Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang helinzole ( omeprazol 20mg ) theo mô hình đơn liều kết hợp đa liều

Bảng 4.14: Kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hoá của người tình nguyện Bảng 4.15.: Kết quả khám lâm sàng người tình nguyện Bảng 4.16: Kết quả thăm dò thông số dược động học trên 3 NT

Bộ y tế Viện kiểm nghiệm thuốc

Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ

Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên nang helinzole (omeprazol 20g)

theo mô hình đơn liều kết hợp đa liều

Chủ nhiệm đề tài: ts phùng thị vinh

6724

28/01/2008

hà nội - 2007

Chủ nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Vinh Đồng chủ nhiệm: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu

Cơ quan chủ trì: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế Cấp quản lý: Bộ Y tế

HÀ NỘI - 2007 Bản báo cáo gồ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Helinzole (omeprazol 20mg) theo mô hình đơn liều kết hợp đa liều

2 Chủ nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Vinh

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế

Địa chỉ: 48 - Hai Bà Trưng, Hà Nội Điện thoại: (84 – 4) 9 363 114 Fax: (84 – 4) 8 356 911

4 Cơ quan quản lý: Bộ Y tế

5 Thư ký đề tài: DS Lê Thị Thu Huyền

6 Đồng chủ nhiệm: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu

7 Danh sách những người thực hiện chính

8 Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/ 2005 đến tháng 12/ 2007

MỤC LỤC

trang PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ TÓM TẮT CỦA ĐỀ TÀI 1

a Đóng góp mới của đề tài 1

d, Hiệu quả về kinh tế 3

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 3

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã

được phê duyệt

4

c, Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương 4

d, Đánh giá việc sử dụng kinh phí 4

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 5

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài 6

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 6

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước liên quan đến đề tài 7

2.1.1 Tổng quan về omeprazol 7

2.1.2 Phương pháp phân tích 8

2.1.3 Nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học 11

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài 13

3.1 Thiết kế nghiên cứu 16

3.1.1 Nghiên cứu in vitro 15

3.1.2 Nghiên cứu in vivo 16

3.2.1 Thuốc nghiên cứu 16 3.2.2 Thiết bị, dung môi, hoá chất 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Khảo sát độ hoà tan in vitro 17

3.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol trong huyết tương 18

3.3.3 Đánh giá tương đương sinh học in vivo 19

3.3.3.2 Người tình nguyện 19 3.3.3.3 Liều dùng và cách dùng 20

3.3.3.5 Phân tích mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 21

3.3.3.6 Xác định các thông số dược động học 21

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

4.1.1 Thử độ hòa tan trong môi trường ph 4,5 và 1,2 23

4.1.2 Thử độ hòa tan trong môi trường pH 6,8 25

4.2 Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol trong huyết tương 26

4.2.1 Xây dựng phương pháp 26

4.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28

4.3 Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học in vivo 35

4.3.1 Kết quả tuyển chọn người tình nguyện 35

4.3.2 Kết quả nghiên cứu thăm dò 37

4.3.3 Mã hóa và phân nhóm người tình nguyện 37

4.3.4 Quá trình lấy mẫu và đánh giá độ an toàn 38

4.3.5 Xác định nồng độ thuốc trong huyết tương 38

4.3.6 Phân tích dược động học và đánh giá tương đương sinh học 44

Bảng 2.1 Tóm tắt một số phương pháp kiểm nghiệm omeprazol trong chế phẩm

Bảng 2.2: Tóm tắt một số phương pháp phân tích omeprazol trong dịch sinh học

Bảng 2.3 Một số chế phẩm omeprazol đang lưu hành ở Việt nam

Bảng 3.1: Kế hoạch uống thuốc và lấy mẫu

Bảng 4.1 Kết quả thử độ hoà tan viên nang Helinzole và Lomac trong môi trường pH

1,2 và pH 4,5 sau 2 giờ

Bảng 4.2 Kết quả thử độ hoà tan viên nang Helinzole trong môi trường pH 6,8

Bảng 4.3 Kết quả thử độ hoà tan viên nang Lomac trong môi trường pH 6,8

Bảng 4.4 Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic của chuẩn/ chuẩn nội và nồng độ

Omeprazol chuẩn pha trong huyết tương

Bảng 4.5 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày

Bảng 4 7 Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các ngày

Bảng 4.8 Kết quả đánh giá hiệu suất chiết omeprazol ra khỏi huyết tương

Bảng 4.9 Kết quả đánh giá hiệu suất chiết Albendazol ra khỏi huyết tương

Bảng 4.10 Kết quả nghiên cứu độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã

Bảng 4.11 Kết quả nghiên cứu độ ổn định dài ngày

Bảng 4.12: Kết quả độ ổn định của chuẩn và chuẩn nội gốc ở nhiệt độ phòng

Bảng 4.13: Kết quả nghiên cứu ổn định của chuẩn và chuẩn nội gốc trong thời gian

Bảng 4.14: Kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hoá của người tình nguyện

Bảng 4.15.: Kết quả khám lâm sàng người tình nguyện

Bảng 4.16: Kết quả thăm dò thông số dược động học trên 3 NTN

Bảng 4.17: Bố trí uống thuốc và lấy mẫu máu

Bảng 4.18: Nồng độ omeprazol trong huyết tương của từng NTN sau khi uống liều đơn thuốc thử Helinzole

Bảng 4.19: Nồng độ omeprazol trong huyết tương của từng NTN sau khi uống 6 liều thuốc thử Helinzole

Bảng 4.20: Nồng độ omeprazol trong huyết tương của từng NTN sau khi uống liều đơn thuốc chứng Lomac

Bảng 4.21: Nồng độ omeprazol trong huyết tương của từng NTN sau khi uống 6 liều thuốc chứng Lomac

Bảng 4.22 Thông số dược động học Cmax của người tình nguyện sau khi uống liều đơn và uống liên tục trong 6 ngày (n = 18)

Bảng 4.23: Phân tích phương sai giá trị logarit Cmax khi dùng liều đơn

Bảng 4.24: Phân tích phương sai giá trị logarit Cmax sau khi dùng 6 liều

Bảng 4.25 Thông số dược động học AUC 0-∞ trung bình của người tình nguyện sau khi dùng liều đơn và 6 ngày liên tục (n = 18)

Bảng 4.26: Phân tích phương sai giá trị logarit AUC 0-∞ khi dùng liều đơn

Bảng 4.27: Phân tích phương sai giá trị logarit AUC 0-∞ sau khi dùng 6 liều

Bảng 4.28: So sánh giá trị Tmax sau khi dùng liều đơn

Bảng 4.29: So sánh giá trị Tmax sau khi dùng thuốc liên tục 6 liều

Bảng 4.30 Phân tích phương sai Cmax khi uống 1 liều

Bảng 4.31: Phân tích phương sai Cmax khi uống 6 liều

Bảng 4.32: Phân tích phương sai AUC khi uống 1 liều

Bảng 4.33: Phân tích phương sai AUC khi uống 6 liều

Bảng 5.1: Thông số dược động học trung bình sau khi dùng 1 liều và 6 liều

Bảng 6.1: Thông số dược động học trung bình sau khi dùng viên nang omeprazol Bảng 6.2: Kết quả đánh giá tương đương sinh học Helinzole so với Lomac

Hình 4.5: Đường cong nồng độ thuốc trung bình trong huyết tương - thời gian của

18 NTN sau khi uống liều đơn Helinzole và Lomac

Hình 4.6: Đường cong nồng độ thuốc trung bình trong huyết tương - thời gian của

18 NTN sau khi uống thuốc liên tục 6 liều Helinzole và Lomac

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC:

- Phụ lục 1: Đề cương nghiên cứu, mẫu bản cam kết; Bản chấp thuận của Hội đồng đạo đức

- Phụ lục 2: Qui trình phân tích omeprazol trong huyết tương

- Phụ lục 3: Qui trình đánh giá tương đương sinh học viên nang omeprazol bao tan trong ruột

- Phụ lục 4: Bản kiến nghị gửi các bên liên quan

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

AUC Diện tích dưới đường cong

Cmax Nồng độ thuốc tối đa

TĐSH Tương đương sinh học

Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

PHẦN A: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1.Kết quả nổi bật của đề tài

a Đóng góp mới của đề tài

- Đề tài đã thực hiện nghiên cứu so sánh để xác định mô hình đánh giá tương đương sinh học cho các chế phẩm có chứa omeprazol Kết quả nghiên cứu đưa ra bằng chứng để khuyến cáo các nhà khoa học lựa chọn mô hình thích hợp, thu được kết quả tin cậy và giảm thiểu những chi phí không cần thiết

- Phương pháp đánh giá tương đương độ hoà tan không phù hợp với loại chế phẩm viên nang có chứa omeprazol dạng hạt bao tan trong ruột nói riêng và các chế phẩm có chứa omeprazol nói chung, do omeprazol không bền trong môi trường acid

Do vậy, không thể có đủ dữ liệu so sánh độ hoà tan trong 3 môi trường theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hoặc Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm

Mỹ (FDA) khi cần xem xét để miễn đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) in vivo

