Một Phương Pháp Real-Time Pcr Kép Mới Được Phát Triển Cho Salmonella Spp. Và Phát Hiện Listeria Monocytogenes Trong Các Mẫu Thực Phẩm Và Môi Trường.pdf

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Một phương pháp real time PCR kép mới được phát triển cho Salmonella spp và phát hiện Listeria monocytogenes trong các mẫu thực phẩm và môi[.]

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp.và phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Nguyen Trung Kien Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm mơi trường THƠNG TIN BÀI BÁO Tên báo: A new real-time PCR developed method for Salmonella spp and Listeria monocytogenes detection in food and environmental samples Tạm dịch: Phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Tác giả: Alejandro Garrido, María-José Chapela, Belén Román, Paula Fajardo, Jorge Lago, Juan M Vieites, Ana G Cabado Được đăng tạp chí: Food Control Trang chủ tạp chí: www.elsevier.com/locate/foodcont Ngày báo chấp nhận: 20/06/2012 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm mơi trường TĨM TẮT Bất chấp nỗ lực ngành công nghiệp, số tác nhân gây bệnh từ thực phẩm tiếng Salmonella spp Listeria monocytogenes, tiếp tục thách thức tổ chức y tế mối đe dọa người tiêu dùng Mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp realtime PCR (qPCR) hồn chỉnh, nhanh chóng đáng tin cậy để phát đồng thời hai loại vi khuẩn mẫu thực phẩm môi trường, bao gồm môi trường tăng sinh đơn lẻ (TA10) cho hai loại vi khuẩn Môi trường TA10 thay đổi (độ pH nồng độ đệm) để tăng cường phát triển đồng thời hai mầm bệnh có số lượng lớn vi khuẩn cạnh tranh Ngồi ra, hai giao thức tách chiết DNA khác so sánh đạt hiệu qPCR 90%, bao gồm bậc độ lớn Phương pháp hoàn chỉnh đạt giới hạn phát thấp (5 CFU/25g) tất thông số chất lượng phương pháp trả giá trị 90% Phương pháp qPCR hoàn chỉnh áp dụng cho 95 mẫu tự nhiên bao gồm nhiều loại thực phẩm chứng minh phương pháp qPCR mô tả, bao gồm việc sử dụng môi trường tăng sinh nhất, TA10 sửa đổi, phù hợp để sàng lọc đồng thời Salmonella spp L monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Giới thiệu Các bệnh thực phẩm vấn đề sức khỏe cộng đồng có chiều hướng gia tăng gây ảnh hưởng đến nước phát triển phát triển, thực phẩm nước bị ô nhiễm, nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh toàn cầu chúng khó ước tính, nhìn chung đa số đồng ý tỷ lệ dân số mắc bệnh thực phẩm hàng năm lên tới 30% nước cơng nghiệp hóa số tồi tệ nước phát triển (Germini, Masola, Carnevali, & Marchelli, 2009) Nhằm giảm thiểu nguy lây nhiễm cho người tiêu dùng, việc kiểm soát vi sinh chuỗi thực phẩm áp dụng ngày nhiều Do đó, sẵn có hệ thống xét nghiệm đáng tin cậy, nhanh chóng quốc tế chấp nhận để xác định có mặt mầm bệnh từ thực phẩm ngày trở nên quan trọng ngành nông nghiệp thực phẩm, quy định pháp lý an toàn thực phẩm (Malorny, Hoorfar , Bunge, & Helmuth, 2003) nêu quy định 2073/05 sửa đổi 1441/07 ((EC), 2005, 2007) Vi khuẩn gây bệnh thường diện với số lượng thấp nên gây khó khăn cho việc phục hồi sinh vật cần xác định (Kawasaki, Fratamico, Kamisaki-Horikoshi, cộng sự., 2010) Vào đầu năm 1990, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng để xác định đơn giản vi khuẩn khiết khuẩn lạc đĩa thạch Kể từ đó, phát triển chế phẩm mẫu thích hợp cho PCR phát vi khuẩn thực phẩm môi trường tiền tăng sinh mở rộng nhiều (Rijpens & Herman, 2002) số nghiên cứu xác nhận PCR báo cáo phương pháp PCR phương pháp hứa hẹn số phương pháp phương pháp vi sinh nhanh chóng để phát xác định vi khuẩn nhiều loại mẫu (Myint, Johnson, Tablante, & Heckert, 2006) chứng minh trước (Chapela cộng sự, 2010; Garrido cộng sự, 2012) Các kỹ thuật dựa PCR PCR kép, PCR phiên mã Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường ngược, xét nghiệm dấu vân tay DNA, PCR định lượng kỹ thuật khuếch đại thay khuếch đại dựa trình tự axit nucleic (NASBA), số kỹ thuật khác, giới thiệu năm qua (Rijpens & Hermann, 2002) Trong đó, realtime PCR có độ nhạy cao, nhanh chóng cho phép hoàn thành xét nghiệm 48 (Navas cộng sự., 2006) Tuy nhiên, độ tin cậy phương pháp phát dựa