1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Con đường nhiễm bẩn của Clostridium botulinum trong môi trường sản xuất mật ong Do Ngoc Bich TÓM TẮT Các yếu tố ảnh hưởng đến sự nhiễm Clos[.]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum mơi trường sản xuất mật ong Do Ngoc Bich TĨM TẮT Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiễm Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong đánh giá năm nghiên cứu Một vài tổng số 1168 mẫu từ 100 vườn nuôi ong nhà máy liên quan phân tích có mặt C botulinum loại A, B, E F cách sử dụng chuỗi phản ứng mutiplex polymerase để phân tích gen botA, botB, botE botF Các phương pháp sản xuất yếu tố môi trường đưa vào bảng câu hỏi từ ghi nhận cá nhân Clostridium botulinum phát tất chuỗi sản xuất mật ong, loại xuất nhiều nhóm I loại B Trong kĩ thuật phân tích Điện di gel trường xung (PFGE) phân lập 202 mẫu có nhóm I loại B, mẫu PFGE quan sát, có mẫu kết cao Điều chứng tỏ nhiễm mẫu Tỉ lệ C botulinum cao đất mẫu sáp ong có tích tụ phân tử từ đất sáp Ngồi ra, theo so sánh phân tích nhiều chiều xếp hạng Spearman, yếu tố vệ sinh sản xuất có ảnh hưởng lớn nhiễm, số lượng tần suất xuất bào tử C botulinum mật ong giảm thiểu việc cải thiến vấn đề vệ sinh sản xuất mật ong Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong Mở đầu Các bào tử Clostridium botulinum phân tán rộng rãi môi trường ăn vào bào tử xem khơng có hại đến sức khỏe người trưởng thành Tuy nhiên, với trẻ tuổi mẫn cảm với xuất hiện, phát triển hình thành độc tố bào tử đường ruột (Pickett et al., 1976; Arnon, 1980) Mức độ nghiêm trọng thay đổi từ táo bón bú đến tử vong đột ngộ, giống với hội chứng đột tử trẻ sơ sinh (Arnon et al., 1978) Mật ong bụi cho quan trọng chất truyền bệnh (Midura, 1996) Bởi mật ong thực phẩm xác định liên quan đến chứng ngộ độc thịt trẻ sơ sinh (Arnon, 1992), giới chức sức khỏe vài nước bắt buộc khuyến khích việc sử dụng nhãn dán khuyến cáo không cho trẻ tuổi sử dụng mật ong Theo vài báo cáo trước đây, bào tử C botulinum phát chiết xuất mật ong với tỉ lệ từ 2% đến 24% Các bào tử botulinal không bị phá hủy trình sản xuất, tiếp tục mật ong điều kiện bảo quản thông thường vô thời hạn (Snowdon and Cliver, 1996) Hiệu suất trình gia nhiệt để phá hủy bào tử chắn làm giảm hương vị cấu trúc mật ong Mật ong bắt nguồn từ mật hoa thực vật, thu gom biến đổi sang mật ong ong mật (Apis mellifera) Các tế bào sáp xây dựng ong nơi mà mật phấn hoa lưu trữ trứng đẻ Ong tận dụng tảng sáp có sẵn có hình dạng tế bào lục giác sở để xây dựng tế bào Khi lưu trữ tế bào, mật hoa khử nước nhiệt độ tổ ong Ngay hàm lượng nước giảm dần từ 90% đến xấp xỉ 20%, ong đậy tế bào sáp ong Mật ong thu hoạch người nuôi ong cách loại bỏ đầu đậy tế bào trích xuất mật ong dao cắt vít máy quay ly tâm Các yếu tố tác động đến nhiễm bẩn mật ong bào tử botulinal thảo luận trước Huhtanen cộng (1981) cho thấy bào tử C botulinum truyền qua đường tiêu hóa ong Khả mà C botulinum có Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong mặt tổ ong nghiên cứu Nakano cộng (1994), chứng tỏ bào tử có khả có mặt vi khuẩn sinh dưỡng nhân lên điều kiện hiếu khí ong chết nhộng Mặt khác, ong chết nhộng ong loại bỏ khỏi tổ cách hiệu quả, khơng có nguy đáng kể tập thể ong khỏe mạnh Bất chấp giả định này, đường lây nhiễm cịn bí ẩn khơng có phương pháp cơng bố để hạn chế số lượng tần số bào tử C botulinum mật ong Trong khảo sát này, đường nhiễm bẩn C botulinum nhóm (phân giải protien) nhóm (khơng phân giả protein) môi trường sản xuất mật ong đánh giá cách phát phân lập vi sinh vật từ tổ ong môi trường xung quanh chúng, cách phân tích biến đổi di truyền mẫu phân lập Ảnh hưởng yếu tố môi trường, phương thức sản xuất cách vệ sinh đến nhiễm bẩn sản phẩm cuối đánh giá dự hỏi nghiên cứu quan sát Kết Mật độ xuất số lượng C botulinum Tổng cộng 1168 mẫu liên quan đến môi trường sản xuất mật ong thu hoạch suốt năm (2001-2003), mật độ xuất loại C botulinum A, B, E F phân tích PCR từ tổng cộng 9849 mẫu phụ Các địa điểm lấy mẫu bao gồm 100 vườn nuôi ong 37 trại nuôi ong, nằm nhiều nơi Phần Lan Tổng số lượng mẫu dương tính 216 Trong mẫu tổ ong (ong, sáp ong, tổ ong, hạt phấn phấn hoa), mật ong lấy sáp ong chứa nhiều bào tử phần khác So sánh với mật ong trích xuất, mật ong lấy cho thấy chứa nhiều bào tử Trong tất vật liệu mẫu, mật độ xuất cao C botulinum phát đất Các mẫu khác mật ong mật pha đường nghiên cứu đến 20 mẫu phụ, phụ thuộc vào giá trị vật liệu, để ước tính số lượng phương pháp Most probable number (MNP) Số lượng bào tử mẫu ước tính cho mẫu có Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong mẫu phụ kiểm tra Số lượng bào tử mẫu tổ ong dương tính với PCR dao động từ 60 đến 1200 bào tử/kg vật liệu mẫu, trung bình khoảng 180 bào tử/ kg (bảng 2), mẫu đất khoảng 50 đến 1050 bào tử/kg, trung bình 110 bào tử/kg Số lượng bào tử cao phát mẫu thuộc loại B Phân tích PFGE phân lập C botulinum Trong tổng 202 mẫu phân lập, có 117 mẫu ghi nhận có mẫu phụ dương tính PCR Tất mẫu thuộc nhóm loại B Tất mẫu phân lập C botulinum phân tách kĩ thuật PFGE có sử dụng enzyme giới hạn Scacll Chỉ có cấu hình dấu tay khác xuất (Biểu đồ 2), số đậm hơn; cấu hình 151 (75%) cấu hình lại 43 (21%) (Biểu đồ 3) Mặc dù có cấu hình giá trị thấp, giống cấu hình 62% Các mẫu đại diện phân lập từ nhiều nguồn vật liệu khác mở rộng dạng sơ đồ cây, bao gồm phân lập từ ong dung dịch đường ăn, mẫu chia vào nhóm lớn Trong trường hợp biến dạng thủy phân mẫu phân lập từ mẫu ban đầu Mối liên hệ yếu tố môi trường vệ sinh Các kết từ hỏi từ nghiên cứu liên quan đến yếu tố từ vườn nuôi thống kê bảng Các yếu tố môi trường điển nơng trại ni gia súc lận cận, loại đất vườn ni ong có liên quan nhiều đến mẫu ong dương tính với C botulinum (P < 0.05) (Bảng 4) Tuy nhiên, có mặt C botulinum mẫu khác liên quan đến vườn nuôi chiết suất mật ong hay dung dịch đường ăn khơng phải mơi trường, dựa vào thang đánh giá hệ số tương quan hai