(phụ lục 1.4)
4.1. Nghiên cứu phân lập dòng mang gen mã hóa G-CSF* chứa trình tự tiết và 6xHis (phụ lục 1.4.1)
Cho đến nay, đã có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp nhờ E. coli được hoàn thiện và thương mại hóa với nhiều thuận lợi cho người sử dụng. Để dễ dàng cho việc tinh chế hay làm tăng tính tan của protein tái tổ hợp, các hệ thống biểu hiện thường được thiết kế thêm các đuôi polypeptide dung hợp với protein tái tổ hợp ở một hoặc cả hai đầu phân tử protein. Đuôi dung hợp gồm các phân tử protein có tác dụng tăng cường tính tan (polyhistidine, GST, MBP), giúp xác định vị trí protein tái tổ hợp trong tế bào chủ (NusA, DsbA, Trx). Ngoài ra, các phân tử protein này còn có ái lực với một số ligand nhất định trong các cột sắc ký ái lực chuyên biệt, giúp đơn giản hóa quá trình thu nhận và tinh chế protein dung hợp. Có nhiều hệ thống dung hợp protein được sử dụng tùy vào mục đích sản xuất và giá thành của sản phẩm.
Các nguyên vật liệu dùng trong quy trình thí nghiệm
- Plasmid pUC57 được chèn thêm trình tự chứa gen mã hóa protein G-CSF đồng khung với trình tự tiết endoxylanase, đuôi tinh chế polyHistidine, trình tự nhận biết của protease TEV, được gọi chung là g-csfmE và vị trí nhận biết của enzyme NdeI và XhoI
- Plasmid pET28b (Novagen, No. 69865) được sử dụng làm vector dòng hóa và biểu hiện.
- Protein G-CSF được biểu hiện dưới dạng dung hợp protein với thẻ tinh chế his và trình tự tiết
6xHis
Glu-X-X-Tyr-X-Gln/Ser
TEV protease
34
- Chủng Escherichia coli DH5α dùng để tạo dòng.
- Chủng Escherichia coli BL21(DE3) được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp.
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như sau
- Chuẩn bị gen g-csfmE : Tách chiết plasmid pUC57-GCSF bằng phương pháp SDS-kiềm và điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết trên gel agarose 1%, kiểm tra plasmid pUC57-GCSF bằng hai phản ứng cắt riêng biệt với enzyme cắt giới hạn lần lượt là NdeI – XhoI và BglI. Thu nhận gen g-csfmE từ plasmid pUC57-GCSF bằng enzyme cắt giới hạn NdeI và XhoI.
- Chuẩn bị plasmid pET28b: Tách chiết plasmid pET28b bằng phương pháp SDS-kiềm. Kiểm tra plasmid thu được bằng enzyme cắt giới hạn NdeI -
XhoI và BglI, plasmid pET28b sau khi tách chiết và kiểm tra sẽ được cắt bằng enzyme NdeI và XhoI tạo dạng mạch thẳng, đầu dính để nối với gen g-csfmE
- Dòng hoá gen g-csfmE vào plasmid pET28b: Thực hiện phản ứng nối plasmid pET28b với gen g-csfmEbằng enzyme T4 ligase, Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp.
- Sàng lọc thể biến nạp: trên môi trường có kháng sinh kanamycine và PCR khuẩn lạc
- Kiểm tra vector tái tổ hợp: bằng enzyme cắt giới hạn BglI và NdeI-XhoI,
sau đó giải trình tự geng-csfmE
Kết luận: Thiết kế thành công plasmid tái tổ hợp pET28b-GCSF mang gene G-CSF* chứa trình tự tiết 6xHis và dòng E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF mang gene.
4.2. Nghiên cứu phân lập dòng E. coli tổng hợp G-CSF 6xHis dạng tan trong chu chất (phụ lục 1.4.2)
E. coli là một trong những chủng chủ biểu hiện hữu hiệu nhiều protein tái tổ hợp. Tuy vậy, việc dùng E. coli làm chủng chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp cũng gặp nhiều trở ngại như các protein không tạo cầu nối disulfide
35
hoặc tạo cầu nối disulfide sai; tạo thể vùi khi có sự biểu hiện vượt mức; dễ bị thủy phân bởi các protease nội bào v.v. Để giải quyết những vấn đề trên, một số biện pháp đã được áp dụng như sử dụng các promoter mạnh, chặt chẽ kiểm soát mức độ biểu hiện protein; dùng các tín hiệu tiết giúp protein tiết từ tế bào chất ra chu chất, môi trường; hay đồng biểu hiện protein mục tiêu cùng các chaperon trợ giúp quá trình gấp cuộn protein v.v. Trong đó, protein tiết ra chu chất được quan tâm nhiều bởi nơi đây là môi trường oxi hóa thuận lợi cho protein mục tiêu hình thành nối disulfide.
Để tiết ra chu chất thì các protein tiết phải chưa có cấu trúc hoàn chỉnh trong tế bào chất. Những protein tiết có chứa một trình tự amino acid đặc biệt (khoảng 15-30 acid amin), gọi là peptide tín hiệu (signal peptide), được nhận diện bởi hệ thống protein vận chuyển màng. Đồng thời, sự hiện diện của tín hiệu tiết này giúp protein giữ cấu trúc sơ cấp trong suốt quá trình vận chuyển. Các trình tự mã hóa tín hiệu tiết đã được sử dụng để tiết protein vào chu chất
E. coli là các trình tự tín hiệu của endoxylanase, OmpA, OmpF, PhoA, SpA…
Quy trình thí nghiệm như sau
- Tạo dòng tế bào E. coli biểu hiện protein G-CSF trong chu chất: Vector pET28b-GCSF sau khi tách chiết bằng phương pháp SDS-kiềm được biến nạp vào tế E. coli BL21(DE3) bằng phương pháp hóa biến nạp. Sàng lọc thể biến nạp bằng môi trường chứa kanamycine và PCR khuẩn lạc.
