Nghiên cứu công nghệ sản xuất granulocyte colony stimulating factor (g CSF) người tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP ĐỂ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GIẢM BẠCH CẦU HẠT KC.04.13/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia Tp. HCM Chủ nhiệm đề tài: TS. VÕ MINH TRÍ TP. Hồ Chí Minh - 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP ĐỂ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GIẢM BẠCH CẦU HẠT KC.04.13/06-10 Chủ nhiệm đề tài TS. Võ Minh Trí Cơ quan chủ trì đề tài Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh - 2010 MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1. Thông tin chung 1 2. Nội dung KHCN của đề tài 1 PHẦN II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN 6 Chương I. Giới thiệu về nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt G-CSF 6 Chương II. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo ra các dòng vi sinh vật tái tổ hợp tổng hợp hiệu quả G-CSF 16 1. Nghiên cứu phân lập dòng gen mã hóa G-CSF người 16 2. Nghiên cứu tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF dạng thể vùi trong tế bào chất 20 3. Nghiên cứu tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF dạng tan trong tế bào chất 27 4. Nghiên cứu tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF dạng tan trong chu chất 33 5. Nghiên cứu tạo dòng nấm men P. pastoris tổng hợp và tiết G-CSF ngoại bào 38 Chương III. Nghiên cứu quy trình lên men chủng tái tổ hợp tổng hợp G-CSF ở quy mô 50L 45 1. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở dạng thể vùi trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1L 45 2. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở dạng tan trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít 47 3. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở dạng tan trong chu chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít 50 4. Nghiên cứu lên men dòng nấm men P. pastoris tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF bằng Jar fermentor ở quy mô 1L 51 5. So sánh, lựa chọn chủng vi sinh tái tổ hợp sử dụng trong qui trình sản xuất G- CSF tái tổ hợp 54 6. Nghiên cứu lên men dòng vi sinh vật tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF bằng Jar fermentor quy mô 5 lít 55 7. Nghiên cứu lên men dòng vi sinh vật tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF bằng Jar fermentor quy mô 50 lít 57 8. Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào quy mô 50 lít 59 9. Khảo sát phương thức phá tế bào tạo dịch đồng nhất hoặc thu nhận chu chất 60 Chương IV. Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận và tinh chế G-CSF 63 1. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli 63 2. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dạng tan trong tế bào chất E. coli 66 3. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dạng tan trong chu chất E. coli 67 4. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dịch lên men nấm men Pichia pastoris 69 5. Nghiên cứu quy trình tinh chế G-CSF quy mô phòng thí nghiệm 70 6. Nghiên cứu quy trình tinh chế G-CSF quy mô pilot 72 Chương V. Nghiên cứu tạo 500mg G-CSF có hoạt tính, độ tinh khiết, độ an toàn tương đương sản phẩm cùng loại 75 1. Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất G-CSF và sản xuất thử 500mg G-CSF tinh khiết 75 2. Xác định đặc điểm cấu trúc 81 3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng G-CSF 83 4. Đánh giá chất lượng G-CSF 85 PHẦN III. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 88 PHẦN IV. KẾT LUẬN 93 PHẦN V. KIẾN NGHỊ 95 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 BẢNG CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU Amp Ampicilline Amp r Ampicilline resistance ANC Asolube neutrophil count BHK Baby hamster kidney B. subtilis Bacillus subtilis bp base pair CHO Chinese hamster ovary CRH Cytokine receptor homologous CSF Colony stimulating factor DNA Deoxyribose Nucleic Acid dH 2 O distilled water (nước cất) dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid EPO Erythropoietin FDA Food And Drug Administration FPLC Flow Protein Liquid Chromatography G-CSF Granulocyte colony stimulating factor g-csf Gen mã hóa cho protein G-CSF G-CSFR Thụ thể của protein G-CSF (G-CSF