chiều Spearman Các loại bệnh khác hay sinh sản ong xâm nhập C botulinum vào tổ ong hay mẫu chiết suất mật ong khơng có nhiều tương quan (P>0.05) Phép tốn Nor cho thấy tương quan hai chiều khơng có tham số quan trọng Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong quan sát mẫu chiết suất mật ong mẫu liên quan với vườn ni dương tính với C botulinum (P > 0.05) Các kết hỏi nghiên cứu yếu tố vệ sinh sản xuất sở khai thác thể Bảng Các sở khai thác thường sử dụng cho mục đích khác, nhiên điều không gây nhiễm bẩn đến mật ong Hơn nữa, phương pháp tác động lực khác không liên quan đến xuất bào tử botulinal mật ong Dựa vào tương quan hai chiều quan trọng (Bảng 6), loại biến xuất hiện, kích thước bình chiết, việc mang giày dép từ ngồi vào phịng chiết, thiết bị rửa tay phịng chiết, có mặt C botulinum mẫu đất, tất đưa vào mẫu hồi quy đa biến logic (Bảng 7) Việc có thiết bị rửa tay góp phần lớn cho mẫu chiết suất mật ong âm tính với C botulinum (P < 0.05) Thảo luận Clostridium botulinum tìm thấy nhiều thơng quan dây chuyền sản xuất mật ong, nhóm I loại B cao mẫu, nhiễm bẩn mật ong quy trách nhiệm Phần Lan Trong số mẫu tổ ong, tỉ lệ xuất cao bào tử botulinal ghi nhận mẫu sáp ong, bao gồm tảng ong, phấn hoa từ sinh sản sáp ong (Bảng 1) Tất mẫu phân lập nhóm B, cho kết có số lượng cao Nếu phân lập C botulinum từ mẫu môi trường khuẩn lạc dương tính với lipase dễ dàng phát triển q mức vi khuẩn khác, cản trở việc phân lập đặc biệt số lượng bào tử mẫu, giả sử xảy trường hợp có nhóm A, E F Hai cấu hình hạn chế chủ yếu quan sát PFGE (Biểu đồ 3) khác biệt hồn tồn với Điều xem gợi ý cho có mặt nhiều dòng gen khác Trong nghiên cứu trước đây, hai cấu hình (KS30/6 KS35/5) hai cấu hình (KV40/10 KH57/1) nghiên cứu phân tích AFLP, hai cấu hình phân biệt theo biểu đồ dạng cấu hình AFLP Trong nghiên cứu này, khơng có khác biệt ghi nhận phân bố lồi cấu hình PFGE Mặc dù phạm Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong vi chủng loài rộng, 96% chủng phân lập đại diện cho cấu hình hay PFGE (Biểu đồ 3) Do kết nhận sớm đề xuất C botulinum nhóm I loại B bao gồm cụm cấu hình PFGE gần giống Đây mối quan hệ nịi giống tương đối cao C botulinum đất, đó, phức tạp nghiên cứu dịng ô nhiễm kiểm tra dịch tể dựa vào kết PFGE Các nghiên cứu sâu cần thiết để xác định kết phân lập từ khu vực khác, mặt khác da dạng chứng minh cao cách sử dụng gen phân tích lớn phân lập Tuy nhiên, dựa theo liệu PFGE có được, chúng tơi nói có khả hai dịng gen xuất C botulinum nhóm I loại B Tỉ lệ xuất số bào tử cao sáp ong cho thấy sáp đóng vai trị quan trọng nhiễm bẩn mật ong Sự nhiễm C botulinum loại B sáp bụi bẩn từ ong, có mặt bào tử huyết B đất (Biểu đồ 4) Từ ong, bụi có bào tử bám vào bề mặt tảng sáp mềm chuyển vào bên sáp Tỉ lệ xuất bào tử ong dường bị ảnh hưởng loại đất lân cận vườn nuôi Nếu bề mặt đất bao gồm rêu sỏi, tỉ lệ ong mang bào tử C botulinum cao (Bảng 4) Mặc dù ong thường không đậu đất, đậu rêu ẩm ướt để lấy