PCR phần phụ thuộc vào số lượng tế bào vi khuẩn, tức số lượng phân tử đích có mẫu thực phẩm Phương pháp phát cho Salmonella spp vi khuẩn Listeria monocytogenes gây bệnh thực phẩm dựa việc tăng sinh cách sử dụng môi trường chọn lọc để tăng nồng độ vi khuẩn điển hình, sau thực PCR để xác định Có hai trở ngại lớn việc phát đơn giản nhanh chóng Salmonella spp mầm bệnh L monocytogenes thực phẩm: (a) thiếu mơi trường tăng sinh đồng thời Salmonella spp L monocytogenes; (b) diện chất ức chế PCR thực phẩm thịt bò thịt gà, môi trường tổng hợp dung dịch chuẩn bị DNA (Bhaduri & Cottrell, 2001; Lantz, Hahnhagerdal, & Radstrom, 1994; Lantz cộng sự, 1998) Mặc dù độ nhạy nhiều phương pháp phát hiện đại cải thiện đáng kể, bước tăng sinh cần thiết để khắc phục vấn đề số lượng mầm bệnh thấp hạn chế rủi ro phát tế bào chết (Badosa, Chico, Pla, Pares, & Montesinos, 2009 ; Kim & Bhunia, 2008; Lantz cộng sự, 1994; Mahmuda, Kawasaki, & Kawamoto, 2007) độ nhạy chúng bị hạn chế (Kimura cộng sự, 1999) Liên quan đến PCR, phản ứng giảm đáng kể mẫu chứa chất ức chế PCR (Lantz cộng sự., 1994) Bước tăng sinh không cần thiết để tăng nồng độ mầm bệnh mẫu mà để phục hồi tế bào bị tổn thương căng thẳng mặt sinh lý Tăng sinh có chọn lọc cần thiết để ngăn chặn vi sinh vật tự nhiên cải thiện hiệu phát tránh kết âm tính giả Tuy nhiên, nhược điểm số canh thang tăng sinh chọn lọc tác nhân chọn lọc ức chế làm Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường chậm phát triển vi sinh vật khỏe mạnh phục hồi mầm bệnh mục tiêu bị căng thẳng, ảnh hưởng đến việc phát mầm bệnh có khả phục hồi phát triển thực phẩm tiêu thụ (Kawasaki cộng sự, 2009; Kim & Bhunia, 2008) Ngoài ra, giải pháp tách chiết DNA tạo điều kiện cho hiệu PCR cách giảm độ nhạy xét nghiệm DNA đích Một loạt phương pháp phát triển để chuẩn bị mẫu PCR xác định nhu cầu kỹ thuật phù hợp với loại thực phẩm (Bhaduri & Cottrell, 2001) Một số nghiên cứu báo cáo việc sử dụng hệ thống PCR kép để phát hai nhiều mầm bệnh xét nghiệm (Mahmuda cộng sự., 2007) Phương pháp phát đa mầm bệnh hấp dẫn lợi ích mặt kinh tế giảm tổng yêu cầu không gian để xử lý số lượng lớn mẫu, không gian bàn, vật tư, thuốc thử lao động cần thiết, giảm tổng chi phí xét nghiệm cho mầm bệnh (Elizaquivel & Aznar, 2008; Ruiz-Rueda, Soler, & Calvo, 2010; Singh, Batish, & Grover, 2011) Hơn nữa, phương pháp ghép kênh phương pháp hợp lý nhiều loại thực phẩm, chẳng hạn sữa, sản phẩm từ sữa, thịt, gia cầm, trái rau quả, chất mang phổ biến nhiều mầm bệnh như, Salmonella enterica, Escherichia coli L monocytogenes (Kim & Bhunia, 2008) Như quan sát từ số lượng lớn phương pháp PCR đơn phức hợp công bố để phát Salmonella spp Và L monocytogenes (Calvo, MartinezPlanells, Pardos-Bosch, & Garcia-Gil, 2008; Cheng cộng sự, 2008; Hyeon cộng sự, 2010; Kawasaki, Kimura, & Fujii, 2001; Lofstrom, Hansen, & Hoorfar , 2010; Malorny, Huehn, Dieckmann, Kramer, & Helmuth, 2009; Myint cộng sự, 2006; Navas cộng sự, 2006; Poltronieri, de Blasi, & D'Urso, 2009; Rantsiou, Alesandria, Urso, Dolci, & Cocolin, 2008; Rodriguez-Lazaro, Jofre, Aymerich, Hugas, & Pla, 2004; Rossmanith, Krassnig, Wagner, & Hein, 2006; Vanegas, Vasquez, Martinez, & Rueda, Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường 2009) phương pháp PCR kép (Badosa cộng sự, 2009; Elizaquivel, Gabaldon, & Aznar, 2010; Germini cộng sự, 2009; Jofre cộng sự, 2005; Kawasaki, Fratamico, Horikoshi, cộng sự, 2010; Kim & Bhunia, 2008; Mahmuda cộng sự, 2007; Omiccioli, Amagliani, Brandi, & Magnani, 2009; Ruiz- Rueda cộng sự, 2010; Singh cộng sự, 2011; Suo, He, Tu, & Shi, 2010; Zhang cộng sự, 2009) số người khác, rõ ràng mầm bệnh tiếp tục mối nguy hiểm cho sức khỏe vấn đề nghiêm trọng ngành công nghiệp thực phẩm ch cần phương pháp nhanh đáng tin cậy Để đạt giới hạn phát yêu cầu Salmonella spp (khơng có 25 g mẫu) khơng cho phép L monocytogenes thực phẩm ăn liền hầu hết quốc gia, thử nghiệm kết hợp với bước tiền tăng sinh tinh DNA (Badosa cộng sự., 2009) Tuy nhiên, người ta không ý nhiều đến việc phát triển canh trường để phục hồi đồng thời hai loại vi khuẩn đánh giá nghiên