Nghiên cứu tạo dòng E.coli tổng hợp G-CSF dạng tan- 123docz.net

chất (Phụ lục 1.3)

3.1. Nghiên cứu phân lập dòng E. coli biểu hiện gen mã hóa FTNH (phụ lục 1.3.1)

Nhằm tránh bước làm tan protein thể vùi bằng tác chất biến tính mạnh, sau đó phải thực hiện bước tái gấp cuộn để thu được G-CSF có cấu hình tự nhiên có hoạt tính, một phương án khác để sản xuất G-CSF tái tổ hợp trong E. coli là tổng hợp G-CSF dạng tan trong tế bào chất hoặc dạng tan trong chu chất. Để tổng hợp dạng G-CSF tan trong tế bào chất, chúng tôi tạo G-CSF ở dạng dung hợp với ferritin chuỗi nặng của người (FTNH) dựa theo kết quả công bố của Ahn JY và cộng sự (2005). FTNH khi được sử dụng như một protein dung hợp đã được chứng minh là có tác dụng cải thiện tính tan của một số protein người biểu hiện trong E. coli.

Để thu nhận được G-CSF dạng này, trước hết, chúng tôi tiến hành thiết kế vector biểu hiện protein FTNH người tái tổ hợp trong E. coli. Vetor này được dùng để dòng hóa và biểu hiện gen gcsfmE.

Quy trình thí nghiệm như sau

- Thu nhận gen ftnh mã hoá cho protein FTNH bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid p22FTNH nhận từ phòng thí nghiệm của giáo sư Giorgio Biasiotto (Đại học Brescia, Italia).

- Thiết kế vector tái tổ hợp có mang gen ftnh từ plasmid pET28a (Novagen) được đặt tên là pFTH. pET là hệ thống biểu hiện mạnh trong E. coli. Gen mục tiêu được tạo dòng vào pET được đặt dưới sự kiểm soát bởi

6xHis

Glu-X-X-Tyr-X-Gln/Ser

TEV protease

promoter T7 và được phiên mã bởi T7 RNA polymerase được tạo ra bởi tế bào chủ. Plasmid pET28b có kích thước 5368bp bao gồm trình tự sao chép ori, f1 (+) origin, gen kháng kanamycine, trình tự promoter T7 lac được cảm ứng bằng IPTG, gen lacIq, vùng MCS.

- Biến nạp pFTH vào tế bào E. coli DH5 và chọn lọc các dòng dự tuyển. - Kiểm tra các dòng dự tuyển bằng các phương pháp PCR khuẩn lạc: các mồi được dùng PCR khuẩn lạc là cặp mồi FTH1-F và FTH1-R đặc hiệu cho gen ftnh mã hoá cho protein FTNH trên plasmid p22FTNH, enzyme cắt hạn chế NdeI và HindIII và PCR plasmid.

Kết luận: Phân lập thành công dòng tế bào E. coli DH5α có chứa pFTNH.

3.2. Nghiên cứu tạo dòng E. coli mang gen mã hóa protein dung hợp GCSF-FTNH (phụ lục 1.3.2)

FTNH khi được sử dụng như một protein dung hợp đã được chứng minh là có tác dụng cải thiện tính tan của một số protein người biểu hiện trong E. coli. Chúng tôi tạo cấu trúc phức hợp biểu hiện G-CSF dung hợp với FTNH, thẻ 6xHis và trình tự nhận biết của TEV protease. 6xHis giúp tinh chế protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực với cột Ni-NTA và trình tự nhận biết TEV được thiết kế để loại bỏ 6xHis cùng FTNH khỏi G-CSF.

Nội dung thực hiện

- Tổng hợp gen g-csfmE đã được biến đổi codon phù hợp với hệ thống biểu hiện trên E. coli gồm: Đầu 5’ của trình tự TEV là một trình tự mã hóa cho 6xHistidine

- Thu nhận gen g-csfmE mã hoá cho protein G-CSF bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid pUC57-GCSF (Phòng thí nghiệm CNSH Phân tử A, ĐH KHTN, Tp. HCM).