nước Ngồi ra, có khu vực canh tác thải nhiều bụi khu vực có thảm thực vật, làm tăng nhiễm bẩn ong tổ ong Phát cho thấy người ni ong làm giảm nhiễm bẩn từ việc bố trí khu vực ni ong với thảm thực vật bao quanh khơng có rêu Có nhiều phương pháp thói quen sản xuất ni ong; ví dụ tần suất thay khung cũ để làm sáp từ đến vài chục năm Nền sáp đổ khuôn sáp ong từ khung cũ Khi nhiệt độ nóng chảy sử dụng trình điều chỉnh để tiêu diệt chủng nhóm I có giá trị D121oC khoảng 0.1 – 0.2 phút (Kim and Foegeding, 1993), tinh khiết sáp xác định chu kỳ bào tử bị ohas vỡ dây truyền sản xuất mật ong cách thay khung sáp cũ với sáp (Sơ đồ 4) Ngoài ra, hạt sáp nên loại bỏ cẩn thận khỏi chiết Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong suất mật ong, khơng có mối tương quan nhiều kĩ thuật lọc với có mặt C botulinum mật ong Khơng có mối tương quan ghi nhận diện C botulinum chiết xuất mật ong mẫu tổ ong Vì chiết suất mật ong thường đại diện cho tồn q trình sản xuất người ni ong, người nuôi khảo sát mà cịn có so sánh mẫu liên quan tới vườn ni với chiết suất mật ong bị sai lệch Phân tích thống kê làm rõ tầm quan trọng yếu tố phụ thuộc vào nhà sản xuất giai đoạn chiết suất mật ong Các vấn đề vệ sinh trình chiết suất lọc đóng vai trị quan trọng nhiễm bẩn vào mật ong (Bảng 7) Trang thiết bị bồn vệ sinh tay nơi sản xuất làm giảm đáng kể tỉ lệ có mặt bào tử C botulinum mật Hơn nữa, giày dép riêng biệt bên bên nơi sản xuất tránh đem bụi bào tử vào nơi sản xuất (Sơ đồ 4) Ánh sáng đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi cho việc vệ sinh nơi làm việc thiết bị sản xuất, làm giảm khả nhiễm bụi cịn sót lại Khi sản xuất quy mơ lớn với thiết bị có cơng suất cao tỉ lệ bào tử mật ong giảm xuống thấp, nhà sản xuất quy mơ lớn có cách sản xuất chun nghiệp nên trì vệ sinh mức cao Tóm lại, phát cho thấy bào tử C botulinum đất, ong mang vào tổ, nhiễm vào sáp ong, mật ong bị nhiễm bẩn trực tiếp q trình sản xuất Ơ nhiễm qua đường bụi bẩn giảm bớt cách thường xuyên tái tạo sáp nhiệt độ cao để phá hủy chủng C botulinum nhóm I, trì mức độ vệ sinh phù hợp nơi sản xuất Bằng cách trì biện pháp này, số lượng bào tử giảm rõ rệt, bào tử có nhiều đất nhiễm vào mật thơng qua ong nên khó loại bỏ hoàn toàn bào tử mật ong Quy trình tiến hành thí nghiệm Lấy mẫu Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong Mẫu lấy hai lần / năm (từ 2001 đến 2003) Lần đầu, lấy vào mùa hè, tập trung lấy mẫu tổ ong: ong, hạt phấn (được ong mang về) tổ ong, bao gồm tảng ong phấn ong Phấn ong chứa phấn hoa sáp ong Lần hai, lấy vào mùa thu, thu thập mẫu đất từ vườn nuôi ong, mẫu chiết xuất mật ong dung dịch đường ăn, đại diện cho tồn q trình sản xuất người ni Mẫu đất, mẫu tổ ong mẫu liên quan tới vườn nuôi Việc lấy mẫu thực người nuôi ong theo hướng dẫn tác giả, không bao gồm mẫu đất tác giả thu thập Tổng số mẫu thu 1168 mẫu Chuẩn bị mẫu Chiết xuất mật ong, tảng ong dung dịch đường ăn chuẩn bị theo phương pháp mơ tả trước (Nevas