receptor) G-MCSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor GMK Green monley kidney GMP Good Manufacturing Practice IMAC Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography IL-1 Interleukine-1 IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani LBON Môi Trường LB không có muối MCS Multiple Cloning Site pB Plasmid pBluescript II SK (+) PBST Phosphate Buffered Saline Tween PCR Polymerase Chain Reaction PEG PolyEthylene Glycol OD Optical Density PBST Phosphate Buffered Saline Tween P. pastoris Pichia pastoris RNA Ribose Nucleic Acid RNase Enzyme thuỷ giải RNA RP-HPLC Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography SDS Sodium Dodecyl Sulphate DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Trình tự acid amin của protein G-CSF 8 Hình 2. Cấu trúc protein G-CSF 9 Hình 3. Sự điều hòa sản xuất G-CSF 10 Hình 4. Cấu trúc thụ thể G-CSF 11 Hình 5. Cấu trúc phức hợp tương tác giữa G-CSF và G-CSFR 12 Hình 6. Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR 13 Hình 7. Sự hoạt động và biệt hóa tế bào máu do G-CSF và các cytokine khác 15 Hình 8. Cấu trúc plasmid pET-his 22 Hình 9. Chứng minh sự biểu hiện protein G-CSF không mang thẻ tinh chế bằng lai Western 23 Hình 10. Kiểm tra sự biểu hiện của G-CSF-his dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli BL21(DE3)/pEGf bằng điện di SDS-PAGE 25 Hình 11. Kiểm chứng 6xHis-TEV-GCSF bằng Western blot 26 Hình 12. . Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của FTNH-GCSF trong tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-FGH bằng SDS-PAGE và Western blot 32 Hình 13. Kiểm chứng sự biểu hiện G-CSF trong chu chất của E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF bằng SDS-PAGE và Western blot 37 Hình 14. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện protein G-CSF của chủng P. pastoris GS115/GCSF bằng lai western blot với kháng thể kháng G-CSF 43 Hình 15. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện protein G-CSF của chủng P. pastoris GS115/GCSF sau quá trình lên men bằng Western blot với kháng thể kháng G- CSF 53 Hình 16. Kết quả tinh chế G-CSF 70 Hình 17. Đánh giá sơ bộ kết quả tinh chế G-CSF bằng Quantity One 72 Hình 18. Kiểm tra cấu hình và độ tinh sạch protein bằng RP-HPLC 72 Hình 19. Kết quả chạy MS-MS protein G-CSF 82 BẢNG LIỆT KÊ CÁC PLASMID SỬ DỤNG VÀ CÁC VECTOR TÁI TỔ HỢP Gen mục tiêu Mô hình gen trên plasmid Vector tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp Ghi chú pBluescript II KS (+) (Fermentas) g-csf mE Gen được thu nhận bằng PCR từ pUC57- GCSF không mang các trình tự His, TeV, SP pB-GCSF E.coli DH5α/pB- GCSF Phụ lục 1.2.1 pUC57 (Fermentas) g-csf mE pG-GCSF hay pUC57-GCSF E.coli DH5α/pUC57- GCSF Phụ lục 1.1.1 Lac Z NdeI XhoI LacZ LacZ NdeI BamHI LacZ g-csf pET-his (dự án tài nguyên sinh học quốc gia-NBRP, Viện di truyền quốc gia Nhật Bản) g-csf mE Gen được thu nhận từ pB/G-CSF không có các trình tự His, TEV, SP pET-GCSF Protein biểu hiện dạng thể vùi trong tế bào chất, không dung hợp với thẻ His E.coli DH5α/pET- GCSF E.coli BL21(DE3)/pET- GCSF Ph ụ l ục 1.2.1 pET28a (Novagen) ftnh ferritin chuỗi nặng của người pFTH E.coli DH5α/pFTH phụ lục 1.3 g-csf mE pFHG Protein biểu hiện dạng tan trong tế bào chất dung hợp với FTNH E.coli DH5α/pFHG E.coli BL21(DE3)/pFHG phụ lục 1.3 T7 Ter BamH I NdeI g-csf T7 P T7 t HindIII NdeI XhoI T7 P T7 t HindIII pET28b (Novagen) g-csf mE pEGf Biểu hiện dạng thể vùi dung hợp với thẻ His E.coli DH5α/pEGf E.coli BL21(DE3)/pEGf Phụ lục 1.2.2 g-csf mE Gen có trình tự tín hiệu tiết là endoxylanase pET28b-GCSF Biểu hiện dạng tan trong chu chất E.coli DH5α/pET28b- GCSF E.coli BL21(DE3)/pET2 8b-GCSF Phụ lục 1.4 pZERO-2 g-csf mY pZERO-GCSF E. coli DH5α/pZERO- GCSF Phụ lục 1.5 T7 t Nde I XhoI T7 P [...]