêm cytokin gây viêm khác Trong viêm, cytokin gây viêm đƣợc tăng hoạt hóa nên nồng độ loại cytokin tăng cao viêm Ngƣợc lại, viêm, cytokin chống viêm bị ức chế làm cho nồng độ huyết tƣơng loại cytokin giảm viêm Trong trình giảm viêm, hoạt động cytokin lại ngƣợc lại Dẫn đến giảm cytokin gây viêm nồng độ cytokin chống viêm lại tăng lên Quá trình phù hợp với nghiên cứu Trong nghiên cứu này, khơng đánh giá tồn tất loại cytokin máu liên quan đến kinh phí thời gian nghiên cứu Vì vậy, chúng tơi lựa chọn số số cytokin điểm hình mà theo nghiên cứu trƣớc có thay đổi mạnh trình viêm nhƣ trình hồi phục sau viêm Chúng lựa chọn hai loại cytokin gây viêm TNF-α IL-1β loại cytokin chống viêm IL10 Kết nghiên cứu nhƣ dự đốn liên quan đến vai trị loại cytokin máu Ở nhóm chứng khơng gây viêm, thấy nồng độ huyết tƣơng cytokin gây viêm (TNF-α IL-1β) trƣớc sau điều trị, thấp rõ rệt so với nhóm chứng thời điểm Ngƣợc lại, nhóm động vật này, nồng độ cytokin chống viêm (IL-10) cao rõ rệt so với giá trị nhóm chứng gây viêm thời điểm Khi điều trị thủy châm chế phẩm chứa nọc ong Mobic, kết cho thấy nồng độ cytokin gây viêm giảm rõ rệt mạnh sau tuần điều trị Ngƣợc lại, nồng độ cytokin chống viêm tăng rõ rệt sau tuần điều trị tất nhóm chuột có điều trị thủy châm chế phẩm chứa nọc ong thủy châm Mobic Đặc biệt, cần ý tác dụng làm giảm nồng độ huyết tƣơng cytokin gây viêm làm tăng nồng độ cytokin chống viêm không khác biệt nhiều liều điều trị 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg 1,5mg/kg khơng khác biệt nhiều so với nhóm chuột đƣợc điều trị Mobic Đây loại xét nghiệm có tính xác cao khách quan nên hồn toàn kết luận hiệu điều trị thủy châm chế phẩm chứa nọc ong với liều nghiên cứu tƣơng đƣơng tƣơng đƣơng với hiệu điều trị thủy châm Mobic Hình ảnh mô học tiến sâu cho phép nhìn trực tiếp hình ảnh thối hóa viêm sau thối hóa khớp gối nhóm nghiên cứu Có thể nói kết khách quan đƣợc sử dụng để đánh giá tình trạng thối hóa viêm khớp gối Kết nghiên cứu thấy có khác biệt nhiều tình trạng thối hóa viêm nhóm nghiên cứu Đối với nhóm chứng khơng gây thối hóa khớp gối, chúng tơi hầu nhƣ khơng thấy tình trạng thối hóa viêm ổ khớp gối tổ chức cạnh khớp Điều cho thấy thủy châm khơng làm tăng q trình viêm qui trình điều trị thủy châm chúng tơi nghiên cứu hồn tồn đảm bảo vơ trùng Ở nhóm chứng gây thối hóa khớp gối, chúng tơi thấy q trình thối hóa khớp viêm sau thối hóa diễn mạnh mẽ Ở nhóm điều trị thủy châm chế phẩm chứa nọc ong Mobic, hình ảnh viêm thối hóa khớp gối giảm rõ Đặc biệt, chúng tơi thấy hình ảnh viêm thối hóa khớp gối hầu nhƣ khơng khác đƣợc thủy châm điều trị chế phẩm chứa nọc ong nhƣ thủy châm Mobic Kết lại lấn khẳng định hiệu thủy châm chế phẩm chứa nọc ong với liều khác nghiên cứu tƣơng đƣơng tƣơng đƣơng với thủy châm Mobic liều 1,0mg/kg Kết nghiên cứu chúng tơi hồn tồn phụ hợp với nghiên cứu trƣớc Mabey Honsawek (2015) chứng minh đƣợc cytokin marker hóa sinh quan trọng bệnh thối hóa khớp gối [68] Hai tác giả phân tích vai trị cytokin viêm thành loại cytokin gây viêm cytokin chống viêm Nhóm cytokin gây viêm có loại cytokin đóng vai trị quan trọng chế viêm thối hóa khớp gối IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-15 IL-18 Nhóm cytokin chống viêm có loại cytokin quan trọng IL-10 IL-2 Việc tổng hợp vai trò nhóm tác giả phù hợp với lựa chọn loại cytokin để định lƣợng nghiên cứu Nhƣ thủy châm chế phẩm chứa nọc ong có tác dụng chống viêm, giảm đau cải thiện vận động chuột gây viêm thối hóa khớp gối Chƣơng KẾT LUẬN Chúng xây dựng thành cơng mơ hình gây viêm thối hóa khớp gối chuột cống trắng cách tiêm chất hóa học CFA vào ổ khớp gối bên phải chuột: - Sau tiêm, nhiệt độ chỗ tăng, độ gấp khớp gối tăng, số lƣợng bạch cầu máu ngoại vi tăng, nồng độ cytokin gây viêm TNF-α , IL-1β tăng có ý nghĩa thống kê (p