G-CSF tinh khiết (phụ lục 4.1)
Trên cơ sở của các kết quả đi trước, chúng tôi đã xác định, lựa chọn được một số thông số cho quá trình sản xuất G-CSF:
Sử dụng dòng tế bào tái tổ hợp có khả năng biểu hiện G-CSF dạng thể vùi trong tế bào chất.
Sử dụng phương pháp lên men mẻ bổ sung để lên men, cảm ứng, thu nhận G-CSF tái tổ hợp.
Sử dụng phương pháp tái gấp cuộn là phương pháp pha loãng.
Sử dụng phương pháp tinh chế là phương pháp tinh chế sắc ký trao đổi cation.
Dựa trên những kết quả đó, chúng tối tiến hành xác định, đề xuất quy trình công nghệ sản xuất G-CSF và dựa trên quy trình đó sản xuất thử nghiệm 500mg G-CSF tinh khiết.
76
Lên men cảm ứng biểu hiện G-CSF:
Phân tích kết quả sau lên men
Tiến hành phân tích kết quả biểu hiện protein G-CSF bằng điện di SDS- PAGE và lai Western Blot
Sử dụng phần mềm Quantity One để phân tích tỉ lệ protein G-CSF biểu hiện có trong tổng protein của tế bào.
77
Tái gấp cuộn G-CSF bằng phương pháp pha loãng trực tiếp
Tinh chế G-CSF sau tái gấp cuộn
Lắp và rửa cột, cân bằng cột bằng B, nạp mẫu, thu dung dịch F sau khi mẫu đi qua cột, rửa cột bằng dung dịch B, và dung ly mẫu bằng dung dịch E.
Dựa vào sự biến thiên của mức độ hấp thu UV280, thu nhận các đỉnh hấp thu để tiến hành phân tích.
Xác nhận sự hiện diện của G-CSF tại các phân đoạn phương pháp điện di SDS-PAGE và tiến hành nhuộm bạc xác định độ tinh sạch của protein G-CSF thu nhận được.
78
Kiểm tra, phân tích G-CSF thu nhận được
Kiểm tra cấu hình tự nhiên của G-CSF sau tinh chế bằng phương pháp Native-PAGE và sắc ký RP-HPLC, so sánh với protein G-CSF chuẩn.
Kiểm tra hoạt tính sinh học và xác định giá trị đơn vị hoạt tính của protein G-CSF bằng thử nghiệm in vitro trên tế bào M-NFS-60.
Kết luận:
- Xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất G-CSF.
- Sản xuất thử nghiệm thành công 500mg protein G-CSF có độ tinh khiết 95% và có hoạt tính sinh học tương đương sản phẩm cùng loại (kiểm tra thông qua thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào M-NFS-60).
Kết quả sản xuất thử nghiệm như sau:
Lượng thể vùi tươi thu được trong 55 lít lên men: 350g
Lượng G-CSF trong sinh khối tế bào của 55l lên men (tính theo Bradford và %G-CSF trong protein tổng): 75,9g
Lấy 3,5g thể vùi tươi tiến hành quy trình thu nhận G-CSF. Thu nhận các số liệu sau:
- Độ tinh sạch: xác định tương đối bằng diện di SDS-PAGE và phân tích bằng phần mềm Quantity One
- Lượng G-CSF có trong từng giai đoạn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trung
bình Sai số G-CSF trong 3,5g thể vùi tươi 694 702 698 687 674 691 11 G-CSF trong 2l dịch refolding 589 583 596 577 568 582,6 10,8
G-CSF sau tinh chế 2l dịch
refolding 82 87 79 90 77 83 5,4
