Trên cơ sở kết quả của chuyên mục “Nghiên cứu tổng hợp G-CSF bằng tế bào P. pastoris” đã biểu hiện thành công G-CSF ở dạng tiết ra môi trường từ chủng P. pastoris GS115/GCSF ở quy mô lắc tại phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành chuyên mục này nhằm khảo sát và xây dựng quá trình lên men,
52
cảm ứng biểu hiện của protein G-CSF từ chủng P. pastoris GS115/GCSF bằng hệ thống lên men tự động ở quy mô 1 lít.
Nội dung thực hiện gồm những bước sau:
Lên men, cảm ứng, biểu hiện G-CSF ở dạng tiết ra ngoài môi trường trên chủng Pichia pastoris GS115/GCSF bằng hệ thống lên men tự động ở quy mô 1 lít với môi trường BMGY, BSM và dung dịch khóang PTM1 đã được hấp khử trùng ở 1210
C, 20 phút. Quá trình lên men chủng P. pastoris
GS115/GCSFđược thực hiện theo sơ đồ sau:
Hệ thống lên men được cài đặt và chạy với các thông số: pH = 5,00; DO ≥ 30%; Nhiệt độ 280C; Tốc độ khuấy: 300 vòng/phút; Tốc độ sục khí: 1 vvm; Tốc độ khuấy và tốc độ sục khí được điều chỉnh tự động để đảm bảo giá trị DO luôn đạt trên 30%.
Sau thời gian lên men 19 giờ tiến hành feed môi trường lần 1 với tổng thể tích feed là 50ml, tốc độ feed là 10ml/giờ, và sau khi quá trình feed lần 1 kết thúc tiến hành feed lần 2 với tổng thể tích là 180 ml và tốc độ feed là 2,5ml/giờ.
Chủng P. pastoris GS115/GCSF
Hoạt hóa cấp 1 trong 5ml BMGY 250rpm, 30oC, 16-18 giờ
Hoạt hóa cấp 2 trong 100ml BMGY 250rpm, 30oC, 16-18 giờ
Lên men trong 700ml môi trƣờng với tỷ lệ nạp giống 1/10
53
Trong quá trình lên men, mẫu được thu nhận 4 giờ một lần để kiểm tra các thông số như: mật độ quang, lượng sinh khối khô, lượng protein biểu hiện...
- Kiểm tra protein G-CSF được biểu hiện bằng phương pháp điện di SDS- PAGE và Western Blot.
- Phân tích sự biểu hiện protein G-CSF bằng phần mềm Quantity One.
- Đo tổng lượng protein tiết ra môi trường bằng phương pháp Bradford.
Kết luận: Đã xây dựng thành công quy trình lên men biểu hiện protein G-CSF ở dạng tiết ra môi trường từ chủng P. pastoris GS115/GCSF ở quy mô 1 lít với các kết quả thu được như sau:
Hình 15. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện protein G-CSF của chủng P.
pastoris GS115/GCSF sau quá trình lên men bằng Western blot với kháng thể kháng G-CSF:A, Bản gel SDS-PAGE; B, Bản phim westen blot; 1, Thang phân tử lượng protein; 2, Dịch lên men ở 24 giờ; 3, Dịch lên men ở 48 giờ; 4, Dịch lên men ở 72 giờ; 5, Dịch lên men ở 96 giờ
Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ % G-CSF/ Protein tổng 0% 28,2% 28,9% 31,8%
54
Nồng độ protein tổng %G-CSF/ protein tổng [G-CSF]
343 mg/l 31,8% 109 mg/l