1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Các phương pháp phát hiện độc tố Clostridium Botulinum trong thực phẩm Dao Trong Nguyen TÓM TẮT Ngộ độc thịt là một căn bệnh chết người đượ[.]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Các phương pháp phát độc tố Clostridium Botulinum thực phẩm Dao Trong Nguyen TÓM TẮT Ngộ độc thịt bệnh chết người gây ăn phải độc tố thần kinh có sẵn sinh từ vi khuẩn kỵ khí dạng bào tử Clostridium botulinum Các độc tố thần kinh Botulinum biết đến độc hại trở thành mối bận tâm nhà máy thực phẩm từ lâu Vì thế, phát nhanh độc tố thần kinh botulinum sử dụng kĩ thuật phân tử hóa sinh điều cần tập trung cho nghiên cứu hướng phát triển Do độc tính mạnh độc tố thần kinh botulinum, số thử nghiệm sinh học chuột hay phương pháp nhanh có khả sàng lọc số lượng lớn mẫu điều cần thiết Bài điểm báo tập trung vào việc phát triển số phương pháp phát độc tố thần kinh botulinum thực phẩm Mở đầu Các độc tố botulinum biết đến hợp chất độc Liều lượng gây chết cho chuột 0.3 ng/kg, cho người từ 0.2 – 2.0 g/kg Bảy kiểu huyết khác (A tới G) độc tố botulinum (BoNT), loại sinh chủng khác Clostridium botulinum, gây tê liệt mềm cách ức chế giải phóng Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm chất dẫn truyền xung thần kinh acetylcholine điểm kết nối dây thần kinh Hiện chưa có thuốc giải độc đặc hiệu cho chứng ngộ độc này, thiếu hiểu biết cấu trúc phân tử hoạt động BoNTs Huyết kháng độc sử dụng số trường hợp định trường hợp trẻ sơ sinh Sử dụng huyết sớm hạn chế mức độ tê liệt khơng thể loại bỏ Sự phát độc tố thần kinh C.botulinum thử thách cho nhà nghiên cứu chất phức tạp độc tính Theo hiểu biết chúng tơi, ví dụ biết đến độc tố vi khuẩn nhóm protein khơng có độc bảo vệ độc tố thần kinh từ môi trường khắc nghiệt Việc phân tích hóa sinh bao qt độc tố botulinum cần thiết để hiểu chất phức tạp hoạt động để phát triển kĩ thuật phát xác Các kĩ thuật phân tích HPLC khối phổ sử dụng cho phát xác nhạy độc tố trường hợp sàng lọc hiệu suất cao Sắc ký khí dùng để phát độc tố thực phẩm Mặc dù phương pháp đáng tin cậy đủ nhạy, cần yêu cầu thiết bị đặc biệt, thời gian thí nghiệm kéo dài nhân viên đào tạo để thực phân tích phức tạp Các trở ngại thông thường hầu hết công nghệ cảm biến sinh học cộng hưởng bể mặt plasmon, huỳnh quang, phát quang hóa học đo chiết suất, bao gồm thiếu nhạy, tính đặc hiệu, tính tuần hồn so sánh với phương pháp ELISA HHAs Thử nghiệm sinh học chuột phương pháp phân tích BoNTs thực phẩm, phương pháp phát đầy hứa hẹn phát triển đề tài cho điểm báo Vi khuẩn Clostridium Giống Clostridium xác định bao gồm nhiều hình que dạng nội bào tử kỵ khí chặt chẽ Lớp Clostridia phân bố rộng rãi đất, nước thải, chất cặn biển, sữa, thịt sống ruột người động vật Vi khuẩn giống dạng bào tử nên chúng bền gia nhiệt chế biến BoNTs sinh nhiều biến thể Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm trực khuẩn kỵ khí dạng bào tử: C.botulinum, Clostridium butyricum Clostridium barati Bảy kiểu huyết (A tới G) chia thành bốn nhóm Sinh vật nhóm I dạng hình que uốn cong thoải có lơng trùng roi, chúng phát triển tối ưu 37 , có tính phá hủy protein, sinh độc tố A, B, F Sinh vật nhóm II dạng hình que thẳng có lơng trùng roi, chúng phát triển tối ưu 30 , khơng có tính phá hủy protein, sinh độc tố B, E, F Các bào tử C.botulinum dạng E có phần phụ đặc trưng phân bố ngẫu nhiên khắp bề mặt bào tử Sinh vật nhóm III dạng hình que