cứu khan công bố năm qua, nhấn mạnh điều sau (Kawasaki cộng sự., 2005; Kim & Bhunia, 2008 ; Kobayashi cộng sự, 2009) Nước dùng tiền tăng sinh đa (UP) phát triển để phát đồng thời Salmonella Listeria thực phẩm, vào thời điểm đó, nhiều loại thực phẩm phân tích để tìm hai mầm bệnh này, không đồng thời Môi trường cho phép vi khuẩn bị tổn thương da hồi phục sinh sôi nảy nở mức cao để sử dụng mơi trường tăng sinh chọn lọc (Hammack, Amaguana, Johnson, & Andrews, 2003) Các nghiên cứu sau chứng minh nước dùng số 17 cho thấy khả phục hồi cao nước dùng UP Salmonella bị thương lượng hợp chất dinh dưỡng cao (Kamisaki-Horikoshi cộng sự, 2011) Mục đích công việc phát triển giao thức hoàn chỉnh để phát Salmonella spp L.monocytogenes, bao gồm môi trường tăng sinh đơn lẻ, Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường phương pháp tách chiết DNA hệ thống phát PCR thời gian thực ghép kênh (qPCR) có khả đạt giới hạn phát thấp, có nhiều VSV khác Môi trường chọn đánh giá khả đạt mật độ vi khuẩn cao S.enterica L.monocytogenes nuôi cấy riêng lẻ đồng thời với đối thủ chung khác Phương pháp tách chiết DNA chọn so sánh với quy trình đun sơi thơng thường nữa, phản ứng PCR xác kiểm soát điều khiển khuếch đại bên Cuối cùng, giao thức hoàn chỉnh sửa đổi áp dụng cho mẫu tự nhiên để đánh giá diện Salmonella spp L.monocytogenes Vật liệu phương pháp 2.1 Chủng vi khuẩn môi trường nuôi cấy Các chủng sử dụng làm chủng tham chiếu để đánh giá canh thang TA10 biến đổi là: S.enterica CECT 4594 L.monocytogenes CECT 935 Vi khuẩn bảo quản đông lạnh 20oC sử dụng Ngoài ra, hai chủng Salmonella spp số L.monocytogenes phân lập từ mẫu thịt phịng thí nghiệm kiểm soát thực phẩm địa phương sử dụng cho thí nghiệm bổ sung Tất sinh vật khác sử dụng nghiên cứu tóm tắt Bảng Nuôi cấy tất chủng sử dụng nghiên cứu thu cách cấy ống 10 mL Tryptic Soy Broth (TSB, Bio-Mérieux S.A., France) Tất chủng ủ 37 oC qua đêm, ngoại trừ Bacillus subtilis ủ 31oC Để biết giá trị tham chiếu loại vi khuẩn gây bệnh nghiên cứu, chúng nuôi cấy mô tả trên, pha loãng liên tiếp 10 lần Nước đệm Peptone (BPW, Biokar diagnostics S.A., France) cấy Tryptic Soy Agar (TSA, Biokar chẩn đoán S.A., Pháp) S.enterica Tryptic Soy Yeast Extract Agar (TSYEA, Biolife Italiana S.r.l., Italy) L monocytogenes Và ủ 18 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường 37oC Giá trị tham khảo VSV khác cấy TSA, ngoại trừ Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus cấy Nutrient Agar (NA, Biokar diagnostics S.A., France) bổ sung 10 g/L natri clorua Canh thang TA10, tên thương mại canh thang số 17 (Kamisaki-Horikoshi cộng sự, 2011; Kawasaki cộng sự, 2005), chọn để tăng sinh mẫu qPCR Môi trường sửa đổi theo đề xuất (Omiccioli cộng sự, 2009), người tuyên bố dextrose không cần thiết để phục hồi thành công Salmonella spp Và L monocytogenes Một sửa đổi bổ sung thực nghiên cứu thay đổi lượng muối đệm sử dụng để tăng độ pH cuối nước dùng lên 7,2 ± 0,2 (thành phần mơi trường: tryptose 10,0 g/L, chiết xuất thịt bị 5,0 g/L, chiết xuất nấm men 5,0 g /L, natri clorua 5,0 g/L, dinatri photphat 19,3 g/L, monokali photphat 3,4 g/L) Đánh giá phát triển đồng thời Salmonella spp., L monocytogenes, xác định cách cấy dung dịch pha loãng nối tiếp mười lần thạch Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) thạch COMPASS Listeria (Biokar diagnostics S.A., Pháp) để định lượng S enterica L monocytogenes tương ứng Các đĩa ủ 37oC 24 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Bảng Các chủng vi khuẩn sử dụng để đánh giá suất cấy mẫu 2.2 Đánh giá môi trường mTA10 10 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Mặt khác, tác giả khác cần phải làm giàu hai bước, sơ cấp thứ cấp, để thu số lượng kết dương tính cao PCR với L monocytogenes (Navas cộng sự., 2006) Ngoài diện chất ức chế thực phẩm môi trường tăng trưởng, ADN khai thác theo truyền thống bao gồm khai thác mẫu phenol e chloroform sau kết tủa DNA phương pháp etanol lạnh Một bất lợi phương pháp số phân số ADN thường xuyên suốt thủ tục gây khó khăn đến việc xử lý đồng thời nhiều mẫu thời gian ngắn Các hệ thống hai pha