bào chất ( Phụ lục 1.2)
Với những ưu điểm dễ nuôi cấy, thời gian tăng trưởng nhanh, lượng protein tạo ra nhiều và dễ dàng xử lý để thu nhận protein mục tiêu làm giảm thiểu rất nhiều kinh phí sản xuất, E. coli đã thể hiện những tính năng vượt trội và là sự lựa chọn hàng đầu trong các nghiên cứu protein tái tổ hợp từ trước đến nay.
Nhiều protein ngoại lai khi được biểu hiện trong E. coli sẽ kết tủa thành thể vùi. Thể vùi được hình thành do tế bào E. coli không có chaperon thích hợp giúp protein gấp cuộn thành cấu hình tự nhiên tan. Một số ưu điểm của sản xuất protein tái tổ hợp ở dạng thể vùi như sau:
- Protein dạng thể vùi có thể được tích luỹ ở hàm lượng cao trong tế bào chất.
- Dễ tinh sạch khỏi các protein của tế bào.
- Không có hoạt tính sinh học nên thích hợp cho việc sản xuất các protein có độc tính đối với tế bào E. coli.
21
- Bền đối với hoạt tính protease trong E. coli.
Với những ưu điểm trên, hiện nay việc tạo dòng E. coli biểu hiện proetin dưới dạng thể vùi được xem như là một lựa chọn hàng đầu trong sản xuất protein tái tổ hợp.
Nhằm mục đích tạo protein tinh chế có thể dễ dàng tinh chế thông qua các thẻ gắn, chúng tạo G-CSF ở dạng dung hợp với histidine dựa trên sườn vector biểu hiện pET28. G-CSF khi được dung hợp với histine có thể được tinh chế thông qua các cột tinh chế có ái lực với histidine như cột NiTA. Do vậy, với chiến lược này rất có thể quá trình tinh chế thu nhận G-CSF sẽ thuận lợi hơn.
Tuy vậy, sau khi thu nhận được dung hợp protein GCSF-his, protein dung hợp này cần phải được xử lý cắt bỏ thẻ histidine. Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm trước đây cho thấy, quá trình này cũng sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận protein. Tùy từng loại protein, việc tinh chế sử dụng thẻ tinh chế hay không sử dụng thẻ tinh chế có thể cho hiệu quả khác nhau. Do đó, để có thể chọn được một hệ thống biểu hiện G-CSF cho phép thu nhận G- CSF hiệu suất tốt, chúng tôi tiến hành thiết kế song song cả hai hệ thống biểu hiện protein G-CSF dạng thể vùi trong E. coli có gắn đuôi histidine và không gắn thẻ tinh chế histidine
2.1. Tạo dòng E. coli tổng hợp G-CSF không mang thẻ tinh chế, dạng thể vùi trong tế bào chất (Phụ lục 1.2.1 – Sản phẩm 4.1)
Các vật liệu được dùng trong quy trình thí nghiệm gồm
- Plasmid pET-his được sử dụng làm vector dòng hóa và biểu hiện (thuộc bộ sưu tập vector của dự án tài nguyên sinh học quốc gia (NBRP), Viện di truyền quốc gia Nhật Bản cung cấp), pET-his dài 4636bp, có gen kháng ampicilline. Vùng MCS nằm giữa hai vùng T7 promoter và T7 terminater giúp tạo dòng các gen mục tiêu nằm dưới sự kiểm soát biểu hiện của T7 promoter.
22
Trên plasmid còn có điểm ori sao chép pBR322 giúp sao chép plasmid với số lượng lớn.
Hình 8. Cấu trúc plasmid pET-his
- Protein G-CSF được biểu hiện dưới dạng không dung hợp với thẻ tinh chế his:
- Chủng Escherichia coli DH5: [F-, 80lacZM15, recA1, endA1,
hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -
, thi-1, gyrA96, relA1].
- Chủng Escherichia coli BL21(DE3) {F- dcm ompT hsdSB(r-Bm-B) gal λ(DE3)), được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp.
- Mồi T7 promotor và T7 terminator
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như sau
- Thu nhận gen g-csfmE bằng phản ứng PCR với cặp mồi được thiết kế
thêm cặp enzyme cắt giới hạn NdeI và BamHI
- Plasmid pET-his sau khi tách chiết và kiểm tra được cắt bằng cặp enzyme cắt hạn chế NdeI và BamHI.
- Plasmid pET-his đã cắt mở vòng bằng NdeI và BamHI được nối với gen
g-csfmE được cắt bởi cùng enzyme. Các plasmid tái tổ hợp đặt tên là pET-
GCSF.
23 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hóa biến nạp pET-GCSF vào tế bào DH5α khả nạp - Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
- Thu nhận vector tái tổ hợp pET-GCSF từ dòng khuẩn lạc có PCR khuẩn lạc dương tính và kiểm tra sự hiện diện của gen g-csfmE bằng phản ứng cắt giới hạn và giải trình tự
- Tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-GCSF biểu hiện G-CSF không mang thẻ tinh chế dạng thể vùi trong tế bào chất: Plasmid tái tổ hợp mang gen g-csfmE có trình tự tương đồng 100% với trình tự chuẩn được biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) khả nạp.
