chất E. coli (phụ lục 3.1)
Trong các chiến lược sản xuất protein tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện vượt mức trong Escherichia coli là hệ thống có nhiều ưu thế. Tuy nhiên, việc biểu hiện ở mức cao các protein tái tổ hợp trong E. coli lại dẫn đến sự hình thành thể vùi. Những thể vùi này không có hoạt tính sinh học, vì vậy cần phải hòa tan và tiến hành tái gấp cuộn để thu được protein với đầy đủ chức năng sinh học. Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm ra các điều kiện tái gấp cuộn protein từ dạng thể vùi giữ vai trò then chốt trong toàn bộ quá trình sản xuất, thu nhận protein tái tổ hợp dạng thể vùi từ E. coli.
Tái gấp cuộn là quá trình chuyển đổi protein từ trạng thái không gấp cuộn thành trạng thái gấp cuộn đúng. Quá trình này diễn ra do những tương tác nội phân tử để hình thành các cầu nối disulfide. Khi những điều kiện tái gấp cuộn đã được thiết lập, ngoài cấu hình đúng của protein mục tiêu, sự tái gấp cuộn còn tạo thành nhiều cấu hình khác nhau gây nên sự kết tụ. Đồng thời sự tái
64
gấp cuộn còn cần được hỗ trợ thêm bởi các tác nhân hỗ trợ, chủ yếu là tác nhân vật lý: nhiệt độ và áp suất, tác nhân hóa học: Urea hoặc guanidine HCl thường được thêm vào trong dung môi tái gấp cuộn ở nồng độ đủ thấp để gấp cuộn hiệu quả, đủ cao để duy trì tính tan và sự linh động của các cấu trúc trung gian.
Do vậy chúng tôi tiên hành khảo sát quy trình thu nhận G-CSF từ dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli được thực hiện bằng phương pháp tái gấp cuộn sử dụng nguyên tắc pha loãng nhằm thu nhận G-CSF có hoạt tính sinh học.
Các bước đã thiết lập trong quy trình có thể được tóm tắt như sau:
Xử lý, hòa tan thể vùi G-CSF
Thu nhận sinh khối tế bào từ dịch lên men. Hòa sinh khối tế bào trong dung dịch phá màng theo tỉ lệ 1/10 (w/v). Phá màng tế bào bằng máy hệ thống máy phá tế bào. Sau đó ly tâm ở 4°C để thu phần tủa. Phần tủa thu được là thể vùi protein G-CSF.
Rửa thể vùi G-CSF lần lượt bằng ba loại dung dịch rửa, thu được thể vùi sạch.
Hòa tan thể vùi bằng dung dịch hòa tan.
Kiểm tra sự biểu hiện G-CSF bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot, cuối cùng là kiểm tra sự tinh sạch protein bằng phần mềm Quantity One.
Tái gấp cuộn thể vùi G-CSF đã hòa tan bằng phương pháp pha loãng,
65
Đánh giá và phân tích protein G-CSF sau quá trình tái gấp cuộn
- Xác định nồng độ và hiệu suất thu hồi protein sau quá trình tái gấp cuộn bằng phương pháp Bradford.
- Kiểm tra cấu hình tự nhiên của protein G-CSF bằng phương pháp điện di Native-PAGE, so sánh với protein G-CSF chuẩn.
- Kiểm tra hoạt tính sinh học của G-CSF bằng thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào M-NFS-60.
Kết luận: Đã thu nhận thành công protein G-CSF có hoạt tính sinh học từ dạng thể vùi trong tế bào chất của E. coli với hiệu suất thu hồi protein đạt
55,65%.
Sinh khối khô (g/L) 9,22 ± 0,45
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G-
CSF của 1L dịch lên men (g) 3,655 ± 0,18
Nồng độ mẫu sau quá trình tái gấp cuộn (μg/ml) 66,08 ± 5,60 Tổng lượng proteinsau quá trình tái gấp cuộn đối với
1L dịch lên men (mg) ~ 261 ± 5,14
Thu dung dịch trong màng.
Ly tâm ở 4°C, thu phần dịch nổi. Bảo quản ở 4°C.
Nạp thể vùi đã hòa tan vào dung dịch tái gấp cuộn, nồng độ cuối đạt 100– 150μg/ml.
Giữ lạnh 4°C, 18 giờ.
Chỉnh hỗn hợp dung dịch về pH4.
66
2. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dạng tan trong tế bào chất
E. coli (phụ lục 3.2)
Ferritin đóng vai trò trung tâm trong việc dự trữ và duy trì sự cân bằng nội bào của ion sắt cho sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết sinh vật, trong đó có con người. Ngoài ra, các chức năng của ferritin cho thấy đây là một protein bảo vệ tế bào chất nhờ khả năng ngăn cản sự hình thành các gốc oxygen tự do bằng cách cô lập Fe nội bào. Gần đây, Ahn JY và cộng sự (2005) đã phát hiện ra rằng ferritin chuỗi nặng của người (FTNH) khi được sử dụng như một protein dung hợp có tác dụng cải thiện tính tan của một số protein người biểu hiện trong E. coli. Các protein mục tiêu dung hợp với FTNH có hai đặc tính quan trọng là: (i) có tương tác ái lực cao và liên kết không cộng hóa trị với DnaK và (ii) FTNH có thể tự lắp ghép với nhau tạo ra một không gian gấp cuộn (folding chamber) cách ly protein mục tiêu với môi trường tế bào chất của E. coli giúp protein mục tiêu gấp cuộn tốt dưới sự hỗ trợ của DnaK.
Trên cơ sở đó dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện protein dung hợp FTNH-GCSF dạng tan trong tế bào chất đã được cấu trúc và tiến hành lên men thành công. Nhằm thu nhận lượng lớn protein FTNH-GCSF tan trong tế bào chất, chúng tôi sử dụng máy tạo dịch đồng nhất tế bào kết hợp với ly tâm sau đó để xử lý dịch lên men chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG ở quy mô 1 lít.
Các bước trong quy trình có thể được tóm tắt như sau:
Xử lý thu nhận pha tan của tế bào chất của dòng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG
Lên men dòng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG.
Phá màng tế bào bằng máy hệ thống máy phá tế bào. Sau đó ly tâm ở 4°C để thu phần dịch nổi. Phần dịch nổi thu được là pha tan của tế bào E. coli
67
Đánh giá và phân tích sự biểu hiện của protein FTNH-GCSF trong pha tan của tế bào chất
Tiến hành phân tích kết quả biểu hiện protein FTNH-GCSF bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot.
Xác định lượng protein tổng trong pha tan bằng phương pháp Bradford. Sử dụng phần mềm Quantity One để phân tích tỉ lệ protein mục tiêu có trong mẫu.
Kết luận: Thu nhận thành công protein FTNH-GCSF từ dạng tan trong tế bào chất của chủng E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG với các thông số như sau:
Sinh khối khô (g/L) (X) 3,55 ± 0,12
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G- CSF của 1L dịch lên men (g) (Y)
0,875 ± 0,04
% G-CSF trên protein tổng (Z) 33,1 ± 0,37
Lượng G-CSF (g/L) (T) 0,289 ± 0,01
Hiệu quả thu nhận G-CSF (%) 8,17 ± 0,68