nước trước sử dụng mẫu nhanh chóng đơn giản chuẩn bị phương pháp đến tách rời PCR chất ức chế Trong mềm phô mai từ L monocytogenes đến tách rời PCR chất ức chế phân tử Helicobacter pylori Một nhược điểm phương pháp độ nhạy PCR bị ảnh hưởng tiêu cực vi khuẩn mục tiêu phân chia với bề mặt hệ thống hai pha nước với pha có chứa PCR chất ức chế Tỉ trọng ly tâm sử dụng để loại bỏ chất ức chế PCR phát vi khuẩn gây bệnh phô mai xanh thịt bị Việc giảm độ nhạy PCR vi khuẩn bám vào mẫu thực phẩm, đặc biệt thịt băm Những phần đính kèm dẫn đến vi khuẩn phát vi khuẩn khơng gắn kết phân tách ly tâm mật độ (Lantz cộng sự., 1998) Khi phát kết âm tính, điều quan trọng phải biết liệu PCR thất bại xảy có thật phủ định PCR kết Một kết PCR âm tính khơng thiết khơng có DNA mẫu mẫu Các chất ức chế có mẫu ảnh hưởng đến kết PCR cách giảm ngăn chặn hồn tồn q trình xảy (Rip & Gouws , 2009) Các nghiên cứu trước thường sử dụng hai canh thang để làm giàu Salmonella spp L monocytogenes (tương ứng nước đệm Peptone môi trường Half-Fraser 28 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường (Badosa cộng sự., 2009; Chua & Bhagwat, 2009; Jofre cộng sự, 2005; Ruiz-Rueda cộng sự, 2010)) thử ứng dụng phát triển môi trường nuôi cấy cho hai loại vi khuẩn, chung (Tryptic Soy Broth (Germini cộng sự., 2009 ), Môi trường dinh dưỡng (Zhang cộng sự, 2009), SEB ( Kobayashi cộng sự, 2009 ), Số 17 (Kawasaki cộng sự, 2005 )) chọn lọc ( SEL ( Kim & Bhunia, 2008 )) Một yếu tố ảnh hưởng đến phục hồi vi khuẩn từ thực phẩm sụt giảm độ pH liên quan đến phát triển vi khuẩn Đây lý nhiều tác giả đề xuất sử dụng nước dùng có độ đệm cao nghèo carbohydrate ( Kawasaki cộng sự., 2005; Omiccioli cộng sự, 2009 ) Một hệ số xem xét phần lớn hầu hết môi trường dành cho việc thu hồi L monocytogenes Salmonella spp giá trị pH nhẹ (BPW, TSB, Fraser Broth, Buffered Listeria Enrichment Broth, số loại khác) Môi trường điều chế mô tả thí nghiệm thiết kế theo khái niệm này, với giá trị pH cuối 7,2 ± 0,2 Ngoài ra, phương pháp tách chiết DNA đơn giản khơng có phenol chloroform đảm bảo khơng độ nhạy cao xét nghiệm PCR kép mà an toàn xử lý để sử dụng thực tế ( Kawasaki, Fratamico, Kamisaki-Horikoshi, cộng sự, 2010 ) Các kết thu từ động học với giá trị đệm khác cho thấy tất canh thang nghiên cứu cơng trình phù hợp để làm giàu Salmonella , môi trường có 100 mM đạt kết cao cho phát triển L.monocytogenes Những kết kiểm chứng cách làm phong phú môi trường nuôi cấy tinh khiết vi sinh vật so sánh chúng với phát triển thu BPW Theo số lượng đĩa, phát triển Salmonella canh thang với dung dịch đệm 100 mM cao đáng kể so với dung dịch đệm BPW khác; L.monocytogenes khơng thống kê khác biệt buồng đếm VSV 29 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Cuối cùng, ba dung dịch đệm so sánh phát triển đồng thời hai loại vi khuẩn mục tiêu, có bổ sung VSV khác tác nhân chọn lọc Dữ liệu từ tất phân tích cho thấy, nói chung, hiệu suất tốt loại môi trường dinh dưỡng khác mà khơng cần bổ sung chọn lọc, chúng so sánh để kiểm tra xem tốt Các tác giả trước ( Kim & Bhunia, 2008; Mahmuda cộng sự, 2007 ) báo cáo vấn đề phục hồi L monocytogenes có nhiều VSV khác mẫu Trong nghiên cứu tại, với kết thu thập từ bước khác trình đánh giá dung dịch đệm phù hợp cho canh thang, 100 mM chọn dung lượng đệm cao dung dịch đệm ISO Ngoài ra, số lượng VSV cao thu hai mầm bệnh, hỗ trợ phát triển đồng thời Salmonella spp L.monocytogenes có mật độ cao VSV khác với yêu cầu khác Những kết xác nhận số lượng đĩa qPCR, xem Hình Việc đánh giá giao thức tách chiết DNA không cho thấy khác biệt thống kê áp dụng cho S enterica , liệu cho L monocytogenes phân tích, khác biệt đáng kể thu ba tham số đánh giá Kết phù hợp với liệu báo cáo Kawasaki cộng (2005) , người chí khơng có khác biệt độ nhạy đạt đun sôi Lysis-GuSCN phương pháp áp dụng hai vi khuẩn Salmonella Enteritidis E coli (cả vi khuẩn Gram âm) sử dụng với L monocytogenes (Gram dương) có độ nhạy phương pháp Lysis-GuSCN tương đương với phương pháp thu vi khuẩn Gram âm Trong báo tại, độ tinh khiết DNA thu được đánh giá Liên quan đến Salmonella , khơng có