- Thiết kế vector tái tổ hợp có mang gen g-csfmE từ plasmid pFTH (Phòng thí nghiệm CNSH Phân tử A, ĐH KHTN, Tp. HCM) được đặt tên là pFHG.

- Biến nạp pFHG vào tế bào E. coli DH5 và chọn lọc các dòng dự tuyển. - Kiểm tra các dòng dự tuyển bằng các phương pháp PCR khuẩn lạc: các mồi được dùng là cặp mồi 5’-HindIII-GCSF và 3’-XhoI-GCSF đặc hiệu cho gen g-csfmE mã hoá cho protein G-CSF trên plasmid pFHG, enzyme cắt hạn

chế và PCR plasmid

Kết luận: Phân lập thành công dòng tế bào E. coli DH5α có chứa pFHG.

3.3. Nghiên cứu tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang gen mã hóa protein dung hợp GCSF-FTNH và tổng hợp FTNH-GCSF (phụ lục 1.3.3)

Dựa theo kết quả công bố của Ahn JY và cộng sự (2005). FTNH khi được sử dụng như một protein dung hợp đã được chứng minh là có tác dụng cải thiện tính tan của một số protein người biểu hiện trong E. coli. Do đó, chúng tôi tạo cấu trúc phức hợp biểu hiện G-CSF dung hợp với FTNH, thẻ 6xHis và trình tự nhận biết của TEV protease. 6xHis giúp tinh chế protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực với cột Ni-NTA và trình tự nhận biết TEV được thiết kế để loại bỏ 6xHis cùng FTNH khỏi G-CSF.

Đồng thời dòng hoá vector pFHG và plasmid pDnaK vào tế bào E. coli

BL21(DE3) nhằm tạo dòng tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein G-CSF ở dạng dung hợp với FTNH cùng với DnaK có tác dụng hỗ trợ tính tan của protein dung hợp.

Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như sau:

- Thu nhận vector tái tổ hợp pFHG từ chủng tái tổ hợp E. coli

DH5α/pFHG (đã phân lập được trước đó).

- Biến nạp vector tái tổ hợp pDnaK vào tế bào E. coli BL21(DE3) để tạo dòng tái tổ hợp có khả năng biểu hiện chaperone DnaK. Sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung ampicilline (100ug/ml).

- Biến nạp vector tái tổ hợp pFHG vào tế bào E. coli BL21(DE3)/pDnaK để tạo dòng tái tổ hợp có khả năng đồng biểu hiện protein dung hợp

FTNH-GCSF và chaperone DnaK. Sàng lọc dòng tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung ampicilline (100ug/ml).và kanamycine (40ug/ml).

- Kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu 5’-HindIII-GCSF và 3’-XhoI-GCSF cho gen g-csfmE mã hoá cho protein G-CSF trên plasmid pFHG.

Kết luận: Phân lập thành công dòng tế bào E. coli BL21(DE3) có chứa pDnaK và pFHG có thể biểu hiện FTNH-GCSF.

3.4. Nghiên cứu tổng hợp protein dung hợp FTNH-GCSF dạng tan trong tế bào chất (phụ lục 1.3.4)

Các chủng E. coli thường sử dụng là BL21 và K12 cùng các dẫn xuất của chúng. Ưu điểm hơn so với chủng K12, các chủng BL21 khiếm khuyết hai protease ompt và lon, nhờ vậy mà các protein đích giảm thiểu khả năng bị phân hủy. Ngoài ra các dẫn xuất khác của BL21 được thiết kế di truyền để có được những đặc tính mong muốn như chủng đột biến recA giúp tăng cường tính ổn định của plasmid mục tiêu (BLR Novagen), chủng đột biến trxB/gor

giúp tăng cường khả năng hình thành cầu nối disulfide (Novagen Origami và AD494), chủng đột biến lacY tạo khả năng biểu hiện protein ở các mức biểu hiện khác nhau (Novagen Tuner)…