79 Lượng G-CSF theo 3,5g thể vùi tươi (mg) Lượng G- CSF tổng quy mô 55l lên men (g) Độ tinh sạch (%) Hiệu suất thu hồi từng bước (%) Hiệu suất thu hồi toàn
quy trình (%) Sinh khối 759 75,90 20 100 100 Thể vùi 691 69,10 65 91,04 91,04 Tái gấp cuộn 582,6 58,26 70 84,31 76,76 Tinh chế 83 8,30 95 14,25 10,94
Ước tính chi phí trong quy trình sản xuất thu nhận G-CSF tái tổ hợp:
Chi phí lên men 50 lít:
Chất Lƣợng Đơn giá Thành tiền
Tryptone 28g 2.000.000đ/kg 56.000đ Cao nấm men 112g 1.500.000đ/kg 168.000đ Peptone 210g 800.000đ/kg 169.000đ Glucose 1800g 200.000đ/kg 360.000đ Glycerol 515ml 200.000đ/l 103.000đ Lactose 250g 500.000đ/kg 125.000đ Acid citric 55g 200.000đ/kg 11.000đ Thiamine 350g 10.000.000đ/kg 3.500.000đ NaCl 17g 100.000đ/kg 3.400đ Na2HPO4 187g 200.000đ/kg 37.400đ KH2PO4 179g 200.000đ/kg 35.800đ NH4Cl 142g 200.000đ/kg 28.400đ MgSO4 21g 200.000đ/kg 4.200đ Nước 120l 10.000đ/l 1.200.000đ
80
Điện 200kW 5.000đ/kw 1.000.000đ
Tổng 6.801.200đ
Tổng thể tích thu nhận được sau lên men 55 lít Chi phí cho 1 lít lên men: 123.658đ 125.000đ
Chi phí cho quá trình downstream của 1 lít dịch lên men:
Chất Lƣợng Đơn giá Thành tiền
Tris 194g 3.000.000đ/kg 582.000đ EDTA 2g 3.000.000đ/kg 6.000đ Urea 510g 400.000đ/kg 204.000đ Triton X100 2ml 4.000.000đ/l 8.000đ Sodium deoxycholate 2g 10.000.000đ/g 20.000đ NaCl 125g 400.000đ/kg 50.000đ NaOH 10g 800.000đ/kg 8.000đ HCl 50ml 800.000đ/kg 40.000đ Sucrose 500g 50.000đ/kg 25.000đ Cysteine 2,5g 15.000.000đ/kg 37.500đ Cystine 0,5g 15.000.000đ/kg 7.500đ NaOAc 12g 2.000.000đ/kg 24.000đ Nước 50l 10.000đ/l 500.000đ Điện 50kw 5.000đ/kw 250.000đ Tổng 1.762.000đ
81
Chi phí kiểm tra chất lƣợng trong quá trình sản xuất:
Phƣơng pháp Số mẫu Đơn giá Thành tiền
SDS-PAGE Native-PAGE 10 50.000đ 500.000đ Western blot 5 100.000đ 500.000đ RP-HPLC 10 100.000đ 1.000.000đ Thử tế bào 10 200.000đ 2.000.000đ Tổng 4.000.000đ
Chi phí thu nhận G-CSF từ 1 lít môi trường lên men: 125.000đ + 1.762.000đ + 4.000.000đ = 5.887.000đ
Khấu hao máy móc 20% 1.178.000đ
Tổng chi phí 7.065.000đ
Chi phí trung bình cho 1mg G-CSF (150mg/l): 47.100đ 2. Xác định đặc điểm cấu trúc (phụ lục 4.2)
Tính toàn vẹn cấu trúc đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính sinh học của G-CSF. Sự phá vỡ một trong hai hay cả hai cầu nối disulfide cản trở việc gấp cuộn và làm giảm đáng kể hoạt tính sinh học. Tương tự, các đột biến tạo ra các mất đoạn hay lặp lại các đoạn nhỏ trong cấu trúc protein nằm trong vùng acid amin 18 đến đầu C làm biến đổi căn bản cấu trúc bậc 4 đều làm mất hoạt tính protein. Việc loại bỏ vùng đầu C (từ acid amin 165 đến 174) cũng làm mất hoạt tính. Ngược lại, sự loại bỏ 11 acid amin đầu tiên không ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học và đột biến ở Cys-17 đã được chứng minh là làm tăng hoạt tính sinh học và làm ổn định cấu trúc protein.