- Kết quả thử nghiệm invivo cho thấy những nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và TĐSH cho chế phẩm có chứa omeprazol nên thiết kế đánh giá sau khi dùng 5 - 6 liều, nhưng xử lý kết quả như đơn liều

b, Kết quả cụ thể

- Kết quả nghiên cứu in vitro: Đã khảo sát mức độ hoà tan của chế phẩm Helinzole so với chế phẩm ngoại nhập (Lomac) trong 3 môi trường pH đặc trưng của đường tiêu hoá (1,2 - dạ dày, 4,5 – tá tràng và 6,8 - ruột non) Lượng hoà tan trong vòng 2 giờ ở 2 môi trường: ở pH 1,2, Helinzole hoà tan ít hơn Lomac (6,5% so với 10,7%); trong khi đó ở pH 4,5 thì Helinzole lại hòa tan nhiều hơn (52,9% so với 42,2%) Trong môi trường ruột non (pH 6,8), Helinzole có phần hòa tan nhanh hơn Lomac Kết quả so sánh quá trình hòa tan cho hệ số F2 = 47,6 (không tương tự)

- Kết quả nghiên cứu in vivo: Thiết kế nghiên cứu đã thực hiện đánh giá so sánh sinh khả dụng của chế phẩm Helinzole sau khi uống đơn liều (1 viên 20mg) và sau khi uống thuốc liên tục 6 liều (liều 1 viên 20mg/ ngày)

+ Sau khi uống đơn liều, nồng độ thuốc tối đa trong máu trung bình (Cmax) cũng như diện tích dưới đường cong (AUC) của Helinzole cao hơn thuốc đối chứng là Lomac Tuy nhiên, thời gian đạt đến nồng độ thuốc tối đa chậm hơn Kết quả so sánh cho thấy 2 chế phẩm này không tương đương sinh học

+ Sau khi uống thuốc liên tục 6 liều, các thông số dược động học của 2 thuốc tương tự nhau Kết quả so sánh qua đánh giá thống kê cho thấy 2 chế phẩm này tương đương sinh học

Kết quả in vivo được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Tóm tắt các thông số dược động học sau thử nghiệm in vivo (n=18)

Cmax (ng/ml) AUC (ng.giờ/ml) Tmax (giờ) Chế phẩm

1 liều 6 liều 1 liều 6 liều 1 liều 6 liều Thuốc thử

(Helinzole) 520 768 1056 1793 2,3 1,9 Thuốc đối chứng

(Lomac) 461 754 815 1889 1,6 1,3 Kết quả so sánh

mức tương đương

(thử/ chứng)

97,3 – 135,4%

96,9 – 115,9 %

108,7 – 159,3%

97,1 – 124,6% P < 0,05 P > 0,05

Hai chế phẩm không tương đương sinh học sau khi dùng liều đơn, nhưng tương đương sinh học theo qui định của US – FDA sau khi dùng liên tục 6 liều trong 6 ngày

- Xây dựng được qui trình phân tích omeprazol trong huyết tương và qui trình chung cho đánh giá TĐSH các chế phẩm viên nang có chứa omeprazol dạng hạt bao tan trong ruột Qui trình đơn giản và khả thi với điều kiện trang thiết bị hiện có của một số trung tâm đánh giá TĐSH trong nước

c, Hiệu quả về đào tạo

- Đánh giá tương đương sinh học của thuốc là một nội dung hoạt động chuyên môn mới của Viện Kiểm nghiệm Hầu hết các cán bộ chưa được đào tạo và chưa có kinh nghiệm trong lĩnh vực này Do vậy, đề tài nghiên cứu này đã tạo cơ hội cho một số cán bộ của Viện tiếp cận và thực hiện một nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học tương đối hoàn chỉnh Nhờ đó, tạo nguồn nhân lực cho việc thành lập Trung tâm đánh giá tương đương sinh học của Viện (3/2007)

- Cung cấp tư liệu và kinh nghiệm cho một số cán bộ của Viện thực hiện lớp tập huấn về TĐSH theo yêu cầu của Tổ chức Y tế Thế giới (11/ 2007)

- Kết hợp với cơ sở đào tạo (Học viện Quân y) để đào tạo cán bộ sau đại học

Đã có 2 Thạc sĩ tốt nghiệp với luận văn thuộc nội dung của đề tài này Cả hai luận văn đều được đánh giá xuất sắc và đạt điểm giỏi (> 9 điểm)

+ Ths Bùi Bằng Giang với luận văn: Khảo sát độ hoà tan viên nang

Helinzole và xây dựng phương pháp phân tích omeprazol trong dịch sinh học

Người hướng dẫn: TS Phùng Thị Vinh

+ Ths Quách Thị Hà Vân với luận văn: Nghiên cứu sinh khả dụng và

đánh giá tương đương sinh học viên nang omeprazol theo mô hình đơn liều kết hợp

đa liều Người hướng dẫn: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu

d, Hiệu quả về kinh tế

Đề tài phối hợp với Công ty TNHH dược phẩm Đô Thành (SPM) để đánh giá tương đương sinh học cho chính sản phẩm của công ty so với một chế phẩm ngoại nhập Kết quả thử nghiệm đã được công ty xem xét và đưa vào chiến lược quảng bá sản phẩm Bên cạnh đó, kết quả này cũng đã giúp công ty khẳng định nguồn nguyên liệu chất lượng và tin cậy để duy trì sản xuất lâu dài

- Kết quả nghiên cứu cung cấp thêm các thông tin khoa học cũng như lời khuyến cáo cho các nhà khoa học khi thực hiện nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm có chứa omeprazol về phương pháp phân tích cũng như mô hình thử nghiệm hoặc thiết kế các thời điểm lấy mẫu Nhờ đó, có thể hạn chế được một số thử nghiệm sai lệch hoặc thử nghiệm thăm dò không cần thiết

e, Hiệu quả về xã hội

Kết quả đánh giá TĐSH cho viên nang Helinzole giúp cho người dân thấy được chất lượng thực của các sản phẩm thuốc sản xuất trong nước cũng có thể so sánh được với chế phẩm ngoại nhập Nhờ đó, người dân có thêm niềm tin, chọn lựa

sử dụng các sản phẩm nội địa (rẻ hơn), giảm chi phí tiền thuốc và là niềm khích lệ cho các nhà sản xuất dược phẩm trong nước tự tin hơn với sản phẩm của mình

f, Các hiệu quả khác

Việc thực hiện thành công đề tài nghiên cứu đánh giá TĐSH tương đối phức tạp trong điều kiện một phòng thí nghiệm của Việt Nam thời gian qua đã góp phần nào “khuấy động” ngành Dược Việt Nam quan tâm tới TĐSH Cuối năm 2006, và năm 2007, nhiều doanh nghiệp dược trong nước đã sẵn sàng hưởng ứng, có nhu cầu đánh giá TĐSH cho các sản phẩm của mình (mặc dù đã được phép lưu hành) Sự cạnh tranh lành mạnh hơn về chất lượng và thương hiệu đang diễn ra Cũng nhờ vậy,

cơ quan kỹ thuật (các labo đánh giá TĐSH) thấy rõ hơn nhu cầu cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ chuyên dùng cho lĩnh vực nghiên cứu mới này, làm cơ sở cho việc xây dựng dự án phát triển các Trung tâm đánh giá TĐSH Cơ quan quản lý (Cục Quản lý Dược, Vụ Khoa học đào tạo, Vụ Kế hoạch tài chính) biết rõ hơn về năng lực nghiên cứu và những nhu cầu về đào tạo cán bộ, nhu cầu kinh phí, thời gian cho các hoạt động này

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội

Do omeprazol là một trong những dược chất có sinh khả dụng biến thiên theo

kỹ thuật bào chế, nên việc đánh giá sinh khả dụng và TĐSH cho các chế phẩm này

là cần thiết Phương pháp phân tích omeprazol trong dịch sinh học đã và sẽ được tham khảo trong thực nghiệm Thiết kế trong thử nghiệm in vivo của đề tài này sẽ được các nhà nghiên cứu dược động học tham khảo

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê

- Kéo dài thời gian nghiên cứu 0

b, Thực hiện mục tiêu nghiên cứu

- Thực hiện đầy đủ các mục tiêu đề ra X

- Thực hiện được các mục tiêu nhưng không hoàn chỉnh 0

- Chỉ thực hiện được một số mục tiêu đề ra 0

- Những mục tiêu không thực hiện được 0

c, Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của đề cương

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm dự kiến trong đề cương X

- Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương X

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng chất lượng có sản phẩm chưa đạt 0

- Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả đều chưa đạt chất lượng 0

- Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng 0

- Những sản phẩm chưa thực hiện được 0

d, Đánh giá việc sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí thực hiện đề tài

- Trong đó: Kinh phí sự nghiệp: 350 triệu đồng

Kinh phí từ nguồn khác: 50 triệu (doanh nghiệp hỗ trợ)