khác biệt quan sát tỷ lệ 260/280, phương pháp đun sôi cho thấy giá trị cao mặt thống kê 260/230 tỉ lệ, 30 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường gần đến tối ưu khiết AND Trong trường hợp L monocytogenes có giá trị cao mặt thống kê 260/280, xa từ D N A tinh khiết lý tưởng Các giá trị cao thu phương pháp ly giải-GuSCN cho tỷ lệ 260/280 dấu vết GuSCN dịch chiết cuối hợp chất hấp thụ 260 nm Các giá trị thấp đo cho 260/230 liên quan đến diện hợp chất hữu muối chaotropic (GuSCN) DNA tinh Nếu phương pháp dùng cho mục đích khác cần độ tinh DNA bổ sung Mặc dù thông số độ tinh khiết DNA đo nằm giá trị lý tưởng, tổng thể phương pháp thực hoàn toàn tốt ngoại suy từ giá trị Ct quan sát cho IAC từ tất mẫu, không đáng ý thay đổi phát hiện, điều cho thấy diện chất ức chế không loại bỏ quy trình tách chiết DNA Hơn nữa, tất tham số chất lượng tính cho phương pháp (SE, SP, AC, PPV NPV) 90%, chí cao hơn, giá trị k cho hai vi khuẩn Salmonella L.monocytogenes Các PCR đặc điểm xác định từ Tiêu chuẩn dựa đường cong gấp mười lần nối tiếp pha loãng ADN cADN (tài liệu tham khảo), động phạm vi phương pháp Các dốc tuyến tính hồi quy hàng, lý tưởng 3.3219, kết Trong thời gian thực Hiệu suất PCR cho thấy số lượng phân tử mục tiêu tăng gấp đơi xác chu kỳ PCR Độ dốc 3,1 3.6, với tỷ lệ phần trăm hiệu từ 90 đến 110 thường chấp nhận ( Raymaekers , Smets, Maes, & Cartuyvels, 2009 ) Tất giá trị tính toán cho hiệu cho kết đơn ghép kênh Trong giá trị 90% phía 110% dốc giá trị — 3,1 — 3,4, xem Bảng Giới hạn phát thiết lập mức CFU/25 g tác nhân gây bệnh, với 90% kết dương tính mẫu bổ sung Một số mẫu bổ 31 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường sung chứng minh khả phát thấp tới CFU/25 g, nồng độ chất cấy khơng đánh giá thêm ND quan sát hai mầm bệnh, xem Bảng Việc bao gồm bước làm giàu thứ cấp khơng làm tăng số lượng tích cực mẫu cho LOD làm giảm đáng kể giá trị Ct thu được, so sánh với giá trị tồn chất Hiệu ứng kéo dài q trình ủ mẫu mơi trường giảm lượng thức ăn thừa Giảm hạt thức ăn trước khuyến nghị để tăng cường trích xuất DNA ( Kawasaki cộng sự, 2009) Các phương pháp mô tả công việc chứng minh để khắc phục rắc rối liên quan đến LOD thể qua Trước tác giả ( Mahmuda cộng sự, 2007 ) Khi phương pháp áp dụng cho mẫu không bổ sung tự nhiên, phát hai mầm bệnh loại mẫu khác (cá , hai mảnh vỏ, rau bột cá), chứng tỏ khả áp dụng phương pháp mẫu từ nguồn gốc khác Kết luận Trong nghiên cứu tại, việc điều chỉnh môi trường dinh dưỡng TA10 hồn tồn điển hình đồng thời phát triển S.enterica L monocytogenes có nhiều VSV khác Các tác giả trước báo cáo việc phục hồi khó khăn, đặc biệt L.monocytogenes, bị lấn át VSV khác ( Kim & Bhunia, 2008) Phương pháp tách chiết DNA lysis-GuSCN cho thấy vi khuẩn gram dương, thu lượng DNA cao mặt thống kê Hạn chế ghi nhận thiếu tinh khiết ADN 32 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Phương pháp qPCR cho thấy hiệu cao kết hợp với môi trường tăng sinh giao thức tách chiết DNA, phát CFU/25g Salmonella L monocytogenes, LOD thiết lập CFU/25 g vi khuẩn gây bệnh Việc đưa IAC vào để loại bỏ khả ức chế phản ứng PCR tránh kết âm tính giả, làm cho phương pháp sử dụng nghiên cứu phù hợp để ứng dụng kiểm sốt mẫu thực phẩm mơi trường thơng thường Tóm lại, việc sử dụng canh thang mTA10 với dung dịch đệm 100 mM với bước tăng sinh thứ cấp, kết hợp với phương pháp tách chiết DNA lysis-GuSCN sử dụng với hệ thống phát qPCR mô tả nghiên cứu để sàng lọc đồng thời Salmonella spp L monocytogenes từ mẫu thực phẩm môi trường Lời cảm ơn Cơng trình hỗ trợ tài Tổng thư ký Biển Bộ Nông nghiệp, Đất đai Tài nguyên Biển Tây Ban Nha (MARM), theo lệnh ARM/1193/2009 Các tác giả cảm ơn Victoria Docampo Angeles Marcote hỗ trợ kỹ thuật Phịng thí nghiệm Lema & Bandin 33 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Tài liệu tham khảo Alarcon, B., Garcia-Canas, V., Cifuentes, A., Gonzalez, R., & Aznar, R (2004) Simul- taneous and sensitive detection of three foodborne pathogens by multiplex PCR, capillary gel electrophoresis, and laser-induced fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(23), 