Do tính toàn vẹn cấu trúc đóng vai trò rất quan trọng đối với hoạt tính sinh học của G-CSF, nên trong quy trình nghiên cứu sản xuất G-CSF dùng làm thuốc, một bước rất quan trọng cần xác định đó làm đảm bảo G-CSF được
82
tạo ra đúng là G-CSF với chính xác trình tự và khối lượng riêng để đảm bảo sự toàn vẹn về cấu trúc của phân tử G-CSF. Do vậy chúng tôi tiến hành xác định những đặc điểm cấu trúc của protein G-CSF: trình tự acid amin, khối lượng riêng.
Quá trình xác định đặc điểm G-CSF bao gồm các bước như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định trình tự acid amin đầu N, đầu C của protein G-CSF
Thủy phân protein trong gel bằng enzyme trypsin
Phân tách thành phần protein bằng sắc ký lỏng một chiều Ghi phổ LC-ESI-MS/MS
Phân tích phổ khối peptide bằng phần mềm Mascot với cơ sở dữ liệu NCBInr
Xác định khối lượng riêng của protein G-CSF
Phân tách thành phần protein bằng sắc ký lỏng một chiều Ghi phổ LC-MS
Tính toán khối lượng riêng bằng phần mềm Magtran
Kết luận:
- Xác định thành công trình tự acid amin đầu N, đầu C của protein G-CSF, kết quả hoàn toàn tương đồng so với trình tự lý thuyết.
- Xác định thành công khối lượng riêng của protein G-CSF là 18797,3 Da, chỉ sai lệch 0,009% so với tính toán lý thuyết.
83
Hình 19. Kết quả chạy MS-MS protein G-CSF
3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng G-CSF (phụ lục 4.3 – Sản phẩm 7)
Để quá trình nghiên cứu sản xuất G-CSF được tốt và được chuẩn hóa, dựa trên quá trình nghiên cứu sản xuất, dựa trên các sản phẩm trên thị trường và các tiêu chuẩn của Dược điển châu âu 2009, chúng tôi tiến hành xây dựng chất lượng cho sản phầm G-CSF.
Các tiêu chuẩn đề xuất có thể tóm tắt như sau:
Chỉ tiêu Yêu cầu
Chất lượng cảm quan Dạng bột,khô, màu trắng hoặc có màu trắng ngà
Trọng lượng phân tử 18799 Da
SDS-PAGE và Western Blot (sử dụng 2ug/ giếng)
Cho vạch tín hiệu tương ứng mẫu chuẩn, không có vạch tạp
Native-PAGE (sử dụng 2ug/giếng)
Cho vạch tín hiệu tương ứng mẫu chuẩn, không có vạch tạp
RP-HPLC (sử dụng G-CSF có nồng độ 0.3mg/ml)
Cho đỉnh hấp thu tương ứng mẫu chuẩn, không có các đỉnh hấp phục khác ngoài đỉnh hấp phụ chính
84
Trình tự Trình tự 5-10 acid amin đầu N đúng với trình tự chuẩn
Độ tinh sạch >= 95%
Hoạt tính sinh học 0,8 – 1,25 x 108 IU/mg protein
Chất lƣợng cảm quan
G-CSF ở dạng bột phải có những đặc tính sau: khô, xốp, màu trắng hoặc có màu trắng ngà. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khối lƣợng riêng
G-CSF tái tổ hợp sản xuất từ E. coli có tổng cộng 175 acid amin, có công thức hóa học là C845H1339N223O243S9 và có trọng lượng riêng là 18799 Dalton.
Chất lƣợng protein
Kiểm tra độ tinh sạch
G-CSF tái tổ hợp được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide trong phương pháp điện di SDS-PAGE nhuộm bạc, với các thông số sau:
- Gel polyacrilamide dày 1mm - Gel phân tách: 13% acrylamide
- Dung dịch protein kiểm định được nạp 2ug/giếng
Kết quả điện di cho duy nhất 1 vạch protein tương đương với vạch protein chuẩn.