- Toàn bộ kinh phí đã được quyết toán và có kế hoạch sử dụng

- Chưa thanh quyết toán xong: Không

- Kinh phí tồn đọng : Không

4 Các ý kiến đề xuất

- Cơ quan quản lý (Cục Quản lý Dược Việt Nam) cần sớm ban hành qui

chế yêu cầu thử tương đương sinh học cho một số chế phẩm thuốc Danh

mục các chế phẩm cần thử nên có viên nang omeprazol

- Để thống nhất trong nghiên cứu, các cơ quan quản lý sớm ban hành các

hướng dẫn thực hiện đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của

thuốc; đồng thời xem xét phê duyệt thuốc đối chứng cho từng trường hợp

cụ thể

- Để phản ánh chính xác hơn hiệu quả điều trị, một số chế phẩm có sinh khả

dụng biến thiên, nồng độ thuốc trong máu thấp và sử dụng dài ngày trong

điều trị (như omeprazol), khi cần đánh giá tương đương sinh học, nên xem

xét thiết kế thử nghiệm nghiên cứu sau khi dùng vài liều, nhưng xử lý kết

quả như khi dùng đơn liều

PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Tương đương sinh học được sử dụng để chỉ các sản phẩm tương đương về mặt dược phẩm hoặc có thể thay thế nhau về mặt dược phẩm có sinh khả dụng tương

tự trong cùng điều kiện thử nghiệm Trên thực tế, nhiều chế phẩm thuốc có cùng hoạt chất, cùng dạng bào chế nhưng tốc độ và mức độ hấp thu vào tuần hoàn lại khác nhau nên tác dụng điều trị không hoàn toàn giống nhau Chất lượng nguyên liệu, thành phần tá dược và kỹ thuật bào chế là những yếu tố có nhiều ảnh hưởng tới

sự hấp thu của thuốc Trong quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm, đánh giá TĐSH là một trong những phương pháp thường được sử dụng trong việc lựa chọn công thức và kỹ thuật bào chế

Luật bản quyền (Patent Law) của các nước phát triển qui định rõ quyền lợi của các nhà sản xuất Trong thời gian bản quyền còn hiệu lực, các sản phẩm tương

tự không được phép lưu hành Khi hết hạn, các sản phẩm tương tự muốn đăng ký lưu hành đều phải được đánh giá so sánh và có kết quả tương đương với chế phẩm phát minh (theo những tiêu chuẩn đã qui định)

Omeprazol là một thuốc được dùng trong điều trị trào ngược dạ dày - thực quản; loét

dạ dày – tá tràng; hội chứng Zollinger – Ellison Thời gian điều trị thường kéo dài,

có thể tới 8 tuần Thuốc được hấp thu tốt nhưng sinh khả dụng tương đối biến thiên giữa các cá thể và thời gian dùng thuốc Theo các tài liệu tổng quan [1], sinh khả dụng đạt khoảng 35% sau khi uống liều đầu tiên và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều Hầu hết các tài liệu không công bố thời gian đạt tới nồng độ thuốc tối đa sau khi uống mà chỉ nói thuốc có tác dụng sau khoảng 3 – 6 giờ Do vậy, việc thiết

kế chương trình lấy mẫu cho các chế phẩm này tương đối khó khăn Chất lượng điều trị của các chế phẩm có chứa omeprazol sẽ phụ thuộc nhiều vào công thức và kỹ thuật bào chế Việc xem xét sinh khả dụng và khả năng tương đương sinh học các chế phẩm này là cần thiết khi cấp phép lưu hành

Nghiên cứu xây dựng mô hình, qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm có chứa omeprazol phù hợp với điều kiện trang thiết bị và năng lực nghiên cứu hiện tại ở hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước sẽ góp phần giảm chi phí cho việc thực hiện các thử nghiệm này hơn Đồng thời, nghiên cứu thực hiện đánh giá chất lượng một sản phẩm trong nước

Chính vì vậy, Hội đồng khoa học Bộ Y tế đã đề xuất chủ đề nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học cho chế phẩm viên nang có chứa omeprazol vào chương trình nghiên cứu của đề tài cấp bộ năm 2005 Đề cương nghiên cứu của đề tài này đã được Hội đồng cấp Bộ xem xét và phê duyệt qua một qui trình tuyển chọn, so sánh với đề cương của một số cơ sở khác

1.2 Giả thiết nghiên cứu của đề tài

- Nghiên cứu khảo sát độ hoà tan trong 3 môi trường pH khác nhau theo hướng dẫn chung của FDA và các tài liệu liên quan [17,38] Nếu phương pháp khả thi, sẽ được áp dụng trong quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm để biết mức độ tương đương về khả năng hòa tan của chế phẩm nghiên cứu so với một chế phẩm đối chứng Dựa vào đó, dự đoán phần nào khả năng hấp thu invivo của chế phẩm

- Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol trong huyết tương Với điều kiện trang thiết bị hiện có, khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV Khảo sát các kỹ thuật chiết tách omeprazol từ huyết tương: loại tạp bằng acid hay dung môi hữu cơ, chiết lỏng - lỏng bằng dung môi hữu

cơ, chiết pha rắn Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu qui định của FDA cho phương pháp phân tích mẫu trong dịch sinh học: tính chọn lọc (đặc hiệu), khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, độ ổn định và hiệu suất chiết

- Giả thiết rằng thuốc nghiên cứu tương đương với thuốc đối chứng, hoặc thuốc có thể tương đương cả khi dùng đơn liều và nhiều liều, nhưng cũng có thể thuốc chỉ tương đương sau khi dùng nhiều liều Do vậy, nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học invivo được thiết kế đồng thời trên một nhóm đối tượng người tình nguyện sau khi uống thuốc liều đơn và sau khi uống liên tục 6 liều trong 6 ngày Thiết kế nghiên cứu chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn, đánh giá bằng xác định nồng độ thuốc trong huyết tương; tiến hành trên 20 người tình nguyện Xác định nồng độ omeprazol trong huyết tương NTN sau khi uống thuốc và xác định các thông số dược động học Tính thống kê và đánh giá mức độ tương đương theo phương pháp khoảng tin cậy 90% Tính kết quả riêng cho trường hợp đơn liều và sau khi dùng 6 liều

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình đánh giá TĐSH của omeprazol trên người tình nguyện ở Việt nam

- Đánh giá tương đương sinh học viên nang Helinzole (omeprazol 20mg) sản xuất trong nước so với chế phẩm ngoại nhập

- Bổ sung dữ liệu cho dự thảo qui chế đánh giá TĐSH ở Việt nam

Những mục tiêu này đã được xác định trong đề cương phê duyệt, và nội dung nghiên cứu đã thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu trên

Lý tính: Omeprazol dưới dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà Nóng chảy ở khoảng

1550C kèm theo sự phân huỷ, khó tan trong nước, khó tan trong aceton và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol [8, 31]

Hoá tính: Omeprazol vừa có tính acid, vừa có tính base, hấp thụ mạnh bức xạ tử

ngoại Các tính chất này được ứng dụng trong định tính, định lượng và trong bào chế omeprazol Độ ổn định của omeprazol phụ thuộc vào pH Trong môi trường acid, omeprazol nhanh chóng bị phân huỷ, trong môi trường kiềm omeprazol khá bền vững [8]

Dược lý và cơ chế tác dụng [1]: Omeprazol là một dẫn xuất của benzimidazole không

có hoạt tính ức chế enzym ở môi trường trung tính, nhưng ở pH ≤ 5 omeprazol được proton hoá thành 2 dạng acid sulphenic và sulphenamic Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfohydryl của enzym H+ - K+ - ATPase ở tế bào thành nên ức chế bài tiết acid trên 48 giờ Do vậy Omeprazol được dùng điều trị trong các trường hợp : trào ngược dạ dày thực quản, loét dạ dày tá tràng, hội chứng Zollinger-

Ellison

Dược động học [1]: Omeprazol là một chất ức chế bài tiết dịch vị dạ dày do ức chế

bơm proton ở các tế bào thành dạ dày Thuốc có tác dụng nhanh, kéo dài Omeprazol được hấp thu tốt ở ruột non sau khi uống khoảng 3 – 6 giờ Sinh khả dụng sau khi uống liều đầu tiên đạt khoảng 35% và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều Sự hấp thu của thuốc phụ thuộc vào liều dùng, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Thuốc liên kết cao với protein huyết tương (khoảng 95%) và được phân bố vào các mô đặc biệt

ở các tế bào thành dạ dày Thời gian bán thải của thuốc ngắn (khoảng 40 phút), nhưng tác dụng ức chế bài tiết kéo dài, nên có thể chỉ cần dùng một liều mỗi ngày

Omeprazol hầu như chuyển hoá hoàn toàn tại gan, đào thải nhanh chóng, chủ yếu qua nước tiểu (80%), phần còn lại theo phân Các chất chuyển hoá không có

hoạt tính, nhưng lại tương tác với nhiều thuốc khác do tác dụng ức chế các enzym CYT.P450 của tế bào gan Dược động học của thuốc thay đổi không có ý nghĩa ở người già hay người có chức năng thận suy giảm Với những người suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ thanh thải giảm, nhưng không có biểu hiện tích luỹ thuốc trong cơ thể

Chỉ định: Trào ngược dạ dày - thực quản; Loét dạ dày – tá tràng; hội chứng

Zollinger - Ellison

Chống chỉ định: Mẫn cảm với thuốc

Phản ứng bất lợi: Một số phản ứng thường gặp có thể xảy ra khi điều trị với

omeprazol như rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn, đau bụng, trướng bụng Hiếm gặp hơn là các phản ứng gây mất ngủ, chóng mặt, mày đay, ra mồ hôi