thẳng có lơng trùng roi, phát triển tối ưu 37-40 , khơng mang tính phá hủy protein, sinh độc tố C1, C2, D Sinh vật nhóm IV dạng hình que thẳng có lơng trùng roi, sinh trưởng tối ưu 25-45 , có tính phá hủy protein, sinh độc tố G Cả bốn nhóm dạng bào tử gần giống hình elip Con người nhạy với độc tố A, B, E F BoNT hình thành thân sinh vật tác nhân gây bệnh, bước chế nhiễm độc ăn vào hấp thu BoNT thành ruột Sau hấp thu, độc tố di chuyển đến điểm kết nối dây thần kinh cơ, nơi để ức chế acetylcoline Cấu trúc chức độc tố BoNTs phức chất độc tố thần kinh với hay nhiều protein liên kết độc tố thần kinh (NAPs), dẫn đến kích thước phân tử 12S, 16S 19S Phức chất 16S độc tố lớn (L) phức chất 19S độc tố cực lớn (LL) BoNT tinh độc tố bé 7S Phức chất BoNT/A tồn ba dạng: M, L LL Các phức chất BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D BoNT/E tồn hai dạng: M L Phức chất BoNT/F tồn dạng L Phức chất M bao gồm BoNT protein liên kết độc tố thần kinh cho không độc không Hemagglutinin Phức chất dạng L bao gồm BoNT, protein liên kết năm loại protein liên kết (NAPs) khác Các mã gen protein nằm vị trí gần sợi DNA vi khuẩn, biểu thị ổn định cách đồng Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm Số lượng NAPs khác bảy huyết Ví dụ, có bảy NAPs huyết A B có NAPs huyết E Tuy nhiên, theo báo cáo Singh et al huyết E biến thể Alaska tiết năm protein liên kết NAPs giúp tăng độc tính độc tố đống vai trị định q trình nhiễm độc Ví dụ, khơng có NAPs, độc tính qua đường miệng độc tố tinh giảm 43,000 lần NAPs bảo vệ độc tố khỏi proteases, độ axit nhiệt độ, giúp di chuyển BoNT dọc theo lớp niêm mạc Tuy nhiên, chưa thể hiểu rõ chế di chuyển chúng Mỗi độc tố thần kinh (7S) chứa chuỗi nặng (Mr xấp xỉ 100,000) chuỗi nhẹ (Mr xấp xỉ 50,000) liên kết cộng hóa trị liên kết đơn disulfide (Hình 1) Chuỗi nặng bao gồm vùng liên kết với tế bào thần kinh vận động bên nội độc tố chuỗi nhẹ kẽm metalloprotease, đặc trưng cho protein liên quan đến giải phóng acetylcholine BoNT/A, BoNT/C BoNT/E phân giải protein liên kết synaptosome có Mr 25,000 (SNAP-25), synaptobrevin protein màng tế bào liên hợp (VAMP) mục tiêu BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F BoNT/G Ngoài BoNT/C phân giải protein SNAP-25 (Hình Bảng 1) Mỗi độc tố thần kinh thủy phân liên kết đơn chất nó, điều đủ để ngăn chặn xuất bào chất dẫn truyền xung thần kinh Phương thức hoạt động BoNT chia thành bốn bước: ăn vào hấp thu, liên kết với màng tế bào thần kinh, sinh nội bào ức chế giải phóng chất dẫn truyền xung thần kinh Phương pháp phát Có nhiều phương pháp để phát độc tố (Bảng 2) Trong tất phương pháp để định danh C.botulinum phát độc tố thực phẩm, việc tiêm vào màng bụng chuột tin cậy, nhạy dứt khốt Sự có mặt độc tố phát việc tiêm thực phẩm chiết xuất vào bên chuột, sau quan sát triệu chứng đặc trưng ngộ độc thịt cuối chết khoảng 48 Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm Thử nghiệm sinh học chuột phương pháp hợp lệ tiêu chuẩn để phát độc tố botulinum thực phẩm So sánh thử nghiệm sinh học chuột thử nghiệm ống nghiệm xác định điểm mạnh điểm yếu thử nghiệm ống nghiệm Hạn chế thử nghiệm ống nghiệm thiếu hụt so sánh định lượng độ nhạy thấp Thử nghiệm sinh học chuột Trong thử nghiệm này, hoạt độ sinh học độc tố chuẩn bị từ mẫu thực phẩm định lượng cách so sánh hiệu lực với tiêu chuẩn (10 pg) Phương pháp gây đau đớn cho động vật khơng thực khơng có giấy tờ cấp phép chứng minh mục