et al., 2002) Tóm lại, pha lỗng 25g mật ong với 225ml Tween 80 1% nồi đun cách thủy 65oC, sau đem ly tâm 30 phút 8000 – 9000, phần bên lọc qua màng 0.45 , có đường kính 47 mm Mỗi mẫu lọc hai lần, cho vào bình lọc 10ml dung dịch chiết xuất tryticasepeptone – glucose – nấm men (TPGY) Dung dịch ủ điều kiện yếm khí, ống 30 oC ống 37 oC, để chủng C botulinum nhóm I II phát triển Khơng khí tủ kỵ khí gồm 85% N2, 10% CO2 5% H2 Tất mẫu lại, ong, phấn ong, phấn hoa đất, tiến hành với 1g chế phẩm 10ml TPGY, số lượng mẫu phụ thùy vào số lượng mẫu có sẵn Phấn ong chia thành sáp ong phấn hoa trước cấy vào TPGY Tất ống giữ nồi cách thủy 65oC 30 phút để giảm số lượng sinh vật sinh dưỡng gây phát triển bào tử botulinal Dung dịch sau ủ mơi trường kỵ khí, nửa 30oC nửa lại 37oC Sau ngày, lấy 1ml ống nghiệm chuyển vào 10ml TPGY 16 điều kiện Tế bào từ 1ml nuôi cấy qua đêm rửa TE [Tris-HCl 10mm (pH 7.5), EDTA 1mm] hịa nước cất, sau gia nhiệt đến 99oC Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong 10 phút để tạo mẫu cho PCR Do đó, mật ong dung dịch đường ăn phân tích lần, vật liệu khác tốt cần lặp lại nhiều mẫu phụ để đánh giá MPN, tổng 9849 mẫu phụ phân tích PCR đa mồi Kĩ thuật phát PCR đa mồi Phương pháp multiplex-PCR (PCR đa mồi) báo cáo trước đây, với phận mồi nhắm đến mục tiêu gen độc tố thần kinh botA, botB, botE botF, sử dụng để phát C botulinum loại A, B, E F, với thay đổi nhỏ mô tả Nevas cộng Thể tích hỗn hợp phản ứng 50 bào đệm, nồng độ 0.3 có huyền phù tế mồi, nồng độ deoynucleotide triphosphate 190nm, 28 mM Tris-HCl, 69mM KCl, 4mM MgCl U DNA polymerase Mỗi chu kì PCR bao gồm biến tính 95oC 30 giây, ủ 60oC 25 giây kéo dài 72oC 85 giây Các chu kì lặp lại 27 lần, lần cuối thực 72oC phút Các sản phẩm PCR hiển thị hóa PFGE, dụng gel agarose 2% Phương pháp số xảy Hầu hết phương pháp số xảy dựa việc chia nhỏ mẫu phát sinh trưởng vi sinh vật định hàng loạt ống tăng sinh Hầu hết số xảy dùng để ước tính khả xảy tối đa số bào tử mẫu vật liệu khác Tất mẫu trừ mật ong dung dịch đường ăn, nghiên cứu cách cấy 1g mẫu vào 10ml dung dịch TPGY, số lượng mẫu phụ tùy thuộc vào số lượng mẫu vật liệu có sẵn Sự diện C botulinum ống xác định multiplex-PCR Số lượng bào tử botulinal ước tính từ thí nghiệm với năm mẫu phụ trở lên, sử dụng bảng MNP tương đối Thomas giới hạn mẫu sinh vật có ngẫu nhiên tồn vật liệu, mật ong bào tử botulinal phân bố khơng đồng đều, dung dịch đường ăn có độ đặc mật ong khơng phân tích MNP Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong Phân lập C botulinum Clostridium botulinum phân lập từ mẫu dương tính PCR cách cấy trải 0.1ml môi trường TPGY lên đĩa thạch lịng đỏ trứng ủ yếm khí ngày 30oC 37oC tùy vào nhiệt độ độ tinh khiết TPGY Để đảm bảo độ tinh khiết phân lập sử dụng đĩa thạch máu Phân giải protein cấy trải lên đĩa môi trường RCM có 5% sữa gầy Sự xuất gen bot lần phân lập xác định PCR Mẫu DNA, enzyme phân hủy giới hạn PFGE Phân lập DNA cho PFGE thực theo