Liều dùng và cách dùng: Liều thường dùng cho người lớn là 20 – 40 mg/lần/ngày,

thời gian điều trị từ 4 – 8 tuần

Viên nang omeprazol lần đầu tiên được công ty Astra (nay là AstraZeneca) nghiên cứu sử dụng làm thuốc điều trị và đăng ký lưu hành từ năm 1988 với tên biệt dược Losec (được công nhận là thuốc phát minh, Innovator), với doanh số khoảng 8 tỷ dola mỗi năm Tuy nhiên, khi chưa hết hạn bản quyền (1997), AstraZeneca đã xin rút đăng ký sản phẩm này ở một số nước thành viên chính của EU, và cho ra đời viên nén và viên nang Losec MUPs (omeprazol + magnesi) Mặc dù chế phẩm mới

đã được đánh giá TĐSH với chế phẩm Losec gốc nhưng nhiều nước không coi Losec MUPs là chế phẩm innovator Từ đó, trên thị trường hầu như chỉ còn lưu hành chế phẩm generic của omeprazol đã được đánh giá TĐSH với Losec hoặc chế phẩm được cấp phép ở các nước Losec không được đăng ký bản quyền, như Apo – omeprazol, (Apotex - Canada), Probitor (Biochemie - Áo)

2.1.2 Phương pháp phân tích

Viên nang omeprazol đã được ghi trong dược điển một số nước như Mỹ, Ấn Độ Hầu hết các dược điển và tiêu chuẩn cơ sở đều định lượng omeprazol trong nguyên liệu cũng như chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc đo độ hấp thụ tử ngoại Tuy nhiên, điều kiện sắc ký có thể thay đổi tuỳ từng tiêu chuẩn Với dạng bào chế, phép thử độ hòa tan có phương pháp thử khác nhau

Bảng 2.1 dưới đây thống kê một số phương pháp định lượng và thử độ hoà tan của viên nang omeprazol

Bảng 2.1 Tóm tắt một số phương pháp kiểm nghiệm omeprazol trong chế phẩm

Môi trường acid: định lượng hạt còn lại Xác định lượng còn lại và hoà tan bằng HPLC giống phần định lượng

[32] - Cột RP18, 150mm x 4,6mm

x ; 5µm

- Pha động: Hỗn hợp đệm pH

9 , MeCN và MeOH

Sắc ký gradient dung môi

thay đổi tỷ lệ pha động thích

- PP 2: Thiết bị I, 100 vòng/ phút Môi trường acid HCl 0,1N: 900ml, định lượng hạt còn lại chưa tan sau 2h Môi trường pH 6,8: 900ml, xác định lượng hoà tan sau 45’ Xác định lượng chưa hòa tan trong môi trường acid bằng HPLC như phân định lượng, Xác định lượng hoà tan trong MT kiềm bằng đo

UV ở 305nm [2] - Cột RP18, 250mm x 4mm;

Môi trường acid, 750ml: xác định lượng hoà tan sau 2 giờ

Môi trường pH 6,8: Thêm natri phosphat tiếp vào bình hoà tan của môi trường acid và điều chỉnh pH đến 6,8, xác định lượng hoà tan sau 45 phút Định lượng bằng đo độ hấp thụ ở 302nm

[15] Đo độ hấp thụ ở 308nm Thiết bị II, 100 vòng/ phút Môi trường

pH 1,2; 900ml; định lượng hạt còn lại chưa tan sau 2h Môi trường pH 6,8: 900ml, xác định lượng hoà tan sau 30’ Xác định lượng chưa hòa tan trong môi trường acid và lượng hoà tan trong MT kiềm bằng đo UV ở 302nm

Một số phương pháp định lượng Omeprazol trong dịch sinh học

Hầu hết các tài liệu tham khảo đều giới thiệu phương pháp định lượng Omeprazol trong dịch sinh học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng detector tử ngoại hoặc huỳnh quang [25] Mẫu thử thường dùng nhất là máu (huyết tương) và nước tiểu (rất ít) Các phương pháp phân tích: có thể chiết bằng dung môi hữu cơ hoặc chiết qua cột pha rắn (SPE) Phương pháp phân tích có thể dùng chuẩn nội hoặc không Thiết bị phân tích thường dùng là HPLC với detector UV với nhiều loại cột phân tích khác nhau Giới hạn định lượng có thể từ 15 ng/ ml – 100ng/ ml, tuỳ vào điều kiện [17, 25, 23, 24, 34] Tóm tắt một số phương pháp phân tích điển hình được giới thiệu như sau:

Bảng 2.2: Tóm tắt một số phương pháp phân tích omeprazol trong dịch sinh học

TLTK Phương pháp

chiết

Định lượng (Điều kiện sắc ký)

Detector: UV 302 nm LLOQ: 15ng/ml

2- [(4 - methoxy - 2 pyridinyl) methyl sulffinyl) -4,6 - dimethyl - 1H- benzimidazol 3,5 - dimethyl - 2 - pyridinyl) methyl ] - 1

h - benzimidazol [23] Chiết bằng hỗn

hợp

dichloromethan +

MeCN (80:20)

- Cột: C18, 250 x 4,6; 5 µm nucleosil

- Pha động: MeCN : đệm phosphat pH 7,5 20 mM 37:63

- Detector: UV 302 nm

- LLOQ: 25ng/ml (huyết tương), 50ng (nước tiểu)

2.1.3 Nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học

Ở một số nước phát triển, khi xem xét cấp phép lưu hành cho thuốc generic, cơ quan quản lý có thể căn cứ vào các kết quả đánh giá chế phẩm bao gồm:

- Khả năng hoà tan của chế phẩm thử so với thuốc đối chứng để có thể cho phép miễn thử TĐSH in vivo

- Kết quả đánh giá TĐSH in vivo, qua việc so sánh một số thông số dược động học hoặc hiệu quả sinh học trên người tình nguyện

Những chế phẩm có chứa dược chất có độ tan cao, tính thấm tốt (thuộc nhóm I trong hệ thống phân loại sinh dược - BCS) sẽ được xem xét để tiến hành so sánh độ hoà tan và xem xét miễn thử TĐSH in vivo Khi đó, sẽ giảm được một phần lớn kinh phí cho các việc nghiên cứu, đánh giá TĐSH Với các dược chất ít tan, tính thấm kém (thuộc các nhóm 4, 3, hoặc 2 trong BCS) và các thuốc có khoảng điều trị hẹp sẽ phải xem xét từng trường hợp để tiến hành đánh giá TĐSH in vivo bảng phân loại theo BCS đang được các nhà khoa học dược nghiên cứu xây dựng

Đánh giá TĐSH in vivo: là thực hiện so sánh sự đáp ứng sinh học của thuốc cần nghiên cứu với một thuốc đối chứng trên cơ thể người hoặc sinh vật sống Có một số phương pháp đánh giá, nhưng thông dụng nhất là đánh giá so sánh các thông số dược động học (Cmax, AUC, Tmax ) của thuốc nghiên cứu với thuốc đối chứng hoặc đánh giá so sánh hiệu quả sinh học của các thuốc trong cùng điều kiện

- Thiết kế nghiên cứu: Mô hình đánh giá TĐSH hay được áp dụng nhất là chéo, đơn

liều/ đa liều, ngẫu nhiên, mù đơn/ mở (khác với các thiết kế thử lâm sàng thường là

bố trí song song, mù kép) Bố trí chéo là dùng đối chứng trên chính cá thể đó (ở giai đoạn khác) nhằm hạn chế sự biến thiên giữa các cá thể, thường được thiết kế chéo theo kiểu ô vuông latin, với n thuốc và n giai đoạn Ví dụ: trong nghiên cứu đánh giá 2 thuốc (1 thuốc nghiên cứu so với 1 thuốc chứng), bố trí theo kiểu ô vuông 2 x

2 (2 thuốc, 2 giai đoạn) và lặp lại n lần cho đủ số liệu tính toán theo yêu cầu của thí nghiệm Khi cần nghiên cứu 3 chế phẩm (2 thuốc nghiên cứu so với cùng 1 thuốc chứng), có thể áp dụng mô hình ô vuông la tinh 3 x 3 (3 thuốc, 3 giai đoạn) để có thể giảm bớt một số thí nghiệm, giảm phần nào chi phí Tuy nhiên, khi áp dụng mô hình này, thời gian thử thuốc kéo dài hơn (3 giai đoạn) và mỗi người tình nguyện sẽ phải dùng 3 chế phẩm thuốc Thời gian nghỉ (rửa giải) giữa các giai đoạn phải đảm bảo cho thuốc thải trừ hết khỏi cơ thể, tức là tuỳ vào thời gian bán thải trừ của từng loại thuốc

Hầu hết các nghiên cứu đánh giá TĐSH sau khi uống liều đơn thuốc thử hoặc thuốc đối chứng Một số trường hợp có thể phải thiết kế đa liều khi:

- Có sự khác biệt về tốc độ hấp thu nhưng không khác về mức độ hấp thu

- Có sự biến thiên về SKD quá mức giữa các cá thể

- Nồng độ của dược chất hoặc chất chuyển hóa trong máu có được từ liều đơn quá thấp, không có phương pháp phân tích để xác định chính xác