- Sàng lọc thể biến nạp trên môi trường có kháng sinh ampicilline
- Cảm ứng biểu hiện G-CSF và kiểm chứng sự biểu hiện bằng lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng G-CSF
Kết luận
- Dòng hóa thành công gen g-csfmE vào plasmid biểu hiện pET-his tạo vector tái tổ hợp pET-GCSF.
- Tạo dòng thành công E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF biểu hiện G-CSF biểu hiện dạng thể vùi trong tế bào chất.
Hình 9. Chứng minh sự biểu hiện protein G-CSF không mang thẻ tinh chế bằng lai Western.
24
1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, E. coli BL21(DE3)/pET (-)IPTG. 3, E. coli BL21(DE3)/pET (+)IPTG; 4, E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF (-)IPTG; 5, E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF (+)IPTG; 6, E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF (+)IPTG (pha tan); 7, E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF (+)IPTG (Pha tủa).
2.2. Tạo dòng E. coli tổng hợp dung hợp protein GCSF-His dạng thể vùi trong tế bào chất (Phụ lục 1.2.2 – Sản phẩm 4.2)
Các vật liệu được dùng trong quy trình thí nghiệm gồm
- Plasmid pET28b (Novagen, No. 69865) là hệ thống biểu hiện mạnh trong
E. coli, có kích thước 5369bp bao gồm trình tự sao chép ori, f1 (+) origin, gen kháng kanamycine, trình tự promoter T7 lac được cảm ứng bằng IPTG, gen
lacIq, vùng MCS. Gen mục tiêu được tạo dòng đặt dưới sự kiểm sóat bởi promoter T7 và được phiên mã bởi T7 RNA polymerase được tạo ra bởi tế bào chủ.
- Protein G-CSF được biểu hiện dưới dạng dung hợp protein với thẻ tinh chế his:
- Chủng Escherichia coli DH5: [F-, 80lacZM15, recA1, endA1,
hsdR17(rk -
, mk +
), phoA, supE44, -
, thi-1, gyrA96, relA1].
- Chủng Escherichia coli BL21(DE3) {F- dcm ompT hsdSB(r-Bm-B) gal λ(DE3)), được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp.
- Mồi T7 promotor và T7 terminator
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như sau:
- Thu nhận gen g-csfmE từ plasmid pUC57-GCSF bằng phản ứng cắt bằng cặp enzyme cắt giới hạn NdeI và XhoI
- Plasmid pET28b sau khi tách chiết và kiểm tra được cắt bằng cặp enzyme cắt hạn chế NdeI và XhoI.
TEV
25
- Plasmid pET28b đã cắt mở vòng bằng NdeI và XhoI được nối với gen g- csfmE được cắt bởi cùng enzyme. Các plasmid tái tổ hợp đặt tên là pEGf. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hóa biến nạp pEGf vào tế bào DH5α khả nạp - Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
- Thu nhận vector tái tổ hợp pEGf từ dòng khuẩn lạc có PCR khuẩn lạc dương tính và kiểm tra sự hiện diện của gen g-csfmE bằng phản ứng cắt giới
hạn và giải trình tự
- Tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pEGf biểu hiện G- CSF trong tế bào chất: Plasmid tái tổ hợp mang gen g-csfmE có trình tự tương
đồng 100% với trình tự chuẩn được biến nạp vào tế bào E. coli BL21(DE3) khả nạp.
- Sàng lọc thể biến nạp trên môi trường có kháng sinh ampicilline
- Cảm ứng biểu hiện dung hợp GCSF-His và kiểm chứng sự biểu hiện bằng lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng histidine và kháng thể kháng G-CSF
Kết luận
- Dòng hóa thành công gen g-csfmE vào plasmid biểu hiện pET28b tạo vector tái tổ hợp pEGf.
- Tạo dòng thành công E. coli BL21(DE3)/pEGf biểu hiện G-CSF biểu hiện trong tế bào chất.
26
Hình 10. Kiểm tra sự biểu hiện của GCSF-His dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli BL21(DE3)/pEGf bằng điện di SDS-PAGE. 1, thang phân tử lượng thấp; 2, E. coli BL21(DE3)/pET28b (-IPTG); 3, E. coli BL21(DE3)/pET28b (+IPTG); 4, E. coli BL21(DE3)/pEGf (-IPTG); 5, E. coli BL21(DE3)/pEGf (+IPTG); 6, dòng E. coli BL21(DE3)/pEGf (+IPTG) phân đoạn cặn; 7, E. coli BL21(DE3)/pEGf (+IPTG) ) dịch nổi
Hình 11. Kiểm chứng 6xHis-TEV-GCSF bằng Western blot. A, kháng thể kháng His; B, kháng thể kháng G-CSF 1 2 3 4 5 6 7 97 64 45 20,1 14,4 30 6xHis-GCSF 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 6xHis-G-CSF 6xHis-G-CSF A B
27