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng chủ E. coli BL21(DE3). Chủng này có nguồn gốc từ BL21 nên có đặc điểm quan trọng là khiếm khuyết hai protease chính lon và ompt, nhờ vậy có thể tích lũy protein tái tổ hợp ở mức cao, giảm thiểu khả năng bị phân hủy. Ngoài ra, BL21(DE3) còn mang đoạn gen DE3 có nguồn gốc từ phage lamda. Đoạn gen này chứa gen T7 nằm ở vùng downstream của promoter lacUV5. Nhờ đó, chủng BL21(DE3) có khả năng tổng hợp T7 RNA polymerase khi có sự cảm ứng của IPTG. IPTG (Isopropyl-β-D-thio-galactoside) là phân tử có khả năng thay thế lactose trong sự điều hoà operon lac, do không phải là cơ chất của -galactosidase, nên

IPTG vẫn được duy trì trong quá trình điều hoà. Gen mục tiêu sẽ được thiết kế dưới sự kiểm soát của promoter T7 trên vector biểu hiện (hệ thống vector pET, Novagen) và được biểu hiện khi có sự tổng hợp của T7 RNA polymerase của tế bào chủ nhờ cảm ứng IPTG

Chúng tôi biến nạp đồng thời hai vector pFHG và plasmid pDnaK vào tế bào E. coli BL21(DE3) nhằm tạo dòng tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein G-CSF ở dạng dung hợp với FTNH cùng với DnaK có tác dụng hỗ trợ tính tan của protein dung hợp.

Sau khi dòng hoá thành công vector pFHG vào tế bào E. coli BL21(DE3) cùng với plasmid pDnaK, chúng tôi tiến hành khảo sát sự biểu hiện protein G- CSF ở dạng dung hợp với FTNH dưới sự hỗ trợ tan của chaperone DnaK trong tế bào chất E. coli.

Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như sau

- Thu nhận vector tái tổ hợp pFHG từ chủng tái tổ hợp E. coli DH5α/pFHG (đã phân lập được trước đó).

- Biến nạp vector tái tổ hợp pFHG vào tế bào E. coli BL21(DE3)/pDnaK để tạo dòng tái tổ hợp có khả năng đồng biểu hiện protein dung hợp FTNH- GCSF và chaperone DnaK. Sàng lọc dòng tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung ampicilline (100ug/ml) và kanamycine (40ug/ml).

- Kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu 5’-HindIII-GCSF và 3’-XhoI-GCSF cho gen g-csfmE mã hoá cho protein G-CSF trên plasmid

pFHG.

- Kiểm tra sự biểu hiện protein dung hợp FTNH-GCSF của chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG bằng điện di SDS-PAGE và lai Western blot với kháng thể sơ cấp là kháng thể đơn dòng đặc hiệu với G-CSF

có nguồn gốc từ chuột (R&D, Japan) và kháng thể thứ cấp là kháng thể kháng IgG chuột có đánh dấu Horseradish peroxidase (Piera, India).

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự biểu hiện của protein FTNH- GCSF với ba thông số là 25o

C, 30oC, 37oC.

Kết luận

Tổng hợp thành công protein dung hợp FTNH-GCSF ở dạng tan trong tế bào chất tế bào E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG với nhiệt độ tối ưu cho cảm ứng biểu hiện protein dung hợp FTNH-GCSF là 30o

C. FTNH-hG-CSF FTNH-hG-CSF 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 (A) (B) DnaK

Hình 12. Kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của FTNH-GCSF trong tế bào E. coli BL21(DE3)/pFHG bằng SDS-PAGE (A) và Western blot (B).

1, Thang phân tử lượng thấp; 2, E. coli BL21(DE3)/pFHG (+IPTG) pha tủa; 3, E. coli BL21(DE3)/pFHG (+IPTG) pha nổi; 4, E. coli BL21(DE3)/pFHG (+IPTG); 5, E. coli BL21(DE3)/pFHG (-IPTG); 6, E. coli BL21(DE3) (+IPTG); 7, E. coli BL21(DE3) (-IPTG).

Nghiên cứu tạo dòng E.coli tổng hợp G-CSF dạng tan trong tế bào chất