- Chế phẩm thuốc là dạng phóng thích kéo dài

- Người tình nguyện: đánh giá TĐSH thường tiến hành trên người tình nguyện khoẻ

mạnh Trừ một số trường hợp các thuốc có độc tính cao như các thuốc chống ung thư, thuốc chống HIV – Aids phải thử trên bệnh nhân Người tình nguyện phảI được kiểm tra sức khoẻ và đạt tiêu chuẩn do yêu cầu nghiên cứu đề ra Số lượng cá thể cho mỗi nghiên cứu tuỳ thuộc từng thiết kế Với các phép đánh giá sinh học, khi số lượng mẫu thử (giá trị n) càng lớn, kết quả càng chính xác Tuy nhiên, trong đánh giá TĐSH, hầu hết các tài liệu đều khuyến cáo dùng với số lượng nhỏ nhất cá thể mà vẫn đảm bảo yêu cầu mức độ tin cậy trong tính thống kê của phép thử Số lượng có thể từ 12, 18, 24, 30, tuỳ từng loại thuốc và qui định của mỗi quốc gia Hướng dẫn của Asean khuyến cáo nên dùng số lượng NTN tối thiểu là 12

- Thuốc đối chứng: thuốc được chọn làm đối chứng tốt nhất là chế phẩm phát minh

(thuốc đầu tiên được lưu hành trên thị trường), đã được nghiên cứu một cách đầy đủ

về hoá học cũng như đặc tính lâm sàng, đã được cấp phép lưu hành hoặc một thuốc tương tự có chất lượng cao đang lưu hành trên thị trường ở thời điểm nghiên cứu Để thống nhất trong việc so sánh các kết quả đánh giá, mỗi quốc gia (Bộ Y tế hoặc hiệp hội các nhà sản xuất dược phẩm) cần qui định thuốc đối chứng cho từng loại dược chất

Trên thế giới, đánh giá TĐSH đã được thực hiện từ nhiều thập kỷ trước ở các nước có nền công nghiệp dược phát triển như Canada, Mỹ, Pháp, Đức, Bỉ, ấn độ và một số nước trong khu vực như Indonesia, Malaysia, Philipin Tại các nước này đều

đã ban hành Qui chế và Hướng dẫn thử TĐSH Ngoài ra, Hướng dẫn thử TĐSH in vivo đã được ghi trong một số Dược điển như Mỹ, Châu Âu, Trung quốc, Nhật Bản Dược điển Mỹ đã có hướng dẫn (protocol) thử TĐSH in vivo cho một số thuốc cụ thể và những trường hợp có thể miễn thử TĐSH in vivo

Đánh giá TĐSH thường được thực hiện tại các trung tâm đánh giá sinh khả dụng và TĐSH hoặc các đơn vị nghiên cứu phát triển thuốc Các nước có nền công nghiệp dược phát triển, các công ty dược phẩm lớn đều có bộ phận nghiên cứu và đánh giá TĐSH của riêng họ (Ciba, Lyly, Bayer, Ranbaxy, Cipla ) Các nước trong khu vực chưa có những doanh nghiệp dược lớn, do vậy việc đầu tư cho nghiên cứu ở

hệ thống doanh nghiệp chưa được chú trọng Một số nước như Indonesia, Malaysia, Philipin, việc nghiên cứu được thực hiện tại các Trung tâm đánh giá TĐSH độc lập không thuộc của doanh nghiệp Nghiên cứu đánh giá của các trung tâm này chủ yếu theo yêu cầu của các nhà quản lý đối với doanh nghiệp cần cung cấp bằng chứng khi cấp phép sản xuất

Trong quá trình triển khai hội nhập kinh tế của các nước khối Asean, ủy ban tư vấn

về tiêu chuẩn chất lượng của Asean và các nhóm công tác đã được thành lập Nhóm công tác về dược phẩm đã nhiều lần họp để bàn về việc thống nhất các tiêu chí có thể hoà hợp Trong quá trình này, nhóm đã xây dựng một bản “Hướng dẫn đánh giá sinh khả dụng và TĐSH của thuốc” để áp dụng chung trong khối Theo lộ trình tiến tới hoà hợp của các nước khu vực Asean, đến năm 2008 sẽ thống nhất được các vấn

đề chính trong đánh giá TĐSH cho các thuốc khi đăng ký lưu hành: Thống nhất

danh mục các chất cần phải đánh giá, danh mục thuốc đối chứng trong nghiên cứu, thống nhất mẫu báo cáo, tiêu chuẩn một cơ sở thực hiện đánh giá TĐSH

Những nghiên cứu đánh giá TĐSH omeprazol:

- Sayed Aboflazl Mostafavi (Iran) [27] đã nghiên cứu đánh giá TĐSH của 2 sản phẩm viên nang Omeprazol sản xuất tại Iran: omeprazol (Abidi) và Lorsec (Lorestan) so với thuốc chứng là viên nang Losec của Astra, Sweden Nghiên cứu thực hiện trên 12 người tình nguyện, thiết kế chéo theo ô vuông latin, mở, liều đơn, 3 thuốc, 3 giai đoạn với thời gian nghỉ giữa các giai đoạn

là 7 ngày Phân tích nồng độ thuốc trong huyết tương bằng HPLC Kết quả đánh giá qua các giá trị dược động học AUC và Cmax cho thấy 3 chế phẩm này là tương đương sinh học

- Elkoshi Z [17] và cộng sự cũng đã nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của viên Omepradex so với thuốc đối chứng là viên Losec trên 2 mô hình invitro (thử độ hoà tan) và in vivo (dược động học) Nghiên cứu In vivo với thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều kết hợp với đa liều, thực hiện trên 40 người tình nguyện khoẻ mạnh Hai chế phẩm nghiên cứu cho thấy không tương đương, sự sai khác sau khi dùng đa liều lớn hơn Các tác giả đã nhận định rằng nghiên cứu TĐSH omeprazol nên thực hiện với thiết kế đơn liều kết hợp đa liều

- Nghiên cứu so sánh sinh khả dụng của 2 chế phẩm omeprazol dạng uống: Pepticum (thuốc thử) và Mopral (thuốc chứng), Duvauchelle T và cs [16] đã nhận thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa về diện tích dưới đường cong (AUC) của 2 chế phẩm cả khi dùng đơn liều và đa liều Tuy nhiên, có nhận thấy sự khác nhau về giá trị Cmax (p< 0,05) và Tmax (P< 0,01) của thuốc thử

so với thuốc đối chứng ở tình trạng ổn định (sau khi dùng thuốc 5 ngày) Kết quả này khẳng định thêm rằng sau khi dùng liều nhắc lại, AUC và Cmax tăng lên so với khi dùng đơn liều và sự biến thiên giữa các cá thể là đáng kể

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến đề tài

Đánh giá TĐSH đã được thực hiện ở nhiều nước có nền công nghiệp dược phát triển và một số nước trong khu vực nhưng chưa được phổ biến ở nước ta Gần đây, việc triển khai một số đề tài nghiên cứu và hội thảo khoa học về vấn đề này được xem như những bước khởi đầu cho hướng đánh giá nhằm nâng cao chất lượng thuốc trong điều trị Tuy nhiên, hầu hết những nghiên cứu này mang tính chất thăm

dò nhằm tiếp cận phương pháp, đào tạo Chưa thấy có những nghiên cứu đánh giá xuất phát từ nhu cầu của các nhà sản xuất Một mặt có thể do các nhà sản xuất dược phẩm ở Việt Nam chưa hiểu rõ và thấy được sự cần thiết của việc đánh giá TĐSH Mặt khác, qui chế đăng ký thuốc hiện hành của nước ta chưa qui định phải đệ trình kết quả đánh giá TĐSH khi đăng ký lưu hành cho những sản phẩm cần thiết

Để có cơ sở xem xét các thử nghiệm trên người, Bộ Y tế đã ban hành “Quy chế về tổ chức và hoạt động của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học” (số 5129/ 2002 QĐ-BYT) Hội đồng đạo đức cấp Bộ của Bộ Y tế cũng như hội đồng của các cơ sở đã được thành lập để xem xét đánh giá các đề tài nghiên cứu cấp tương ứng Ngoài ra, các tài liệu như hướng dẫn của khối Asean, WHO, FDA Mỹ và một số nước trong khu vực đã được xem xét và tham khảo trong quá trình thực hiện

đề tài này

Theo kế hoạch, Hội đồng Dược điển Việt nam đang biên soạn chuyên luận

chung “Hướng dẫn nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học các chế

phẩm thuốc” và dự kiến ban hành trong Dược điển Việt nam IV

Tháng 8/ 2003 được sự hỗ trợ kỹ thuật của WHO, Viện Kiểm nghiệm đã thực hiện nghiên cứu "Mô hình mẫu đánh giá TĐSH các dạng bào chế trên người tình nguyện” nhằm chuẩn hoá kỹ thuật trong đánh giá TĐSH in vivo ở Việt Nam Tiếp theo đó, một số đề tài cấp bộ đã thực hiện như đánh giá tương đương sinh học viên nang cephalexin, diclofenac, một số viên tác dụng kéo dài như theophylin, nifedipin Những nghiên cứu bước đầu mang tính chất thăm dò, chưa được thực hiện trong điều kiện tiêu chuẩn nên các kết quả còn hạn chế