đích thử nghiệm Thử nghiệm bị hạn chế mẫu thử yêu cầu từ 6-10 phút chuẩn bị, cần 6-16 chuột cần thêm ngày để mẫu nhận dạng dương tính Nồng độ độc tố ước lượng pha loãng độc tố nối tiếp tiêm vào nhiều chuột khác Trong thử nghiệm, hoạt động chức độc tố nhận dạng triệu chứng đặc trưng chết chuột Các triệu chứng ngộ độc thịt chuột bao gồm theo thứ tự lông xù, chuyển nhịp thở chậm, yếu ớt chi tới liệt toàn thân, thở gấp (mở hàm dưới) cuối chết suy hô hấp Các loại độc tố xác định cách dùng chuột có tiêm thuốc kháng độc đặc hiệu trước 30 phút thử nghiệm Phương pháp sử dụng thành công U.S Food Drug Administration (FDA), Centers for Disease Control and Prevention phịng thí nghiệm cơng cộng tiểu bang để nhận biết thực phẩm gây bệnh loại độc tố liên quan đến trường hợp ngộ độc thịt Độ sai lệch thử nghiệm có cá thể chuột cần thiết phát triển để kiểm tra độc tính BoNT Tuy nhiên, thử nghiệm cân nhắc thử nghiệm ống nghiệm Màng ngăn nguyên dây thần kinh hoành cố định loại bỏ khỏi chuột chế phẩm thần kinh-cơ định vị khăn giấy Dây Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm thần kinh hồnh sau kích thích với xung đơn co thắt Kết co giật đo với chuyển đổi lực đẳng áp, liệu lưu trữ phân tích máy tính Lực căng đẳng áp cực đại sau lần kích thích chuyển đổi thành đoạn điện áp co giật có kiểm soát thu trước thêm chất độc Hiệu thử nghiệm so sánh với thử nghiệm sóng sót cổ điển chuột Trong số thử nghiệm, độ nhạy không với thử nghiệm sống sót chuột Tuy nhiên, nghiên cứu chất độc vơ hiệu hóa với kháng huyết ngựa, thử nghiệm ống nghiệm nhạy gấp ba lần với có mặt huyết thử nghiệm sống sót chuột Thử nghiệm dùng phát triển loại thuốc để điều trị bệnh ngộ độc thịt độ nhạy tương phản yếu tố cân nhắc để xác định hiệu suốt q trình nghiên cứu hoạt động cấu trúc ELISA ELISA sử dụng để đo lường mức độ tương tác kháng nguyên kháng thể dùng để phát nhiều kháng nguyên protein từ sinh vật gây bệnh Có năm bước quy trình ELISA Đầu tiên, sử dụng kháng thể đơn dịng có khả chống lại kháng nguyên protein gây bệnh phủ bên giếng nhựa microtier với nồng độ phù hợp Kháng thể hấp thu mạnh mẽ nhựa ln dính vào bề mặt giếng suốt khoảng thời gian quy trình Bước thứ hai, vị trí bề mặt nhựa cịn có khả liên kết protein bị ức chế cách thêm vào protein không liên quan gelatin, huyết albumin bị, sữa gầy khơng chất béo Việc ứng dụng ức chế protein giảm liên kết khơng đặc hiệu kháng thể phụ với vị trí giếng Protein ức chế dư thừa sau loại bỏ cách rửa với dung dịch đệm phù hợp Ở bước thứ ba, mẫu trích xuất thực phẩm chứa kháng nguyên độc tố thêm vào giếng để kháng ngun độc tố có sẵn mẫu liên kết với kháng thể Các kháng nguyên cịn lại protein có sẵn mẫu sau loại bỏ cách rửa với dung dịch đệm Ở bước thứ tư, kháng nguyên liên kết phát cách bổ sung enzyme liên hợp kháng thể liên kết với kháng nguyên không phản ứng với Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm protein bị ức chế Có kháng thể riêng biệt cho loại độc tố (A, B, E F), loại độc tố nên phân tích riêng biệt Ở bước thứ năm, chất để enzyme liên kết với thụ thể thêm vào giếng Số lượng enzyme đo lường khả enzyme phân hủy chất không màu để thu sản phẩm có màu, cường độ màu đo lường định lượng máy quang phổ thích nghi đặc hiệu (đầu đọc microplate) Một số sửa đổi khuếch đại tín hiệu tương tác kháng nguyên với kháng thể trực tiếp gián tiếp enzyme chất nâng cao độ nhạy tính lặp lại phương pháp Tuy nhiên, nguyên tắc tương tác