7180-7186 Anderson, A., Pietsch, K., Zucker, R., Mayr, A., Muller-Hohe, E., Messelhausser, U., et al (2011) Validation of a Duplex real-time PCR for the detection of Salmo- nella spp in different food products Food Analytical Methods, 4(3), 259-267 Badosa, E., Chico, N., Pla, M., Pares, D., & Montesinos, E (2009) Evaluation of ISO enrichment real-time PCR methods with internal amplification control for detection of Listeria monocytogenes and Salmonella enterica in fresh fruit and vegetables Letters in Applied Microbiology, 49(1), 105-111 Bhaduri, S., & Cottrell, B (2001) Sample preparation methods for PCR detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, and Listeria monocytogenes on beef chuck shoulder using a single enrichment medium Molecular and Cellular Probes, 15(5), 267-274 Bhagwat, A A (2003) Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes and Salmonella strains by real-time PCR International Journal of Food Microbiology, 84(2), 217-224 Calvo, L., Martinez-Planells, A., Pardos-Bosch, J., & Garcia-Gil, L J (2008) A new real-time PCR assay for the specific detection of Salmonella spp Targeting the bipA gene Food Analytical Methods, 1(4), 236-242 34 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Chapela, M J., Fajardo, P., Garrido, A., Cabado, A G., Ferreira, M., Lago, J., et al (2010) Comparison between a TaqMan polymerase chain reaction assay and a culture method for ctx-positive Vibrio cholerae detection Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(7), 4051-4055 Cheng, C M., Lin, W., Van, K T., Phan, L., Tran, N N., & Farmer, D (2008) Rapid detection of Salmonella in foods using real-time PCR Journal of Food Protection, 71(12), 2436-2441 Chua, T., & Bhagwat, A A (2009) A rapid and simple DNA extraction procedure to detect Salmonella spp and Listeria monocytogenes from fresh produce using real-time PCR Food Analytical Methods, 2(2), 96-101 DG, A (1991) Practical statistics for medical research New York (EC), C R (2005) Microbiological criteria for foodstuffs Official Journal of the European Union, 2073/2005 (EC), C R (2007) Amending Regulation (EC) No 2073/2005 on microbiological criteria for foodstuffs Official Journal of the European Union, 1441/2007 Elizaquivel, P., & Aznar, R (2008) A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp and Staphylococcus aureus on fresh, minimally processed vegetables Food Microbiology, 25(5), 705-713 Elizaquivel, P., Gabaldon, J A., & Aznar, R (2010) Quantification of Salmonella spp, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 H7 in non-spiked food prod- ucts 35 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường and evaluation of real-time PCR as a diagnostic tool in routine food analysis Food Control, 22(2), 158-164 Fratamico, P M., & Strobaugh, T P (1998) Simultaneous detection of Salmonella spp and Escherichia coli O157:H7 by multiplex PCR Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 21(3), 92-98 Garrido, A., Chapela, M J., Ferreira, M., Atanassova, M., Fajardo, P., Lago, J., et al (2012) Development of a multiplex real-time PCR method for pathogenic Vibrio parahaemolyticus detection (tdh and trh ) Food Control, 24(1e2), 128-135 Germini, A., Masola, A., Carnevali, P., & Marchelli, R (2009) Simultaneous detection of Escherichia coli O175:H7, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes by multiplex PCR Food Control, 20(8), 733-738 Hammack, T S., Amaguana, R M., Johnson, M L., & Andrews, W H (2003) Effec- tiveness of universal pre-enrichment broth for recovery of Salmonella from selected dairy foods Journal of AOAC International, 86(4), 714-718 Hyeon, J Y., Hwang, I G., Kwak, H S., Park, C., Choi, I S., & Seo, K H (2010) Eval- uation of PCR inhibitory effect of enrichment broths and comparison of DNA extraction methods for detection of Salmonella Enteritidis using real-time PCR assay Journal of Veterinary Science, 11(2), 143-149 ISO (1996) Microbiology of food and animal feeding stuffs e Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes e Part 1: Detection