Gần đây, một số doanh nghiệp dược trong nước đã quan tâm, yêu cầu đánh giá TĐSH cho các sản phẩm sản xuất trong nước: CT Dược VTYT Phú Yên, Công ty TNHH dược phẩm Sài gòn (SPM), Công ty Cổ phần Dược Hậu giang, Imexpharm, Domesco, Công ty TNHH Hasan Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có tài liệu nào công

bố kết quả thử TĐSH cho chế phẩm omeprazol của Việt Nam

Tình hình lưu hành chế phẩm omeprazol ở Việt nam:

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, Bộ Y tế đã cấp phép cho khoảng 42 chế phẩm của omeprazol lưu hành ở VN Hiện này, 37 sản phẩm có số đăng ký còn hạn, trong đó

có 25 sản phẩm nước ngoài và 12 sản phẩm trong nước Các sản phẩm này có giá chênh lệch nhau khá nhiều Chính vì vậy đã có những vụ thuốc mang nhãn hiệu giả (thuốc sản xuất ở VN mang tên Lomac - 2003) Dưới đây là một số chế phẩm đang được lưu hành ở Việt nam:

Bảng 2.3 Một số chế phẩm omeprazol đang lưu hành ở Việt nam

STT Tên sản phẩm – Nhà sản xuất Số đăng ký Giá bán lẻ

3 Lomac (Cipla – India) VN-3813-99 2 700 đ/ viên

4 Loress (Biological E Ltd VN-3692-99 1 000 đ/ viên

5 Romesec (Ranbaxy) VN-4092-99 1 000 đ/ viên

6 Omizac (Torrent Pharmaceutical) VN-3905-99 1 500 đ/ viên

7 Onacid (M/S Lark Laboratories) VN-3239-00 1 400 đ/ viên

8 Omeral (Synmedic Laborats) VN-4334-00 1 200 đ/ viên

9 Omezol (Synmedic Laborats) VN-4335-00 1 800 đ/ viên

10 Omeprazol (Brow & Burk) VN-4396-00 1 500 đ/ viên

Sản phẩm trong nước

1 Omezon (CTD Hà Tây) VNB-0243-02 700 đ/ viên

2 Omeprazol 20mg (CTD Vĩnh Phúc) VNA-2839-99 800 đ/ viên

3 Omeprazol (XNDP TW2) VNA-4617-01 500 đ/ viên

4 Omeprazol (CTCP Dược Hậu Giang) VNA-0417-02 900 đ/ viên

5 Omeprazol (± Dược phẩm 2/9) VNB-0011-02 600 đ/ viên

6 Vacomez (CTDP Long An) VNA-0116-02 700 đ/ viên

7 Omeprazol (CTCP Domesco) VNA-0169-02 1300 đ/ viên

8 Omecid (XNDP và sinh học Y tế

TPHCM)

VNA-0203-02 700 đ/ viên

9 Helinzole (± TNHH SPM) VNB-0516-03 1000 đ/ viên

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thiết kế nghiên cứu

3.1.1 Nghiên cứu in vitro

Nghiên cứu in vitro sử dụng phép thử độ hoà tan, thiết kế thử nghiệm trong 3 môi trường pH khác nhau tương ứng với 3 khoảng pH của đường tiêu hóa: 1,2 (dạ dày),

pH 4,5 (tá tràng) và pH 6,8 (ruột non)

Thử nghiệm song song trong cùng điều kiện, cùng thời điểm So sánh kết quả dữ liệu độ hòa tan của 2 chế phẩm và đánh giá các kết quả theo hướng dẫn của US – FDA và WHO

3.1.2 Nghiên cứu in vivo

Đề cương nghiên cứu chi tiết đã được Hội đồng đạo đức cơ sở của Viện Kiểm nghiệm thuốc TW thông qua theo phiếu chấp thuận số 02/ HĐĐĐ ngày 29/06/2005 Thiết kế nghiên cứu: Thiết kế chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn, lấy mẫu máu trong ngày thứ nhất (đơn liều) và ngày thứ 6 sau khi dùng thuốc liên tục 6 liều

- Thử nghiệm thăm dò thực hiện trên 3 NTN

- Thử nghiệm chính thức được thực hiện trên 20 NTN đã tuyển chọn đạt yêu cầu Người tình nguyện bốc thăm ngẫu nhiên để xác định thứ tự và phân nhóm Mỗi người tình nguyện sẽ uống cả 2 loại thuốc Người uống thuốc A trong giai đoạn 1 và uống thuốc B trong giai đoạn 2 và ngược lại Mỗi giai đoạn kéo dài 6 ngày, thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn là 1 tuần

Bảng 3.1: Kế hoạch uống thuốc và lấy mẫu

Ngày thứ Giai đoan I

3.2 Đối tượng và điều kiện nghiên cứu

3.2.1 Thuốc nghiên cứu

Thuốc nghiên cứu(A): Viên nang Helinzole (viên nang omeprazol 20 mg, dạng vi

nang bao tan trong ruột), đóng gói vỉ 8 viên ; SĐK VNB-0516-03, số lô: 0601003, NSX 18-01-06 Sản xuất bởi công ty TNHH dược phẩm Sài Gòn - SPM

Thuốc đối chứng (B): Lomac (viên nang omeprazol 20 mg, dạng vi nang bao tan

trong ruột), đóng gói vỉ 10 viên; SĐK VN 9020 – 04, số lô: 6014, NSX 12/2005 Sản xuất bởi: Cipla Ltd, Ấn Độ

3.2.2 Thiết bị, dung môi, hoá chất

Chất chuẩn:

- Omeprazol chuẩn quốc gia, SKS 0106199, hàm lượng 99,86%, độ ẩm 0,03%

- Albendazol chuẩn quốc gia, SKS 0103199, hàm lượng 99,55%, độ ẩm 0,04%

Dung môi, hoá chất:

- Acetonitril, methanol, dicloromethan loại dùng cho HPLC - Merck

- Isopropanol, n - hexan và các hoá chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng trong chiết tách và sắc ký

Huyết tương: dùng huyết tương trắng của người, mua tại Viện Huyết học và Truyền

máu Trung ương

Thiết bị: đã được hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISOIEC17025 và GLP

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Merck - Hitachi, L-7455, D-7000, DAD

- Các thiết bị: máy ly tâm lạnh, máy lắc, tủ bảo quản mẫu ở - 40oC và các loại dụng cụ thuỷ tinh có độ chính xác thích hợp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát độ hoà tan in vitro

Phương pháp thử độ hòa tan

Tiến hành phép thử độ hoà tan theo phương pháp chung ghi trong Dược điển Mỹ

và Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới, với các điều kiện cụ thể như sau:

- Thiết bị : Thiết bị thử độ hoà tan loại 1 (giỏ quay), tốc độ : 100vòng/ phút

- Môi trường: 900ml, 3 môi trường có pH khác nhau:

+ Môi trường pH 1,2 : Lấy 8,5 ml dung dịch HCl đậm đặc pha loãng vừa đủ

1000 ml nước điều chỉnh đến pH 1,2 với NaOH 0,1N

+ Môi trường đệm acetat pH 4,5: Hoà tan 2,99 gam Natri acetat trihydrat, thêm 14,0 ml acid acetic 2N, điều chỉnh đến pH 4,5 bằng acid acetic 0,5N

+ Môi trường đệm phosphat pH 6,8: Hoà tan 27,22 gam KH2PO4 trong vừa

đủ 1000 ml nước Điều chỉnh đến pH 6,8 bằng NaOH 0,5N

- Nhiệt độ môi trường hoà tan : 37oC ± 0,5oC

- Tiến hành: Mẫu thử và mẫu đối chứng được thử ĐHT song song, cùng thời điểm

trên cùng thiết bị, với các điều kiện như đã nêu ở trên, thử lần lượt trong 3 môi trường pH khác nhau Với mỗi mẫu thử , thử 12 viên / một môi trường

+ Với môi trường pH 6,8: Lấy dịch hoà tan để định lượng omeprazol tại các thời điểm : 5; 10; 15; 30 phút sau khi bắt đầu

+ Với môi trường pH 1,2 và 4,5: Sau 2 giờ, lấy hạt còn lại trong giỏ, hoà tan trong dung dịch NaOH 0,1N trong MeOH để tính lượng omeprazol Tính lượng omeprazol đã hoà tan bằng cách trừ đi lượng còn lại

Định lượng omeprazol

Định lượng omeprazol trong môi trường hoà tan bằng phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại tại bước sóng 302 nm

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg omeprazol chuẩn cho vào bình định

mức 100 ml Hoà tan và thêm tới vạch bằng dung dịch NaOH 0,1N trong MeOH

+ Với môi trường pH 1,2 và 4,5: Lấy 1 ml dung dịch chuẩn pha thành 100 ml

với NaOH 0,1N trong MeOH Dùng dung dịch NaOH 0,1N trong MeOH làm mẫu trắng Xác định % lượng đã hoà tan sau 2 giờ

+ Với môi trường pH 6,8: Lấy 2 ml dung dịch chuẩn pha thành 50 ml với môi trường pH 6,8 Dùng môi trường pH 6,8 làm mẫu trắng Với từng mẫu , tính lượng Omeprazol giải phóng ra tại mỗi thời điểm Xác định % hoà tan trung bình tại mỗi thời điểm so với hàm lượng ghi trên nhãn và độ lệch chuẩn tương đối