protein-protein giống hầu hết phương pháp ELISA Ái lực độ đặc hiệu cao tương tác avidin-biotin thụ thể-hapten nghiên cứu cho nhiều ứng dụng miễn dịch học, mơ hóa học, sắc ký lực nhiều phạm vi khác Biotinylation cung cấp “nhãn nhận dạng” biến đổi phân tử khó phát thành đầu dị nhận thuốc thử ma trận thu nạp lực Sau nhận dạng biotin, phân tử cần quan tâm thụ thể dùng để dị độc tố Phân tử đánh dấu sau phát với avidin thích hợp thụ thể liên kết antihapten đánh dấu enzyme ELISA khuếch đại sử dụng hệ thống biotin-streptavidin phát triển so sánh với phương pháp tiêu chuẩn Hiệp hội Official Analytical Chemists để phát độc tố C.botulinum Phương pháp khuếch đại dùng để sàng lọc chủng nghi ngờ có độc tố botulinal thực phẩm Tổng thời gian yêu cầu để chạy nhóm mẫu ELISA, bao gồm thời gian chuẩn bị, xấp xỉ từ 5-6 Sự xác nhận thử nghiệm phát ELISA báo cáo nhiều phịng thí nghiệm, thử nghiệm thiếu độ nhạy thử nghiệm sinh học chuột Thử nghiệm ELCA báo cáo có độ nhạy thử nghiệm sinh học chuột Thử nghiệm có độ nhạy cao dựa vào hệ thống khuếch đại phức tạp tận dụng yếu tố đông tụ nọc độc rắn bị hạn chế phức tạp thuốc thử đắt Trong thử nghiệm này, phức chất bao gồm độc tố liên kết với thụ thể gà (hoặc thụ thể Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm biotin) thụ thể đánh dấu tác nhân hoạt hóa X nọc độc Russell’s viper hình thành pha dung dịch Pha dung dịch chứa phức hợp sau giữ lại có phủ anti-chicken immunoglobulin G avidin, kết màu sắc đo lường Mặc dù ELCA có độ nhạy cao, có hạn chế thí nghiệm thực phẩm Hợp chất kháng thể (các kháng thể gà kháng thể biotin) dùng để kiểm tra mẫu có thịt gà lịng đỏ trứng, kháng thể biotin khơng thể dùng mẫu có chứa biotin hay avidin (lòng trắng trứng sữa) Tuy nhiên, Roman et al sử dụng thành công ELCA để phát độc tố botulinum loại E cá Một dãy so sánh cho thấy 40% amino acid 50-60% trình tự nucleotide tương đồng số nhiều huyết BoNT Kháng thể chống lại chuỗi nặng đoạn C đối tượng để liên kết giao thoa liên kết không đặc hiệu kháng thể khác trực tiếp chống lại toàn độc tố Poli et al phát triển ELISA cải tiến cho huyết E F sử dụng kháng thể tinh polyme hóa ngựa trực tiếp chống lại 50-kDA đoạn C Độ nhạy thử nghiệm 0.5 ng/ml cho BoNT/E ng/ml cho BoNT/F dung dịch đệm thử nghiệm Một cách tiếp cận khác phát triển Szilagyi et al cho huyết A B Có thể phát 20 pg giếng định lượng xác thu 50 pg giếng Các thử nghiệm ví dụ tốt phép đo màu ELISAs đơn giản dùng để phát nồng độ độc tố theo phút Tất huyết BoNT sinh miễn dịch sinh kháng thể trung hịa chất độc thần kinh Mặc dù kháng thể đa dòng nói chung khơng phản ứng chéo với huyết khác BoNT (ngoại trừ C1 D, E F), số kháng thể đơn dòng kháng thể peptide đặc hiệu phản ứng với vài huyết độc tố thần kinh Kháng thể đa đơn dòng sử dụng với ELISAs để phát định kiểu cho độc tố thần kinh Khi nghiên cứu so sánh kháng thể đơn đa Các phương pháp phát độc tố Clostridium botulinum thực phẩm dòng tiến hành, kháng thể đa dịng có hiệu phát độc tố thần kinh Các kháng thể đa dòng dùng cải tiến ELISAs khuếch đại ELISA, ELISA với ELCA ELISA với thử nghiệm thụ động hemagglutination Gần đây, FDA phát triển phương pháp ELISA nhạy đặc hiệu để phát độc tố thần kinh C.botulinum A, B, E F Thử nghiệm sử dụng kháng thể đa dòng đặc hiệu thu thập đầu dò đánh dấu digoxigenin phân tử cho loại độc tố Độ nhạy thử nghiệm 60 pg/ml cho tất loại độc tố Độ nhạy thử nghiệm độc tố tinh độc tố tạo phức với NAPs so sánh (