Xác nhận protein bằng Western Blot
Có duy nhất 1 vạch tín hiệu với kháng thể kháng G-CSF
Kiểm tra cấu hình protein bằng Native –PAGE
85
Kiểm chứng độ tình sạch và cấu hình protein bằng RP-HPLC
Kết quả đạt yêu cầu khi G-CSF tái tổ hợp cho đỉnh hấp thu có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của protein G-CSF chuẩn trên sắc ký đồ RP-HPLC, không có vạch tạp.
Kiểm tra trình tự acid amin đầu N và đầu C
Trình tự protein G-CSF tái tổ hợp cũng được kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự acid amin. Kết quả đạt yêu cầu khi trình tự 5-10 acid amin đầu N và đầu C của G-CSF tái tổ hợp đúng với trình tự acid amin chuẩn.
Độ tinh sạch
Độ tinh sạch được xác định bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc. Độ tinh sạch của G-CSF đạt yêu cầu là trên 95%. Nghĩa là protein G-CSF chiếm trên 95% lượng protein có trong dung dịch.
Hoạt tính sinh học
G-CSF có hoạt tính kích thích sự hình thành bạch cầu hạt (granulocyte) trong môi trường chứa tế bào máu gốc và tăng cường khả năng kháng khuẩn của tế bào neutrophil. Do vậy, hoạt tính sinh học G-CSF tái tổ hợp có thể được xác định dựa trên khả năng kích thích sự tăng sinh dòng tế bào ung thư máu M-NFS-60.
G-CSF tái tổ hợp có hoạt tính đạt yêu cầu khi giá tri đơn vị hoạt tính (IU) đạt từ 80% đến 125% so với giá trị đơn vị hoạt tính của protein G-CSF chuẩn.
4. Đánh giá chất lƣợng G-CSF (phụ lục 4.4)
G-CSF là một loại thuốc dạng tiêm, sử dụng cho người, do vậy nó đòi hỏi các yêu cầu nghiêm ngặt về chất lượng. Trên cơ sở đã xây dựng thành công tiêu chuẩn chất lượng cho G-CSF, chúng tôi tiến hành đánh giá G-CSF tái tổ hợp mà chúng tôi sản xuất được theo các phương pháp, tiêu chuẩn đánh giá đã được nêu trên.
86
Quy trình đánh giá chất lượng G-CSF có thể tóm tắt như sau:
Xác định hoạt tính sinh học
Kiểm tra hoạt tính sinh học và xác định giá trị đơn vị hoạt tính của G- CSF tái tổ hợp bằng thử nghiệm sinh học in vitro trên dòng tế bào M-NFS-60.
Xác định cấu hình tự nhiên và độ tinh khiết
Xác định cấu hình tự nhiên của G-CSF tái tổ hợp bằng phương pháp điện di Native-PAGE và sắc ký RP-HPLC với đối chứng là G-CSF chuẩn.
Xác định độ tinh khiết của G-CSF bằng phương pháp điện di SDS- PAGE, nhuộm bạc phát hiện và phân tích độ tinh sạch bằng phẩn mềm Quantity One. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xác định dư lượng chí nhiệt tố
Xác định dư lượng các yếu tố làm tăng than nhiệt bằng thử nghiệm trên thỏ: kiểm tra sự thay đổi thân nhiệt của thỏ sau khi tiêm G-CSF tái tổ hợp, so sánh với đối chứng là G-CSF chuẩn.
Thử nghiệm tính an toàn trên chuột
Thử nghiệm độc tính bất thường: theo dõi số chuột sống và chết trong vòng 24-72 giờ sau khi tiêm G-CSF tái tổ hợp; theo dõi tình trạng sưng, nóng, bong da, hoại tử da và những phản ứng bất thường trên da tại vị trí tiêm thuốc trong vòng 14 ngày.
Thử nghiệm độc tính cấp: xác định liều LD0 và LD100 theo đường tiêm dưới da từ đó xác định giá trị LD50 càu mẫu G-CSF tái tổ hợp.