Đánh giá kết quả

- Môi trường pH 6,8: Theo hướng dẫn của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (US-FDA) và dự thảo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới, so sánh kết quả và tính giá trị F2 theo công thức:

F2 = 50 x log{[1+(1/n)Σnt

=1(Rt – Tt)2]-0.5 x100}

Trong đó : Rtlà % hoà tan của thuốc chứng tại thời điểm t

Tt là % hoà tan của thuốc thử tại thời điểm t

Nếu F2 ≥ 50 hai chế phẩm được coi là có độ hoà tan tương đương ở môi trường này

- Môi trường pH 1,2 và 4,5: Do Omeprazol không bền trong hai môi trường này Nên chỉ tiến hành so sánh % lượng hoà tan được sau 2 giờ của chế phẩm thử và chế phẩm đối chứng

3.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol trong huyết tương

Dùng các mẫu huyết tương tự tạo để khảo sát và thẩm định phương pháp phân tích

- Dung dịch chuẩn omeprazol: pha chất chuẩn omeprazol trong methanol để có các nồng độ thích hợp

- Dung dịch chuẩn nội: pha chất chuẩn albendazol trong methanol để được nồng độ thích hợp

- Mẫu tự tạo: Lấy một thể tích dung dịch chuẩn omeprazol có nồng độ tương ứng, bốc hơi dung môi dưới luồng khí nitơ Hoà tan cắn trong huyết tương trắng

Nghiên cứu chiết tách omeprazol từ huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng

sử dụng hỗn hợp dung môi hữu cơ; bốc hơi dung môi, hoà tan cắn trong pha động để

chạy sắc ký Khảo sát xác định các điều kiện sắc ký với các loại cột khác nhau, thành phần và tỷ lệ pha động thích hợp để cho khả năng tách tốt nhất

Dung dịch đệm phosphat pH 7,2: pha theo dược điển Mỹ

Thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu qui định của dược điển và hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học của US – FDA [18] Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm:

- Tính đặc hiệu (chọn lọc): thử trên mẫu huyết tương trắng và huyết tương của NTN tại thời điểm trước khi uống thuốc

- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

- Độ chính xác (độ lệch so với giá trị thực)

- Độ đúng (độ lặp lại của các lần phân tích, biểu thị bằng hệ số biến thiên, CV)

- Độ ổn định của omeprazol trong huyết tương khi bảo quản (sau 3 chu kỳ đông - rã đông và bảo quản dài ngày), độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc và nội chuẩn gốc trong ngày và thời gian dài

- Hiệu suất chiết (% so với mẫu chuẩn pha trong pha động, không qua giai đoạn chiết tách

3.3.3 Đánh giá tương đương sinh học in vivo

3.3.3.1 Tuân thủ qui định về đạo đức

- Đề cương nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức cơ sở phê duyệt (Quyết định số 02/HĐ ĐĐ ngày 29 tháng 06 năm 2005

Chủ tịch: Ths Bùi Thị Hòa, Phó viện trưởng, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Phiếu chấp thuận được kèm theo trong phụ lục 1

- Nghiên cứu này đã được thực hiện tuân thủ theo các nguyên tắc đạo đức theo tuyên

bố Helsinki và Hướng dẫn thực hành lâm sàng tốt (GCP)

- Bản cam kết của người tình nguyện được ký một cách tự nguyện trước khi tiến hành nghiên cứu Mẫu bản cam kết được đưa trong phụ lục 1

- Đánh giá chung về tình hình sức khoẻ, khám tổng quát về tim mạch, tiêu hoá, thần kinh, chiều cao, cân nặng, huyết áp, nhịp thở, tất cả phải trong giới hạn bình thường;

- Các chỉ số xét nghiệm máu đều phải trong giới hạn bình thường Xét nghiệm bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit; Sinh hoá lâm sàng: AST(GOT), ALT(GPT), creatinine, glucose;

- Xét nghiệm kháng thể HIV và kháng nguyên viêm gan B phải âm tính Tiêu chuẩn loại trừ:

- NTN nghiện ma tuý, rượu hoặc thuốc lá;

- Người đang có những rối loạn về tim mạch, hô hấp, thận, tiêu hóa, miễn dịch, huyết học, nội tiết, hệ thần kinh hoặc bệnh tâm thần ;

- Người có các giá trị xét nghiệm nằm ngoài khoảng bình thường ;

- Người nghi ngờ có nhiễm HIV và HbsAg (dương tính với phép thử nhanh)

- Người có tiền sử dị ứng với omeprazol hoặc các thuốc cùng nhóm;

- Người mới bị ốm trong vòng 2 tuần trước khi uống thuốc giai đoạn I;

- Người đã dùng bất kỳ một loại thuốc nào gây cảm ứng hoặc ức chế chuyển hoá thuốc ở gan trong vòng 28 ngày trước khi uống thuốc giai đoạn I;

Qui trình kiểm tra NTN khi tuyển chọn: Tuyển chọn và kiểm tra NTN theo các chỉ tiêu trên trong vòng 2 tuần trước khi bắt đầu uống thuốc giai đoạn 1

Loại bỏ NTN khi phân tích, đánh giá:

Không dùng mẫu của NTN vào phân tích nếu:

- NTN rút lui trong quá trình nghiên cứu, không tham gia hết các giai đoạn

- Trong hoặc sau khi nghiên cứu, phát hiện thấy NTN không tuân thủ những qui định của nghiên cứu

- NTN bị nôn hoặc ỉa chảy trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc hoặc có các phản ứng bất lợi nghiêm trọng trong khi uống thuốc và lấy mẫu

- Số các mẫu máu lấy bị mất ≥ 4 điểm

Không dùng số liệu của NTN vào tính thống kê nếu:

Mất ≥ 2 điểm lấy mẫu liên tiếp trong pha hấp thu hoặc xung quanh Tmax;

3.3.3.3 Liều dùng, cách dùng: mỗi giai đoạn, mỗi NTN sẽ uống 1 viên 20mg thuốc

thử hoặc thuốc đối chứng vào buổi sáng với 200ml nước tinh khiết, uống liên tục trong 6 ngày

Người tình nguyện uống thuốc liên tục trong 6 ngày (theo thiết kế) Những ngày từ thứ 2 đến thứ năm của cả hai giai đoạn (không lấy mẫu máu), NTN tập trung uống thuốc vào đầu giờ buổi sáng tại phòng lấy mẫu Nghiên cứu viên trực tiếp cho uống thuốc và ghi chép các phản ứng bất lợi (nếu có)

( ) ( )

Riêng các ngày có lấy mẫu (ngày 1 và ngày thứ 6), NTN tập trung tại khu vực lấy mẫu từ tối hôm trước Bữa tối trước ngày lấy mẫu máu, NTN chỉ được ăn nhẹ và ăn trước 10 giờ đêm, nước uống theo nhu cầu Trước khi uống thuốc, NTN được khám lâm sàng, kiểm tra huyết áp, tim mạch, nhịp thở để đảm bảo họ đang trong tình trạng khỏe mạnh Trong vòng 1 giờ trước và sau khi uống thuốc, NTN không được uống nước Bữa ăn được thực hiện 4 giờ sau khi uống thuốc Khẩu phần ăn được qui định bởi nhóm nghiên cứu và đồng nhất giữa các NTN Trong suốt thời gian tiến hành lấy máu, NTN chỉ được uống nước tinh khiết, không được uống sữa, nước chè, cà phê, coca hoặc bất kỳ một loại nước tăng lực nào

3.3.3.4 Cách lấy máu: Dùng kim vô khuẩn luồn vào tĩnh mạch cẳng tay của mỗi

NTN và cố định sao cho không cản trở các hoạt động bình thường của cẳng tay Lấy máu bằng bơm tiêm rồi cho vào các ống nghiệm đã có sẵn chất chống đông (EDTA, 10mg/ ống) Thời điểm lấy mẫu: 0h (ngay trước lúc uống thuốc) và các thời điểm 30’; 60’; 90’, 2h, 2h30; 3h; 3h30’; 4h; 5h; 6h; và 8 giờ sau khi uống thuốc

Mỗi lần lấy khoảng 6 ml máu Các mẫu máu được ly tâm, tách lấy phần huyết tương Huyết tương được bảo quản ở - 40°C cho đến khi tiến hành phân tích

Quá trình cho uống thuốc và lấy mẫu máu được thực hiện tại phòng lấy mẫu đặt tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, 48 – Hai Bà Trưng, Hà Nội Các bác sĩ, y tá của Bệnh viện Bạch Mai (do BS Phạm Duệ phụ trách) cùng phối hợp theo dõi, giám sát và chăm sóc y tế cho NTN Phương tiện và thuốc cấp cứu cho các phản ứng sốc phản vệ và phản ứng bất lợi được chuẩn bị sẵn sàng để sơ cứu tại chỗ Trường hợp nặng sẽ được gửi tới phòng cấp cứu, BV Việt nam – Cuba, 37 – Hai Bà Trưng hoặc chuyển tới Bệnh viện Bạch Mai, 79 - Đường Giải phóng Quá trình lấy mẫu tuân thủ

theo Hướng dẫn thực hành lâm sàng tốt (GCP) của Tổ chức Y tế thế giới

Tất cả người tình nguyện đều tham gia đầy đủ và được uống thuốc theo đúng thiết

kế nghiên cứu

3.3.3.5 Phân tích mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc

Sử dụng phương pháp phân tích đã được thẩm định để định lượng các mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc

Khi phân tích, huyết tương được lấy ra khỏi tủ bảo quản và để tan chảy ở nhiệt độ phòng Tiến hành phân tích ngay sau khi để tan chảy Mẫu huyết tương của mỗi NTN (bao gồm cả thuốc thử và thuốc đối chứng, đơn liều và 6 liều được phân tích trong cùng 1 ngày với cùng một đường chuẩn và điều kiện phân tích

3.3.3.6 Xác định các thông số dược động học:

Thông số dược động học của từng NTN được xác định bao gồm:

- Nồng độ thuốc tối đa (Cmax): xác định trực tiếp trên giá trị đo được

- Diện tích dưới đường cong (AUC0 – t; AUC0 – ∞): xác định bằng phương pháp hình thang,

MSE N

t R

- Phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% (CI) của các giá trị tỷ

lệ LnCmax và LnAUC0 – ∞ trung bình giữa thuốc thử và thuốc đối chứng:

Trong đó: T: Giá trị Cmax hoặc AUC 0-∞ của thuốc thử

R: Giá trị Cmax hoặc AUC 0-∞ của thuốc chứng N’: Bậc tự do của sai số xác định bằng ANOVA MSE: Trung bình bình phương của sai số xác định bằng ANOVA N: Tổng số NTN tham gia đánh giá TĐSH

- So sánh giá trị Tmax được tính theo phương pháp phân tích không tham

số của Wilcoxon (Wilcoxon signed – rank test) Giá trị Tmax của thuốc

thử và thuốc chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) khi

tổng thứ tự xếp hạng dương và âm (sum of possitive/negative rank) lớn

hơn giá trị tra bảng với cỡ mẫu n (n là số lượng cặp giá trị Tmax thuốc thử

và thuốc chứng có sai khác) Kết quả đánh giá Tmax có thể chỉ mang tính chất thông tin và không căn cứ để so sánh đánh giá TĐSH

Hai chế phẩm tương đương sinh học nếu khoảng tin cậy 90% của tỷ lệ Cmax và AUC0–∞ trung bình, tính thống kê với giá trị đã chuyển đổi logarit của thuốc thử so với thuốc đối chứng nằm trong khoảng 80 – 125 %

Tính thống kê riêng cho mô hình đơn liều/ đa liều

- Qui trình đánh giá TĐSH chế phẩm viên nang omeprazol bao tan trong ruột

Qui trình phân tích lựa chọn thiết bị phù hợp với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm Việt Nam

Để xây dựng qui trình thử TĐSH, xác định cỡ mẫu tối thiểu (số lượng người tình nguyện) cần thiết cho nghiên cứu, xác định thiết kế nghiên cứu là đơn liều, đa liều hay kết hợp Trong từng trường hợp đơn liều hay đa liều, tính kết quả thống kê theo

2 cỡ mẫu khác nhau: 12, 18 Với cỡ mẫu 12, lấy ngẫu nhiên số cá thể trong số 18 để tính toán Dựa trên kết quả thu được, nhận định và lựa chọn cỡ mẫu phù hợp để đưa vào qui trình

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Khảo sát độ hoà tan invitro

4.1.1 Thử độ hoà tan trong môi trường pH 4,5 và pH 1,2

Omeprazol rất bị phân huỷ trong môi trường acid, thực tế chúng tôi đã khảo sát mức

độ phân huỷ, kết quả cho thấy:

- Chuẩn omeprazol pha trong HCl 0,1N, sau 30 phút nhận thấy dung dịch

chuyển sang màu vàng

- Quét phổ hấp thụ tử ngoại, cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại đã bị dịch chuyển

về phía bước sóng dài Kết quả được ghi ở hình 4.1

Bảng 4.1 Kết quả thử độ hoà tan viên nang Helinzole và Lomac trong môi

trường pH 1,2 và pH 4,5 sau 2 giờ

Lượng hòa tan (%) trong pH 1,2 Lượng hòa tan (%) trong pH 4,5

So sánh kết quả độ hoà tan giữa thuốc thử và thuốc chứng cho thấy lượng omeprazol

hoà tan được trong môi trường pH 1,2 và 4,5 khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<

0,01)

Hình 4.1: Phổ UV của chuẩn omeprazol trong môi trường acid sau 30 phút

Bảng 4.2 Kết quả thử độ hoà tan viên nang Helinzole trong môi trường pH 6,8

Lượng Omeprazol hoà tan (%) STT

Bảng 4.3 Kết quả thử độ hoà tan viên nang Lomac trong môi trường pH 6,8

Lượng Omeprazol hoà tan (%) STT

Theo công thức, giá trị F 2 = 47,6

Với kết quả thu được cho thấy viên nang Lomac và Helinzole thuộc loại

dễ tan trong môi trường pH 6,8 (sau 30 phút lượng hoà tan đạt 88% và 99,5%)

So sánh độ hoà tan của 2 chế phẩm giá trị F2 xác định được 47,6 chứng tỏ 2 chế

phẩm có độ hoà tan trong môi trường pH 6,8 không tương đương

4.2 Xây dựng phương pháp phân tích omeprazol trong huyết tương

4.2.1 Xây dựng phương pháp

Khảo sát với một số dung môi và qui trình chiết khác nhau, chúng tôi đã chọn

được phương pháp chiết lỏng – lỏng để tách omeprazol ra khỏi huyết tương Qui

trình chiết được tóm tắt như sau: lấy 1ml mẫu huyết tương (tự tạo), thêm dung dịch

đệm Borat pH 9,0 và chiết bằng hỗn hợp dung môi dicloromethan: isopropanol:

n-hexan Lắc trộn kỹ, ly tâm Lấy lớp dung môi, bốc hơi thu được cắn, hoà tan cắn

trong pha động, lọc và tiêm vào máy sắc ký

Hình 4.2 : Qui trình xử lý mẫu huyết tương

-Điều kiện sắc ký HPLC: Bằng thực nghiệm, điều kiện sắc ký đã được xác định:

+ Cột: Cột RP18, 250mm x 4,6 mm ; 5µm

+ Pha động: methanol: acetonitril: đệm phosphat pH 7,2 với tỷ lệ thích hợp + Tốc độ dòng: điều chỉnh tốc độ từ 1 – 2 ml/ phút theo thời gian để có thể tách được omeprazol ra khỏi các pic tạp và thời gian phân tích phù hợp

+ Detector: 302nm

+ Thể tích tiêm mẫu: 100µl

+ Chuẩn nội: Albendazol

Hỗn hợp + dung môi chiết

Dịch

Chạy sắc ký

4.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tính đặc hiệu

Tiến hành phân tích mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương tự tạo (bằng cách pha chuẩn omeprazol trong huyết tương trắng) Kết quả thu được các sắc đồ như trên hình 4.3

Khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 20, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/ml Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn Kết quả ghi trong bảng 4.4 và

Đường chuẩn Omeprazol

y = 0.0052x + 0.0078

R 2 = 0.9992

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00

Hình 4.4: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội

theo nồng độ omeprazol chuẩn pha trong huyết tương

Từ kết quả thu được cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương

quan tuyến tính giữa nồng độ omeprazol trong mẫu huyết tương với tỷ lệ diện tích

pic chuẩn/ chuẩn nội thu được (r = 0,9996) Khoảng tuyến tính này phù hợp để định

lượng omeprazol trong huyết tương

Giới hạn định lượng dưới

Pha mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 20 ng/ml trong huyết tương Tiến hành

chiết và sắc ký theo các điều kiện đã chọn Kết quả thu được ghi trong bảng 4.5

Bảng 4.5 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới

Diện tích pic Huyết tương trắng có pha chuẩn

Omeprazol và Albendazol Huyết tương trắng STT

Tại vị trí tR = 5,2 phút và 8,0 phút đáp ứng của mẫu chuẩn có nồng độ 20 ng/ml

gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng và độ lặp lại sau 6 lần phân tích với CV < 20%

Như vậy mẫu chuẩn chứa Omeprazol có nồng độ 20 ng/ml đáp ứng yêu cầu là giới hạn định lượng dưới cho phép trong phương pháp phân tích dịch sinh học

Độ chính xác, độ đúng

Tiến hành phân tích và sắc ký các mẫu tự tạo pha ở 3 khoảng nồng độ theo các điều kiện đã chọn, phân tích nhiều lần trong ngày và giữa các ngày Kết quả thu được ghi trong bảng 4.6 và 4.7

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát chính xác, độ đúng trong ngày

(%)

Lượng tìm thấy (ng/ml)

Độ chính xác

(%)

Lượng tìm thấy (ng/ml)

Độ chính xác

tìm thấy (ng/ml)

Độ chính xác (%)

Lượng tìm thấy (ng/ml)

Độ chính xác (%)

Lượng tìm thấy (ng/ml)

Độ chính xác (%)

Ngày 1 44,2 88,4 232,6 93,0 490,1 98,0 Ngày 2 55,5 111,0 257,2 102,9 482,1 96,4