... G-CSF tái tổ hợp để làm thuốc hỗ trợ điều trị giảm bạch cầu hạt do hóa trị ung thư Thời gian vừa qua, chúng tôi đã bước đầu phân lập dòng và biểu hiện thành công G-CSF người trong E coli Tuy nhiên, hiệu suất tổng hợp G-CSF chưa cao Để xây dựng được công nghệ sản xuất G-CSF người tái tổ hợp, cần phải tiếp tục thử nghiệm nhiều hệ thống tạo dòng khác nhau (E coli, P pastoris) để thu nhận được dòng tổng hợp. .. của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ protein tái tổ hợp, vào năm 1986, G-CSF tái tổ hợp của người được tạo dòng và biểu hiện, và ngay sau đó nó đã được nghiên cứu thử nghiệm trị liệu cho các bệnh nhân ung thư bị nhiễm khuẩn trong quá trình điều trị Năm 1991, G-CSF tái tổ hợp đã được cấp phép để sử dụng, tuy nhiên nó chỉ được chỉ định sử dụng cho các bệnh nhân điều trị ung thư bị bệnh giảm bạch. .. vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất protein kích thích sản sinh bạch cầu hạt hiệu suất cao - Xây dựng được công nghệ sản xuất G-CSF từ các chủng tái tổ hợp 2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc Ở người, khi số lượng bạch cầu trung tính trong máu giảm xuống một cách bất thường và kéo dài thì hệ miễn dịch trở nên suy yếu tạo điều kiện cho các bệnh cơ hội... và sản xuất loại thuốc này phục vụ cho việc hỗ trợ điều 4 trị giảm bạch cầu hạt do hóa trị ung thư Tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM, việc dùng công nghệ gen để phân lập dòng và sản xuất các protein tái tổ hợp dùng cho mục đích chẩn đoán và làm vắcxin đã được thực hiện thành công trong nhiều năm qua Bên cạnh đó, chúng tôi cũng quan tâm đặc biệt đến việc nghiên cứu công nghệ sản xuất. .. hiện được tiết kiểm ra ngoài môi soát promoter 5’-AOX1 trường P pastoris GS115/GCSF Phụ lục 1.5 PHẦN I MỞ ĐẦU I THÔNG TIN CHUNG - Tên đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất Granulocyte Colony Stimulati Factor (G- CSF) ngƣời tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu hạt - Thời gian thực hiện: tháng 2/2008 đến tháng 7/2010 - Kinh phí từ ngân sách SNKH: 2.800.000.000 đồng - Chủ nhiệm đề tài: TS Võ Minh... bệnh Phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất để điều trị neutropenia là sử dụng cytokine GCSF (granulocyte colony stimulating factor, nhân tố kích thích sản xuất bạch cầu hạt) G-CSF được chỉ định để điều trị hầu hết các loại neutropenia Tùy từng loại neutropenia cần có phương pháp và liều lượng điều trị thích hợp để có được kết quả điều trị tốt nhất cũng như giảm thiểu tác dụng phụ có thể có Tác dụng... CSF (colony stimulating factor) [11] Cuộc cách mạng trong điều trị hỗ trợ cho bệnh nhân ung thư xảy ra vào những nǎm 1990, nguyên nhân là tình trạng ức chế tủy thường xuyên xuất hiện ở các bệnh nhân hóa trị liệu Trước đây, tình trạng giảm bạch cầu trung tính ở các bệnh nhân điều trị ung thư rất thường gặp khiến các bác sĩ phải giảm hoặc ngừng liệu pháp điều trị Nhằm hạn chế những ảnh hưởng do giảm bạch. .. xương nhưng thường không gây ra các tác hại lớn Tuy nhiên nếu bị điều trị bằng G-SCF sai phương pháp và liều lượng, bệnh nhân có thể bị hội chứng loạn sản sinh tủy, bệnh bạch cầu tủy cấp Tình hình sản xuất G-CSF hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu hạt Đầu tiên, G-CSF được thu nhận bằng cách nuôi cấy các dòng tế bào của người có khả năng sản xuất G-CSF như dòng tế bào ung thư bàng quang, dòng tế bào ung... của người dân Việt Nam Vì vậy việc patent sản xuất G-CSF của công ty Amgen đã hết hạn vào tháng 3/2006 là cơ hội cho việc sản xuất G-CSF giá thành rẻ ở Việt Nam Cho đến nay, việc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng G-CSF làm thuốc hỗ trợ điều trị giảm bạch cầu hạt do hóa trị ung thư chưa được quan tâm nghiên cứu tại Việt Nam Việc bản quyền sản xuất G-CSF trong E coli của Amgen hết liệu lực từ 03/2006 đã... bạch cầu thì việc dùng các loại thuốc giúp tạo máu, tạo bạch cầu là điều cần thiết và cấp bách Một trong những protein trị liệu mang tính cách mạng hóa trong điều trị bệnh neutropenia và các bệnh nhiễm trùng có liên quan là dùng nhân tố kích thích dòng bạch cầu (Granulocyte- Colony Stimulating Factor, G -CSF) GCSF có chức năng kích thích nguyên bào tủy tái sinh, phát triển và biệt hóa theo hướng tạo bạch . I. THÔNG TIN CHUNG - Tên đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất Granulocyte Colony Stimulati Factor (G-CSF) ngƣời tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu hạt - Thời gian thực hiện:. HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP ĐỂ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GIẢM BẠCH CẦU HẠT KC.04.13/06-10 Chủ nhiệm đề tài. HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP ĐỂ HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GIẢM BẠCH CẦU HẠT KC.04.13/06-10 Cơ quan chủ trì