phương pháp mà Hielm công mô tả (1998) sửa đổi Nevas công (2005b) DNA phân lập thủy phân ezyme giới hạn Sacll Các mẫu thủy phân điện phân 8oC thông qua gel agarose 1% dung dịch đệm 0.5xTBE sử dụng hệ thống Gene Navigator với điện cực lục giác Lệnh chạy với xung thời gian gia tăng 1-26 giây 22 200V Điểm đánh dấu dải số thấp PFG dùng để đánh giá kích thước phân mảnh Sau điện di, gel nhuộm màu 30 phút nước cất có 0.5 ethidium bromide sau loại nước cất tinh khiết Kích thước đoạn DNA ước tính cách so sánh độ dài chu trình với trọng lượng phân tử đánh dấu Các loại gel chụp hệ thống Alphalmager 2000 Phân tích điện di xung trường Các cấu hình dấu in chủng phân lập phân tích phần mềm BioNumerics phiên 3.5 Sự giống tất cặp thể tương quan hệ số Dice UPGMA phân cụm sử dụng để xây dựng sơ đồ phân nhánh Giá trị tối ưu hóa đặt 0.5% dung sai 3.0%, không tăng sau Bản hỏi nghiên cứu quan trắc 10 Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong Một bảng câu hỏi người nuôi ong thực Bảng câu hỏi bao gồm giống ong, bệnh ong môi trường vườn nuôi, bao gồm thông tin khoảng cách đến trang trại, đồng cỏ nguồn nước gần (Bảng 3) Các câu trả lời xác nhận từ tác giả đầu tiên, có việc ni ong phương pháp chế biến mật ong Phân tích thống kê Tất kết độc lập ghi nhận Microsoft Excel 2002, phân tích thống kê thực với Bó thống kê Khoa học Xã hội 11.5 dành cho Windows Các câu trả lời từ nghiên cứu quan trắc hỏi liên quan đến môi trường vệ sinh vườn nuôi sở sản xuất liên quan đến kết phân tích C botulinum Tỉ lệ mẫu dương tính với C botulinum mẫu khác nhau, năm lấy mẫu khoảng cách với trang trại nuôi gia súc khác gần 95% Hệ số tương quan thứ tự xếp hạng Spearman không thuộc tham số với hai giá trị P tính theo hai biến mẫu dương tính với C botulinum: sáp ong, phấn hoa từ phấn ong, tảng ong, chiết xuất mật ong, ong, dung dịch đường ăn đất, biến số phụ thuộc vào môi trường nguồn gốc khác nhau: giống ong, khoảng cách đến trang trai gia súc, khoảng cách đến nguồn nước gần nhất, loại bề mặt đất mơi trường vùng lân cận, bệnh ong kí sinh trùng, phương pháp chiết xuất mật ong, vấn đề vệ sinh nơi sản xuất OR với 95% Cl cho mẫu dương tính thoe biến số từ nhiều mơi trường khác tính tốn Tất vườn ni ong chia thành hai nhóm dựa có khơng có C botulinum mật ong Các mẫu khơng có C botulinum dùng biến phụ thuộc mơ hình hồi quy đa biến logistic Trong mơ hình này, biến số mơi trường vệ sinh khác (tức quy mô máy chiết xuất, sử dụng giày dép nơi sản xuất riêng biệt, có thiết bị rửa tay nơi sản xuất diện C 11 Con đường nhiễm bẩn Clostridium botulinum môi trường sản xuất mật ong botulinum đất) đặt làm biến độc lập giá trị dự đốn phân tích cách tính tốn hệ số (giá trị B), giá trị P cho B OR với KTC 95% Tài liệu tham khảo Mari Nevas,* Miia Lindström, Ari Hörman, Riikka Keto-Timonen and Hannu Korkeala, Contamination routes of Clostridium botulinum in the honey production environment, Environmental Microbiology (2006) 8(6), 1085–1094 12