- Kiểm tra sự biểu hiện protein G-CSF trong chu chất tế bào E. coli: hoạt hóa và cảm ứng biểu hiện G-CSF trong tế bào E. coli BL21(DE3) bằng IPTG, tách các phân đoạn protein bằng phương pháp sốc thẩm thấu bao gồm phân đoạn protein chu chất, phân đoạn protein tế bào chất, phân đoạn protein tổng số, kiểm tra và xác minh sự biểu hiện G-CSF trong chu chất bằng điện di SDS-PAGE và lai Western.
Kết luận: Tạo dòng thành công dòng E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF biểu hiện G-CSF ở dạng tan trong chu chất tế bào.
36
4.3. Nghiên cứu tổng hợp G-CSF đƣợc tiết vào trong chu chất (phụ lục 1.4.3)
Để tổng hợp dạng G-CSF tan trong chu chất, gen mã hóa G-CSF được dung hợp ở đầu 5' với một trình tự tiết để được vận chuyển qua màng tế bào chất vào trong chu chất (periplasm) của E. coli. Phức hợp gen này được tạo dòng trong vector biểu hiện pET. Khi được cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, G- CSF được sinh tổng hợp ở dạng protein trong chu chất của E. coli. Một vị trí nhận biết của TEV protease được chúng tôi chèn vào giữa 6xHis và G-CSF để giúp cắt bỏ 6xHis ra khỏi G-CSF ở các bước sau. Do đó, khi xử lý 6xHis- GCSF với TEV protease và qua một bước tinh chế với cột Ni-NTA (bắt protein có thẻ 6xHis), có thể thu nhận G-CSF tinh sạch.
Chu chất (periplasm) là không gian giữa màng trong và màng ngoài của vi khuẩn gram âm, là nơi chứa các protein tiết, các protein thuộc hệ thống vận chuyển màng và vận chuyển điện tử. Đây cũng là nơi diễn ra nhiều phản ứng sinh hóa trao đổi chất, tổng hợp peptidoglycan, chuỗi vận chuyển điện tử, tiêu hủy các chất độc đối với tế bào và hình thành cầu nối disulfide.
Các hiểu biết về cơ chế vận chuyển định vị của protein sau khi được tổng hợp trong tế bào vi khuẩn tạo cơ sở cho việc thiết lập các hệ thống biểu hiện protein trong chu chất của E. coli. Để tăng cường hiệu quả tạo cầu nối disulfide chính xác ở các protein được biểu hiện trong chu chất cần sử dụng họ protein Dsb. Họ protein này thực hiện vai trò tạo cầu nối disulfide thông qua hai cơ chế: Cơ chế oxi hóa giúp hình thành cầu nối disulfide giữa các vị trí cysteine trên phân tử protein vừa được tiết ra. Cơ chế đồng phân hóa: sửa chữa những cầu nối hình thành không chính xác.
DsbA xúc tác sự hình thành cầu nối disulfide, DsbB giúp chuyển DsbA từ dạng khử sang dạng oxi hóa; DsbD có vai trò giữ DsbC và DsbG ở dạng khử; DsbC, DsbG có vai trò sửa chữa các cầu nối disulfide hình thành không chính xác
37
Sau khi dòng hoá thành công vector tái tổ hợp pET28b-GCSF vào tế bào
E.coli BL21(DE3), chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu hiện protein G-CSF trong chu chất E. coli.
Nội dung thực hiện:
- Cảm ứng biểu hiện protein G-CSF của chủng tái tổ hợp E. coli
BL21(DE3)/pET28b-GCSF trong môi trường LB-kanamycine (40µg/ml) và IPTG 0,5Mm
- Thu nhận protein trong chu chất bằng phương pháp sốc thẩm thấu: sốc thẩm thấu là phương pháp tách các phân đoạn protein trong tế bào E. coli
(bao gồm phân đoạn protein chu chất, phân đoạn proten tế bào chất, phân đoạn protein tổng số) dựa vào đặc tính thấm chọn lọc của màng vi khuẩn.
- Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện G-CSF trong chu chất bằng điện di SDS-PAGE và lai Western blot.
Kết luận: Tổng hợp thành công protein G-CSF ở dạng tan trong chu chất tế bào E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF.
Hình 13. Kiểm chứng sự biểu hiện G-CSF trong chu chất của E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF. A. SDS-PAGE; B. Western blot bằng anti 6xHis- IgG. 1, E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF (+IPTG) chu chất; 2, E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF (+IPTG) tế bào chất; 3, E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF (-IPTG) chu chất; 4, E. coli BL21(DE3)/pET28b-
6xHis-GCSF (A) ) 6xHis- GCSF (B) 97 64 45 30 20.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
38
GCSF (-IPTG) tế bào chất; 5, E. coli BL21(DE3)/pET28b (+IPTG) chu chất; 6, E. coli BL21(DE3)/pET28b (+IPTG) tế bào chất; 7, E. coli BL21(DE3)/pET28b (-IPTG) chu chất; 8, E. coli BL21(DE3)/pET28b (-IPTG) tế bào chất; 9, Thang phân tử lượng thấp.