method, Vol 11290-1 ISO (2003) Microbiology of food and animal feeding stuffs e Guidelines on prepa- ration and production of culture media e Part 2: Practical guidelines on perfor- mance testing of culture media, Vol 11133-2 Jofre, A., Martin, B., Garriga, 36 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường M., Hugas, M., Pla, M., Rodriguez-Lazaro, D., et al (2005) Simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella by multiplex PCR in cooked ham Food Microbiology, 22(1), 109-115 Kamisaki-Horikoshi, N., Okada, Y., Takeshita, K., Sameshima, T., Kawasaki, S., Kawamoto, S., et al (2011) Evaluation of TA10 broth for recovery of heat- and freezeinjured Salmonella from beef Journal of AOAC International, 94(3), 857-862 Kawasaki, S., Fratamico, P M., Horikoshi, N., Okada, Y., Takeshita, K., Sameshima, T., et al (2009) Evaluation of a multiplex PCR system for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in foods and in food subjected to freezing Foodborne Pathogens and Disease, 6(1), 81e89 Kawasaki, S., Fratamico, P M., Horikoshi, N., Okada, Y., Takeshita, K., Sameshima, T., et al (2010) Multiplex real-time polymerase chain reaction assay for simulta- neous detection and quantification of Salmonella species, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in ground pork samples Foodborne Pathogens and Disease, 7(5), 549-554 Kawasaki, S., Fratamico, P M., Kamisaki-Horikoshi, N., Okada, Y., Takeshita, K., Sameshima, T., et al (2010) Development of the multiplex PCR detection kit for Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 JARQ e Japan Agricultural Research Quarterly, 45(1), 77-81 Kawasaki, S., Horikoshi, N., Okada, Y., Takeshita, K., Sameshima, T., & Kawamoto, S (2005) Multiplex PCR for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in meat samples Journal of Food Protection, 68(3), 551-556 37 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Kawasaki, S., Kimura, B., & Fujii, T (2001) Comparison of TaqMan (TM) Salmonella amplification/detection kit with standard culture procedure for detection of Salmonella in meat samples Journal of the Food Hygienic Society of Japan, 42(1), 3339 Kim, H C., & Bhunia, A K (2008) SEL, a selective enrichment broth for simulta- neous growth of Salmonella enterica, Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes Applied and Environmental Microbiology, 74(15), 4853-4866 Kimura, B., Kawasaki, S., Fujii, T., Kusunoki, J., Itoh, T., & Flood, S J A (1999) Evaluation of TaqMan PCR assay for detecting Salmonella in raw meat and shrimp Journal of Food Protection, 62(4), 329-335 Kobayashi, H., Kubota, J., Fujihara, K., Honjoh, K., Ito, M., Fujiki, N., et al (2009) Simultaneous enrichment of Salmonella spp, Escherichia coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, and Listeria mono- cytogenes by single broth and screening of the pathogens by multiplex real-time PCR Food Science and Technology Research, 15(4), 427-438 Lantz, P G., Hahnhagerdal, B., & Radstrom, P (1994) Sample preparation methods in PCR-based detection of food pathogens Trends in Food Science & Technology, 5(12), 384-389 Lantz, P G., Knutsson, R., Blixt, Y., Abu Al-Soud, W., Borch, E., & Radstrom, P (1998) Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica in enrichment media and pork by a multiplex PCR: a study of sample preparation and PCR-inhibitory components International Journal of Food Microbiology, 45(2), 93-105 38 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Lofstrom, C., Hansen, F., & Hoorfar, J (2010) Validation of a 20-h real-time PCR method for screening of Salmonella in poultry faecal samples Veterinary Microbiology, 144(3e4), 511-514 Mahmuda, Y., Kawasaki, S., & Kawamoto, S (2007) Evaluation of multiplex PCR system for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis in shrimp samples Bangladesh Journal of Microbiology, 24(1), 42e46 Malorny, B., Hoorfar, J., Bunge, C., & validation Helmuth, R (2003) Multicenter of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards an international standard Applied