Sử dụng các đối chứng là G-CSF chuẩn.
Kết quả:
- Protein G-CSF tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao, tương đương G-CSF chuẩn.
87
- Protein G-CSF có cấu hình tự nhiên tương đồng với G-CSF chuẩn khi kiểm tra bằng điện di Native-PAGE và sắc ký RP-HPLC. Protein G-CSF có độ tinh sạch cao, đạt 95%.
- Protein G-CSF tái tổ hợp có tính an toàn cao, không chứa các yếu tố gây sốt khi thử nghiệm trên thỏ.
- Protein G-CSF có tính an toàn cao khi thử nghiệm độc tính bất thường và độc tính cấp trên chuột.
88
PHẦN III.
CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC
1. Danh mục sản phẩm khoa học công nghệ dạng I
Stt Tên sản phẩm Đăng ký Hoàn thành Chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật Ghi chú 1 G-CSF tái tổ hợp tương đương thương phẩm 500mg 500 mg Chất lượng tương đương G-CSF trong các chế phẩm trên thị trường Đạt 2 Chủng E. coli tổng hợp G-CSF 01 chủng 01 chủng
Biểu hiện G-CSF hơn
30% tổng protein Đạt 3 Chủng Pichia patoris tổng hợp và tiết G-CSF khỏi tế bào 01 chủng 01 chủng Biểu hiện 10mg/l dịch lên men Đạt
2. Danh mục sản phẩm khoa học công nghệ dạng II
Stt Tên sản phẩm Đăng ký Hoàn thành Chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật Ghi chú 1 Quy trình phân lập dòng E.coli tổng hợp G-CSF 03 quy trình 04 quy trình Rõ ràng, logic về các bước tiến hành, các thông số về quá trình cấu trúc vector tái tổ hợp, tạo dòng, biểu hiện gen, trình tự gen trên vector, kiểm tra protein tái tổ hợp
89
được biểu hiện 2 Quy trình phân lập dòng P. pastoris tổng hợp và tiết G- CSF vào môi trường 01 quy trình 01 quy trình Rõ ràng, logic về các bước tiến hành, các thông số về quá trình cấu trúc vector tái tổ hợp, tạo dòng, biểu hiện gen, trình tự gen trên vector, kiểm tra protein tái tổ hợp được biểu hiện
Đạt 3 Quy trình công nghệ sản xuất G- CSF tái tổ hợp 01 quy trình 01 quy trình Rõ ràng, logic về các bước tiến hành, các thông số về quá trình lên men biểu hiện gen, thu nhận protein tái tổ hợp, kiểm tra protein tái tổ hợp.
Đạt
4 Báo cáo kết quả phân tích hoạt tính G-CSF tái tổ hợp
01 01 Các thông số thực nghiệm kiểm tra hoạt tính G-CSF
Đạt
5 Báo cáo kết quả phân tích cấu trúc của G-CSF
02 02 Các thông số thực nghiệm kiểm tra cấu trúc G-CSF (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đạt
6 Tiêu chuẩn cơ sở G-CSF tái tổ hợp
01 01 Các tiêu chí đánh giá chất lượng G-CSF tái tổ hợp và phương
90
thức đánh giá
3. Sản phẩm khoa học và công nghệ dạng III và IV 3.1. Đào tạo sau đai học
STT Họ tên học
viên
Khoá Tên đề tài Điểm Ghi
chú
1 Liên Thuý Linh
14 Tạo dòng và biểu hiện protein G-CSF người bằng các hệ thống biểu hiện khác nhau trong E. coli
9,6 /10,0
2008
2 Trương Lê Na
14 Tạo dòng và biểu hiện protein G-CSF người trong các hệ thống biểu hiện ở Pichia patoris 9,8 /10,0 2008 3 Trần Thanh Hoà
17 Nghiên cứu thu nhận Granulocyte colony
stimulating factor (G-CSF) tái tổ hợp có hoạt tính từ thể vùi được biểu hiện trong