and Environmental Microbiology, 69(1), 290-296 Malorny, B., Huehn, S., Dieckmann, R., Kramer, N., & Helmuth, R (2009) Polymerase chain reaction for the rapid detection and serovar identification of Salmonella in food and feeding stuff Food Analytical Methods, 2(2), 81-95 Myint, M S., Johnson, Y J., Tablante, N L., & Heckert, R A (2006) The effect of pre- enrichment protocol on the sensitivity and specificity of PCR for detection of naturally contaminated Salmonella in raw poultry compared to conventional culture Food Microbiology, 23(6), 599-604 Navas, J., Ortiz, S., Lopez, P., Jantzen, M M., Lopez, V., & Martinez-Suarez, J V (2006) Evaluation of effects of primary and secondary enrichment for the detection of Listeria monocytogenes by real-time PCR in retail ground chicken meat Food-borne Pathogens and Disease, 3(4), 347-354 39 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., & Magnani, M (2009) A new platform for real-time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk Food Microbiology, 26(6), 615-622 Poltronieri, P., de Blasi, M D., & D’Urso, O F (2009) Detection of Listeria mono- cytogenes through real-time PCR and biosensor methods Plant Soil and Environment, 55(9), 363-369 Rantsiou, K., Alessandria, V., Urso, R., Dolci, P., & Cocolin, L (2008) Detection, quantification and vitality of Listeria monocytogenes in food as determined by quantitative PCR International Journal of Food Microbiology, 127(3), 321, (Vol 121, pg 99, 2008) Raymaekers, M., Smets, R., Maes, B., & Cartuyvels, R (2009) Checklist for optimi- zation and validation of real-time PCR assays Journal of Clinical Laboratory Analysis, 23(3), 145-151 Rijpens, N., & Herman, L (2002) Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens Journal of AOAC International, 85(2), 984-995 Rip, D., & Gouws, P A (2009) Development of an internal amplification control using multiplex PCR for the detection of Listeria monocytogenes in food prod- ucts Food Analytical Methods, 2(3), 190-196 Rodriguez-Lazaro, D., Jofre, A., Aymerich, T., Hugas, M., & Pla, M (2004) Rapid quantitative detection of Listeria monocytogenes in meat products by real-time PCR Applied and Environmental Microbiology, 70(10), 6299-6301 40 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Rossmanith, P., Krassnig, M., Wagner, M., & Hein, I (2006) Detection of Listeria monocytogenes in food using a combined enrichment/real-time PCR method targeting the prfA gene Research in Microbiology, 157(8), 763-771 Ruiz-Rueda, O., Soler, M., & Calvo, L (2010) Multiplex real-time PCR for the simultaneous detection of Salmonella spp and Listeria monocytogenes in food samples Food Analytical Methods, Singh, J., Batish, V K., & Grover, S (2011) Simultaneous detection of Listeria mon- ocytogenes and Salmonella spp in dairy products using real time PCR-melt curve analysis Journal of Food Science and Technology, Suo, B., He, Y P., Tu, S I., & Shi, X M (2010) A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Salmonella spp., Escherichia coli O157, and Listeria monocytogenes in meat products Foodborne Pathogens and Disease, 7(6), 619-628 Tomas, D., Rodrigo, A., Hernandez, M., & Ferrus, M A (2009) Validation of real-time PCR and enzyme-linked fluorescent assay-based methods for detection of Salmonella spp in chicken feces samples Food Analytical Methods, 2(3), 180e189 Vanegas, M C., Vasquez, E., Martinez, A J., & Rueda, A M (2009) Detection of Listeria monocytogenes in raw whole milk for human consumption in Colombia by realtime PCR Food Control, 20(4), 430-432 Wu, V C H (2008) A review of microbial injury and recovery methods in food Food Microbiology, 25(8), 1001, (Vol 25, pg 735, 2008) Zhang, D., Zhang, H., Yang, L., Guo, J., Li, X., & Feng, Y (2009) Simultaneous detection of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica and 41 Một phương pháp real-time PCR kép phát triển cho Salmonella spp phát Listeria monocytogenes mẫu thực phẩm môi trường Escherichia coli O157:H7 in food samples using multiplex PCR method Journal of Food Safety, 29(3), 348-363 42